Name: Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie der mikrofluidische Evolution Accelerator Krebsdynamiken in Echtzeit auf Einzelzellebene untersucht. Diese Technologie ermöglicht präklinische Arzneimittelentwicklung mit physiologisch relevanten Modellen.

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Diese Arbeit wurde von NSF PHY-1659940 unterstützt.

1. Herstellung von mikrofluidischen Geräten
<ol><li>Generieren Sie das gewünschte mikrofluidische Muster mit einer Layout-Design-Software (siehe Ergänzende Materialien).</li>
	<li>Fertigen Sie die Fotomaske. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.<ol>
<li>Mit einem Laser-Schreiber, schreiben Sie das Muster auf eine Soda-Kalk-Glasplatte mit 100 nm Cr und 500 nm Photoresist AZ1518 beschichtet.</li>
		<li>Entwickeln Sie den photoresist mit Entwickler AZ300MIF für 60 s.</li>
		<li>Das Chrom ohne Schutz vor dem Photoresist mit Cr-7 Chromium Etchant abzweige.</li>
		<li>Rest-Photoresist mit einem photoresist bei 70 °C für 45 min abstreifen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mustern Sie den Photoresist. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.<ol>
<li>SpinCoat HMDS auf Siliziumwafer bei 4000 U/min für 40 s.</li>
		<li>Spin Mantel Photoresist AZ4330 auf Silizium-Wafer bei 4000 U/min für 40 s.</li>
		<li>Den Siliziumwafer bei 95 °C für 60 s weich backen.</li>
		<li>Verwenden Sie den Maskenaligner, um UV dem Siliziumwafer auszusetzen.</li>
		<li>Entwickeln Sie den photoresist mit Entwickler AZ300MIF für 4 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie DRIE-Ätzen durch. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.<ol>
<li>Trocknen Sie den mit dem Photoresist gemusterten Wafer mit einem Silicon Deep Reactive Ion Etching (DRIE) System für eine Tiefe von 100 m.</li>
		<li>Entfernen Sie den Photoresist mit Aceton und Plasmaätz mit einem Plasma-Etcher.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waferoxidation und Silanisierung. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.<ol>
<li>Thermische Oxidation auf dem geätzten Siliziumwafer in einem Ofen bei 1100 °C für 1 h durchführen.</li>
		<li>Warten Sie, bis der Siliziumwafer abgekühlt ist, und legen Sie den Wafer dann in einen Trockenbau mit ein paar Tropfen Trichlor-1H,1H,2H-2H-Perfluoroctyl-Silan (PFOTS), der in einem kleinen Behälter in der Nähe des Wafers tropft.</li>
		<li>Pumpen Sie den Druck des Trockenators auf 0,5 atm bei Raumtemperatur für 60 min. Die Siliziumwaferform sollte nach der richtigen Silanisierung hydrophob werden, die durch Zugabe mehrerer Wassertröpfchen auf den Wafer getestet werden kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Weiche Lithographie. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.<ol>
<li>Vorpolymer und Verkreuzer (aus Polymethylsiloxan (PDMS)-Kit) mit einem Gewichtsverhältnis von 10:1 mischen.</li>
		<li>Gießen Sie das gemischte PDMS, um eine 10 mm-Folie in der Höhe auf die silanisierte Siliziumwaferform zu erzeugen.</li>
		<li>Entgasen Sie das resultierende PDMS-Silizium-Wafersystem in einem Trockenmittel für 30 min bis 1 h.</li>
		<li>Inkubieren Sie den PDMS-Silizium-Wafer über Nacht in einem 70 °C-Inkubator, um das PDMS auszuhärten.</li>
		<li>Sobald das PDMS ausgehärtet ist, schälen Sie den PDMS-Film vorsichtig vom Siliziumwafer ab.</li>
		<li>Mit Biopsienadeln durchstanzen Sie Durchbohrungen an den Einlassöffnungen basierend auf der Position des Musters auf dem PDMS und schneiden Sie mit einem kreisförmigen Stempel Späne mit einem Durchmesser von 27 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS-Schichtbindung.<ol>
<li>Wärmehärten Sie zwei Stapel von 27 mm PDMS-Zylindern (ohne Muster), die zur Reservoirschicht und zur Verschlussschicht des Geräts werden.</li>
		<li>Schneiden Sie zwei 7 mm Kreise um die Einlässe auf der Reservoirschicht aus und verwenden Sie eine Biopsienadel, um Durchbohrungen an den Einlassöffnungen auf der Verschlussschicht zu stanzen.</li>
		<li>Verkleben Sie drei Stapel PDMS (gemusterter Stapel, Reservoirschicht, Verschlussschicht) mit Sauerstoffplasmabehandlung.</li>
		<li>Mit der Biopsienadel durchstanzen Löcher an den Auslässen und am Mittelanschluss des Gerätes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Medien- und Zelllinienvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie Medien für die Kultivierung von PC3-Zelllinien vor, einschließlich PC3-EMT und PC3-EPI: Mischen Sie RPMI 1640 medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1x Antimykotik. Generieren Sie Zelllinien wie zuvorbeschrieben 14. HINWEIS: PC3-Zelllinien werden in den obigen Medien in befeuchteten Inkubatoren bei 37 °C mit 5%CO2gehalten. Teilen Sie Zellen und Subkultur alle 3 Tage, bevor sie 100% Konfluenz erreichen.</li>
	<li>Transfekte Zelllinien mit zytoplasmatisch-markierten Fluoreszenzmarkern zur besseren Visualisierung, wie zuvorbeschrieben 12, so dass PC3-EMT zytoplasmatisches GFP ausdrückt und PC3-EPI zytoplasmatischem mCherry ausdrückt. Beachten Sie, dass die Technologie auch mit allen fluoreszierend gekennzeichneten Zellen sowie mit hellfeldgeographierten Zellen kompatibel ist.</li>
</ol>3. Versuchsaufbau
<ol><li>Herstellung von Metallplattenhalter<ol>
<li>Fertigen Sie einen Plattenhalter, der ausreicht, um gleichzeitig gasdurchlässige Kulturgerichte für parallele Experimente durch Bearbeitung oder 3D-Druck zu halten. Die 3D-CAD-Datei ("3-Well-Platte. FCStd") finden Sie auf GitHub als Referenz (https://github.com/kechihl/3-well-plate).</li>
		<li>Lösen Sie die Komponenten des Halters(Abbildung 2) mit einem Schraubendreher. Desinfizieren Sie die Komponenten über UV-Belastung für mindestens 1 h und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung. HINWEIS: Der Halter ist so konzipiert, dass er wesentliche Bedingungen für das thermische Gleichgewicht und ideale Gaszusammensetzungen bietet, mit Gaskanaleinlässe, die einen Luftstrom ermöglichen. Weitere Informationen finden Sie in unserer vorherigen Arbeit12.</li>
		<li>Bereiten Sie bis zu drei gasdurchlässige Kulturgerichte zu, von denen die Zellkulturmembran relativ flexibel ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Zelllinien-Seeding<ol>
<li>24 Stunden vor Beginn des Experiments PC3-EPI und PC3-EMT-Zellen durch Trypsinisierung für 5 min ernten. Vorwarme Kulturmedien hinzufügen, dann bei 150 x g für 3 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen jedes PC3-EPI und PC3-EMT mit einem Hämozytometer und isolieren Sie insgesamt 2,5 x 104 jedes Zelltyps für jede gasdurchlässige Kulturschale.</li>
		<li>Mischen und suspendieren Sie die beiden Zelltypen in 2 ml Kulturmedien und säen Sie die Zellen in jede der gasdurchlässigen Kulturschale.</li>
		<li>Lassen Sie den gesamten Plattenhalter über Nacht im Inkubator, damit sich die Zellen anbringen können.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die PDMS-Geräte über UV-Belastung für mindestens 1 h und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung.</li>
	</ol></li>
	<li>Einrichten von Wärmeleiteinheit und Gasversorgungssystem<ol>
<li>Wie in Abbildung 3dargestellt, richten Sie ein Gasversorgungssystem ein, das sowohl aus CO2- als aucho2-Steuergeräten, einer Gaspumpe, einer Gasmischkammer, einem Luftbefeuchter oder Blasen sowie drei separaten Sätzen von Gasventilen und Manometern besteht. Weitere Informationen finden Sie in unserer vorherigen Arbeit12.</li>
		<li>Richten Sie die CO2- und O2-Steuergeräte so ein, dass sie die Mischrate des Gases ausCO2- undN2-Tanks und der O2-Quelle anpassen. Alternativ würde jedes Gasversorgungssystem, das Gas unter Normoxia-Zustand liefert, funktionieren.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Gas, das in der Mischkammer kombiniert und durch einen Blasen so befeuchtet wird, dass die relative Luftfeuchtigkeit um bis zu 85 % erhöht wird (wie aus einem relativen Feuchtigkeitsmonitor ausgelesen) erhöht wird und dass das Gas zu drei unabhängigen Gasventilen mit Manometern führt, um Gasdurchfluss im Plattenhalter zu steuern und zu überwachen.</li>
		<li>Legen Sie den gesamten Plattenhalter in eine inkubationsthermische Steuerung auf der Bühne mit separaten Heizuntereinheiten für den Deckel und die Bodenplatte, wobei alle Einheiten auf 37 °C eingestellt sind. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.</li>
	</ol></li>
	<li>Installation von mikrofluidischen Geräten. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.<ol>
<li>Identifizieren Sie, dass die detaillierten Komponenten des 3-Well-Plattenhalters in Ordnung sind, wie in Abbildung 2. Jeder der drei Brunnen ist identisch und unabhängig, mit einem Paar Gaskanäle für jeden Brunnen. Jeder Brunnen verfügt über einen gasdurchlässigen Kulturschalenhalter, einen PDMS-Chiphalter, einen Glasfensterhalter und ein Paar 35-mm-Glasfenster. Diese Komponenten können mit den montierten Schrauben montiert werden. HINWEIS: Die Glasfenster sorgen dafür, dass sich zwischen der gasdurchlässigen Kulturmembran und dem Brunnen ein thermisch isolierter Raum befindet, so dass aufgrund von Temperaturunterschieden an der Schnittstelle keine Wasserkondensation auftritt. Beachten Sie, dass die 3 Brunnen unabhängig sind und 3 Experimente separat durchgeführt werden können.</li>
		<li>Vorwarme Kulturmedium bei 37 °C und Entgasen in einer Vakuumkammer für 20 min.</li>
		<li>Behandeln Sie die PDMS-Chips mit einem Sauerstoffplasmasystem für 30 s, um die Hydrophilie aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Richten Sie das Spritzensystem ein. Laden Sie zwei Spritzen langsam mit Wachstumsmedien und zwei weitere Spritzen mit gewünschtem Reagenz von Interesse (Medien, Medien mit Medikament, etc.). Verbinden Sie jede einzelne Spritze mit einem 50 cm Schlauch (0,020" x 0,060"OD) durch eine 23 G Dosiernadel in einem Hohlstahlstift. Setzen Sie einen hohlen Stahlstift in das andere Ende des Schlauches ein.</li>
		<li>Prime die Schläuche und stecken Sie den Stahlstift in jeden PDMS-Chip durch die Verschlussschicht. Füllen Sie die Reservoirschicht auf und befeuchten Sie das PDMS-Musterschichtmuster mit Medien. Die Reservoirschicht funktioniert als Auf-Chip-Blasenfalle, um zu verhindern, dass Luftblasen in das mikrofluidische Muster gelangen.</li>
		<li>Legen Sie eine 1 ml Spritze mit Kulturmedien ein. Schließen Sie die Spritze mit einem 5 cm Schlauch (0,020" x 0,060"OD) durch eine 23 G Dosiernadel in einen Hohlstahlstift ein. Legen Sie einen hohlen Stahlstift in das andere Ende des Schlauches und grundieren Sie die Schläuche.</li>
		<li>Setzen Sie den Hohlstahlstift in das mittlere Loch des Chips ein, wo später während des Spanabdichtungsprozesses übermäßige Medien aus dem Chip herausgezogen werden können.</li>
		<li>Da jedes PDMS-Gerät vier 10 ml Spritzen benötigt, die auf eine Spritzenpumpe geladen werden, laden Sie zwei 10 ml Spritzen pro Chip in das Vorderdeck. Legen Sie die beiden anderen Spritzen in das Entnahmedeck des Spritzensystems.</li>
		<li>Legen Sie den Chip direkt auf die gasdurchlässigen Kulturmembranen (mit Zellen, die bereits an den Membranen haften). Um mikrofluidische Mikroblasen nicht in das mikrofluidische Muster einzuschließen, geben Sie vor der Montage 1 ml vorgewärmte und entgaste Medien in die 35 mm gasdurchlässige Kulturschale aus und stellen Sie dann sicher, dass sich der Chip der flüssigen Oberfläche mit einem Neigungswinkel von 15 Grad nähert.</li>
		<li>Klemmen Sie die gasdurchlässige Kulturschale und den Brunnen im gasdurchlässigen Kulturschalenhalter für jeden Chip, wobei der PDMS-Chiphalter das PDMS-Gerät nach unten drückt.</li>
		<li>Kleben Sie eine Dichtungsplatte auf die Oberseite des PDMS-Geräts und klemmen Sie mit dem PDMS-Chiphalter, um ein Austrocknen des Chips zu verhindern.</li>
		<li>Legen Sie die Mediendurchflussrate um das Array auf 20 l/h fest.</li>
		<li>Stellen Sie die gesamte Platte im Inkubator auf der motorisierten Bühne eines invertierten Mikroskops ein. Schließen Sie das Gasversorgungssystem an die Gaskanäle an und drücken Sie die gasdurchlässige Kulturmembran mit dem installierten PDMS-Chip, um die Abdichtung des Geräts zu gewährleisten. Halten Sie den Messdruck bei 0,2 psi (1,4 x 104 Pa).</li>
		<li>Extrahieren Sie langsam übermäßige Medien im Chip mit der 1-ml-Spritze aus dem mittleren Loch. Beobachten Sie den Chip unter dem Mikroskop beim Extrahieren von Medien und beenden Sie dann das Extrahieren, wenn der Chip versiegelt ist. Die Spanversiegelung sollte selbstverständlich sein, da ein Teil der Zellen von den Mikrostrukturen zerkleinert würde.</li>
		<li>Schließen Sie die Temperaturerfassungseinheit des On-Stage-Inkubators an die 3-Well-Platte an und stellen Sie sie auf 37 °C ein.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Einzelzellige Zeitraffer-Bildgebung
<ol><li>Einrichten einer Bildgebungssoftware mit einem invertierten Mikroskop zur Zeitraffer-Bildaufnahme. Beachten Sie, dass für ein EA-Experiment ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit vollmotorisierter x-y-Stufe, Fokusknopf, Verschluss und Filterwürfel erforderlich ist.</li>
	<li>Konfigurieren Sie Software, um Bilder über zwei Kanäle mit 10-facher Vergrößerung für jeden Chip mit automatischer Bildnahtung nach einer Runde Autofokus zu erfassen. Beachten Sie, dass automatische Korrektursysteme wie Perfect Focus keine befriedigende Bildqualität garantieren. Es wird eher empfohlen, eine angepasste Fokusoberfläche für die langfristige Bildaufnahme zu generieren, die entweder auf Autofokus oder manuellen Fokus auf dem Chip basiert.</li>
	<li>Nehmen Sie stündlich Bilder auf und lassen Sie das Experiment auf der Zeitskala von Wochen laufen. Überwachen Sie die Bildqualität täglich und aktualisieren Sie bei Bedarf die Fokusfläche.</li>
	<li>Bereiten Sie den PDMS-Chip und die gasdurchlässige Kulturschale für die nachfolgende Immunfluoreszenzanalyse vor, wie zuvorbeschrieben 13.</li>
</ol>5. Bildverarbeitung und -analyse
<ol><li>Nachexperimentelle Verarbeitung<ol>
<li>Konvertieren Sie Bilder in das TIFF-Format für die Bildverarbeitung und Messungen unter Verwendung von Fidschi/ImageJ.</li>
		<li>Komprimieren Sie TIFF-Dateien, um die weitere Bildverarbeitung zu vereinfachen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fidschi/ImageJ-Analyse<ol>
<li>Um Zellen zu identifizieren, führen Sie Hintergrundsubtraktion und Partikelanalyse durch, um fluoreszierende Hellflecken für die Zellpositionserkennung und automatische Zellzählung zu identifizieren.</li>
		<li>Verwenden Sie Plugins (Manual Tracking, Chemotaxis, Migration Tool, Trackmate), um die Beweglichkeit und Migration von Zellen zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Konventionelle Zellkultur wurde vor fast einem Jahrhundert entwickelt und bleibt das am häufigsten verwendete präklinische Modell in der biomedizinischen Forschung, trotz seiner nachgewiesenen begrenzten Fähigkeit, klinische Ergebnisse bei Krebs vorherzusagen17. Tiermodelle bieten die höchste physiologische Relevanz und vernünftige genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen, aber seit langem anerkannt, dass erhebliche Einschränkungen bei der Vorhersage menschlicher Ergebnisse18</sup...

Krebs wird zunehmend als komplexes Ökosystem anerkannt, das nicht nur von der anhaltenden Dysregulation mutierter Zellpopulationen abhängt, sondern auch von lebenswichtigen Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Mikroumgebung des Wirts. In diesem Sinne entwickelt sich Krebs auf einer adaptiven Landschaft, die sich durch eine Kombination von Faktoren manifestiert, einschließlich einer heterogenen Tumormikroumgebung und Übersprechen mit einer Vielzahl von Wirtszellen, die alle selektive Drücke für weitere genetische oder epigenetische Veränderungen1,2,3. Im Zusammenhang mit soliden Tumoren trägt die ungleichmäßige Verteilung von Chemotherapeutika und anderen Ressourcengradienten zu ihrer molekularen Heterogenität bei und kann eine Rolle bei der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen, erhöhter Angiogenese auf bestimmte Tumortumoren spielen. Subpopulationen und sogar Metastasen4,5,6. Herkömmliche In-vitro-Zellkulturstudien in einer großen, bequemen Experimentellen Kapazität verfügen d.B. bieten mittlere Feld-, Gleichmäßig- und Fixbedingungen, wobei oft die genaue räumliche und zeitliche Umweltkontrolle fehlt, die notwendig ist, um wirklich in vivo Tumordynamik zu emulieren. Daher sind repräsentativere Ex-vivo-Modelle erforderlich, um die Tumormikroumgebung vor Tiermodellen in der Arzneimittelentwicklungspipeline zu reproduzieren, um eine bessere Vorhersage der Krebsprogression sowie Reaktionen auf Medikamente innerhalb dynamischer Belastungen zu erhalten. Landschaften. Mikrofluidik wurde vorgeschlagen, um die Lücke zwischen 2D-Zellkulturstudien und komplexeren in vivo Tierstudien zu überbrücken, die möglicherweise nicht in der Lage sind, kontrollierbare quantitative Studien7,8,9zu unterstützen.
Ein ideales In-vitro-System zur Charakterisierung der Krebszelldynamik sollte die Fähigkeit besitzen, eine heterogene Mikroumgebung zu erzeugen, um die adaptiven zellulären Reaktionen nachzuahmen, die in einem Tumor stattfinden können, und die Beobachtung dieser Dynamik an einem Einzelzellenauflösung. In diesem Artikel beschreiben wir eine plattform für die mikrofluidische Zellkultur, ein PDMS-basiertes Gerät namens "Evolution Accelerator" (EA), das parallele In-vitro-Studien der Krebszelldynamik bei zellulärer Auflösung mit Echtzeit-Datenerfassung über die Wochen, unter stabiler Aufrechterhaltung von Stressgradienten in der gesamten Kulturlandschaft. Das Design dieser Plattform basiert auf unserer bisherigen Arbeit, in der die evolutionäre Dynamik von Organismen in einer Metapopulation beschleunigt werden kann10,11. Insbesondere in einer Gruppe von räumlich getrennten Populationen, die auf einer gewissen Ebene interagieren, können die am besten geeigneten Arten in einer lokalen Population schneller dominieren als eine große einheitliche Population. Die vorteilhafte Art wandert dann auf der Suche nach Ressourcen und Raum in benachbarte Mikrohabitate und dominiert schließlich die gesamte Population. Wie in Abbildung 1dargestellt, besteht das Muster des mikrofluidischen EA-Chips aus (i) einem Paar Serpentinkanäle, die eine Frischmedienzirkulation ermöglichen und feste Randbedingungen für die chemische Diffusion konstruieren, und (ii) der sechseckigen Zellkulturregion die aus 109 miteinander verbundenen sechseckigen und 24 halbsechseckigen Kammern in der Mitte besteht, die einer Wabenstruktur ähneln. Der Chip ist 100 m tief. Medienkanäle und Zellkulturbereich sind mit kleinen Schlitzen (ca. 15 m Breit) verbunden, die einen direkten Medienfluss und die daraus resultierende Scherspannung im Zellkulturbereich verhindern und dennoch Chemikalien durch kleine Schlitze diffundieren und Nährstoffe austauschen können. Stoffwechselabfälle usw. Die Erzeugung chemischer Gradienten wird in Abbildung 1Bdargestellt, wo ein Medienkanal 0,1 mM Fluorescein enthält, während der andere Kanal frei von Fluorescein ist. Die Zellen werden auf einer gasdurchlässigen Membran kultiviert, die durch die Mikrostrukturen durch den positiven Gegendruck auf die Membran gegen den Chip eingekapselt wird. Die Komponenten des Gerätehalters sind in Abbildung 2dargestellt, und der Versuchsaufbau ist in Abbildung 3dargestellt, wo die Kultur auf einem invertierten Mikroskop bei 37 °C, mit über 85 % relativer Luftfeuchtigkeit, gepflegt und unter Normoxia-Gaszusammensetzung.
Dieses System bietet eine detaillierte Beobachtung lokalisierter zellulärer Wechselwirkungen über Hellfeld- und Fluoreszenzkanäle und ermöglicht räumlich aufgelöste downstream Assays wie Immunfluoreszenz, Western Blot oder Massenspektrometrie. Wir haben zuvor als Proof-of-Prinzip dieses mikrofluidischen Krebs-on-Chip-Modells auf die langfristige Co-Kultur von epitheliale und mesenchymalePC3 Prostatakrebszellen12 sowie die Entstehung von drogenresistenten polyploiden Riesen Krebszellen mit der epitheliale PC3-Zelllinie13. Während wir die Anwendung dieser Plattform präsentieren, um die raumzeitliche Dynamik von epitheliaalen PC3- und mesenchymalen Prostatakrebszellen unter einem Spannungsgradienten von Docetaxel zu verstehen, kann das mikrofluidische System leicht auf eine beliebige Kombination von Zelllinien angewendet werden. Ressourcen (d. h. Drogen, Nährstoffe, Sauerstoff) Gradienten.

<table><tbody><tr><td>10 mL BD Luer-Lok Spitzenspritzen</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x Anti-Anti</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>Photoresist Entwickler</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Cr Chrom Etchant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66+ Laserwriter</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66+</td><td>Schreib-Fotomaske</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>Zur Verbesserung der Fotolackhaftung</td></tr><tr><td>Hohle Stahlstifte</td><td>Neu England Small Tube</td><td>NE-1300-01</td><td>&nbsp;. 025 OD .017 ID x .500 lang / Typ 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi Heizsystem, Multi-Well Platten, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>Inkubator auf der Bühne&nbsp;</td></tr><tr><td>Luer-Lok 23 G Dosiernadel</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Zum Verbinden von Spritzen und Schläuchen</td></tr><tr><td>Lumox Schale 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>Gasdurchlässige Zellkulturschale</td></tr><tr><td>Microposit Remover 1165</td><td>Dow Electronic Materials</td><td>Microposit Remover 1165</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Microseal B Adhesive Sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories MSB1001</td><td>Adhesive Versiegelung</td></tr><tr><td>O-Ring (für Lumox Plattendichtung)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>Strich Nr. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" AD; Duro 70</td></tr><tr><td>O-Ring (für die Abdichtung von unteren Glasscheiben)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Strich Nr. 20; 7/8" ID x 1" AD; Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen Plasma-Reinigungs-/Ätzsystem</td><td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>Plasma-Preen</td><td>Sauerstoff-Plasmasystem</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>Tiefes reaktives Ionen-Ätzsystem</td></tr><tr><td>Suss MA6 Masken-Aligner SUSS</td><td>MicroTec</td><td>MA6</td><td>Mask Aligner&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>PDMS Elastomer</td></tr><tr><td>TePla M4L Plasmaätzer</td><td>PVA TePla</td><td>M4L</td><td>Plasmaätzer</td></tr><tr><td>Trichlor-1H,1H,2H,2H-Perfluoroctylsilan (PFOTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Für die Silanisierung von Siliziumwafern</td></tr><tr><td>Tygon Microbore Rohr (0,020" x 0,060" OD)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td>Schläuche für die Medienauslieferung</td></tr></tbody></table>

generierung heterogener arzneimittelgradienten über krebspopulationen auf einem mikrofluidischen evolutionsbeschleuniger zur echtzeitbeobachtung

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

Die konventionelle Zellkultur bleibt das am häufigsten verwendete präklinische Modell, trotz seiner nachgewiesenen begrenzten Fähigkeit, klinische Ergebnisse bei Krebs vorherzusagen. Mikrofluidische Krebs-on-Chip-Modelle wurden vorgeschlagen, um die Lücke zwischen den zu vereinfachten konventionellen 2D-Kulturen und komplizierteren Tiermodellen zu überbrücken, die nur begrenzt in der Lage sind, zuverlässige und reproduzierbare quantitative Ergebnisse zu erzielen. Hier stellen wir ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell vor, das Schlüsselkomponenten einer komplexen Tumormikroumgebung umfassend reproduziert, aber einfach genug ist, um robuste quantitative Beschreibungen der Krebsdynamik zu liefern. Dieses mikrofluidische Krebs-on-Chip-Modell, der "Evolution Accelerator", zerlegt eine große Population von Krebszellen in eine miteinander verbundene Reihe von Tumor-Mikroumgebungen und erzeugt gleichzeitig eine heterogene chemotherapeutische Stresslandschaft. Das Fortschreiten und die evolutionäre Dynamik von Krebs als Reaktion auf den Arzneimittelgradienten können wochenlang in Echtzeit überwacht werden, und zahlreiche nachgelagerte Experimente können komplementär zu den Zeitrafferbildern durchgeführt werden, die im Laufe der Experimente aufgenommen wurden.

Validierung des optimalen Zellwachstums auf dem Chip Ein wichtiges Ziel der Experimentierplattform ist es, Schlüsselkomponenten und Wechselwirkungen in einer komplexen Tumormikroumgebung umfassend zu reproduzieren, aber dennoch einfach genug, um quantitative, zuverlässige und reproduzierbare Daten bereitzustellen. Dieses Ziel kann nur erreicht werden, wenn wir die physikalischen und biochemischen Umweltfaktoren vollständig im Griff haben. Wir müssen entweder die unerwü...

Wir präsentieren ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell, die "Evolution Accelerator"-Technologie, die eine kontrollierbare Plattform für langfristige Echtzeit-quantitative Studien zur Krebsdynamik innerhalb klar definierter Umweltbedingungen an der Einzelzelle bietet. niveau. Es wird erwartet, dass diese Technologie als In-vitro-Modell für die Grundlagenforschung oder die präklinische Arzneimittelentwicklung funktioniert.

Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Dieses mikrofluidische Krebs-On-Chip-Modell, das wir Evolutionsbeschleuniger nennen, bietet eine kontrollierbare Plattform für langfristige, echtzeit-quantitative Studien zur Krebsdynamik innerhalb klar definierter Umweltbedingungen auf einer einzelnen Zellebene. Die Technologie ermöglicht es uns, die evolutionäre Dynamik von Krebs unter einer tumorartigen Stresslandschaft zu erforschen. Bereitstellung von Informationen wie Morphologie, Population, Beweglichkeit und Migration im Laufe der Zeit auf zellulärer Ebene.Mit der Fähigkeit, das Verhalten gemischter Tumorpopulationen unter gut kontrollierten Spannungsgradienten zu kontrollieren und zu überwachen, kann unsere Technologie ein physiologisch relevanteres Modell für die präklinische Arzneimittelentwicklung darstellen. Das vorgestellte Druckversiegelungsverpackungsverfahren kann auch in anderen mikrofluidischen Systemen eingesetzt werden, die eine ausgeklügelte Anpassung der Umgebungsgaszusammensetzung sowie der nachgelagerten Versuchskapazität erfordern. Der Schlüssel, um ein Langzeitexperiment erfolgreich durchzuführen, ist die Sicherung einer physikalisch und biochemisch stabilen Umgebung.Faktoren wie Temperatur, Luftfeuchtigk

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Wir beschreiben ein Protokoll für die Mikrofabrikation der Gradienten-erzeugenden Mikrofluidik-Gerät, das räumliche und zeitliche Verläufe in klar definierten Mikroumgebung erzeugen können. Bei diesem Ansatz kann der Gradient-Erzeugung mikrofluidischen Gerät verwendet, um gerichtete Wanderung, Embryogenese, Wundheilung und Krebs Metastasen zu untersuchen.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen...

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

Wir beschreiben einen Hochdurchsatz-Wirkstoffsensitivitätsassay für primäre multiple Myelomzellen. Es besteht aus einer Rekonstruktion der Mikroumgebung des Knochenmarks (einschließlich extrazellulärer Matrix und Stroma) in Multi-Well-Platten und einer nicht-invasiven Methode zur longitudinalen Quantifizierung der Zellviabilität.

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

Die Kontrolle von chemischen und Sauerstoffgradienten ist essentiell für Zellkulturen. In diesem Artikel wird über ein mikrofluidisches Gerät aus Polydimethylsiloxan-Polycarbonat (PDMS-PC) berichtet, das in der Lage ist, zuverlässig Kombinationen von chemischen und Sauerstoffgradienten für Zellmigrationsstudien zu erzeugen, die in biologischen Labors ohne ausgefeilte Instrumente praktisch eingesetzt werden können.

Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Dieser Bericht beschreibt eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zum Einrichten eines Einzelzellkulturexperiments, bei dem eine hocheffiziente Kopplung und mikroskopische Analyse mehrerer Einzelzellen erreicht werden kann.

Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Hypoxie ist ein Kennzeichen der Tumormikroumgebung und spielt eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten des Krebses. Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess eines hypoxischen Krebs-auf-einem-Chip basierend auf der 3D-Zelldrucktechnologie, um eine hypoxiebedingte Pathologie von Krebs zu rekapitulieren.

3D-zellgedruckter hypoxischer Krebs-on-a-Chip zur Rekapitulation des pathologischen Verlaufs von solidem Krebs

Erfahren Sie, wie der mikrofluidische Evolution Accelerator Krebsdynamiken in Echtzeit auf Einzelzellebene untersucht. Diese Technologie ermöglicht präklinische Arzneimittelentwicklung mit physiologisch relevanten Modellen.

Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung (Video) | JoVE Journal

Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung

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