Name: Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie die photoakustische Durchflusszytometrie zur Erkennung von Ovarialkrebs mit spezifischen Nanopartikeln. Diese Methode ermöglicht die kostengünstige und einfache Detektion zirkulierender Tumorzellen im Blut.

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Die Autoren würdigen Madeleine Howell für ihre Hilfe bei der Synthese, Matthew Chest für seine Hilfe bei der Entwicklung des Strömungssystems und Ethan Marschall für die Unterstützung bei SolidWorks.

1. Nanopartikelsynthese und Funktionalisierung
ANMERKUNG: Die Synthese der FA-CuS NPs wird mit einer Ein-Topf-Synthesemethode erreicht, die an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll21angepasst wurde. VORSICHT: Die gesamte Synthese sollte in einer belüfteten chemischen Rauchhaube erfolgen.
<ol><li>Vor der Synthese etwa 300 ml deionisiertes (DI) Wasser durch einen 0,2 m sterilen Filter filtern.</li>
	<li>Reinigen Sie einen 250 ml Glaskolben mit einer Waschmittellösung und spülen Sie ihn mit DI-Wasser ab. Fügen Sie 0,0134 g CuCl2 in 100 ml DI-Wasser hinzu, um eine 1 mM Lösung zu erstellen.</li>
	<li>0,015 g Folsäure (FA) in die CuCl2-Lösung geben und mit einem magnetischen Rührstab 5 min rühren.</li>
	<li>Fügen Sie Na2S-9H2O (0,024 g in 100 l DI-Wasser) über ca. 10 s zum Reaktionsgemisch hinzu, wobei eine 200-L-Pipette verwendet wird. HINWEIS: Nach Zugabe des Na2S-9H2O ändert sich die Farbe von hellgelb zu dunkelbraun.</li>
	<li>Die Reaktion verriegeln und in ein Ölbad legen, auf 90 °C eingestellt, und weiter mit einem magnetischen Rührstab rühren. Nach ca. 15 min oder wenn das Ölbad 85 bis 90 °C erreicht hat, lassen Sie die Reaktion für eine weitere Stunde ablaufen. Ihre Mischung sollte sich nach und nach in eine dunkelgrüne Farbe verwandeln. HINWEIS: Achten Sie darauf, das System zu entlüften, während Sie das Reaktionsgemisch erhitzen, um Druckaufbau zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie das Reaktionsgefäß aus dem Ölbad und kühlen Sie es bei Raumtemperatur ca. 10 bis 15 min kurz ab, bevor Sie in ein Eisbad überführen.</li>
	<li>Sobald das Reaktionsgemisch unter 20 °C abgekühlt ist, stellen Sie den pH-Wert auf 10 unter Verwendung von 1M NaOH ein, um die verbleibende Folsäure in Lösung aufzulösen.</li>
	<li>Reinigen Sie das FA-CuS-Reaktionsgemisch mit einer 30 kDa Zentrifugationskolore. Fügen Sie die Lösung in 15 ml Chargen in die Säule und Zentrifuge bei 3.082 x g für 15 min.</li>
	<li>Sobald das gesamte Reaktionsgemisch konzentriert ist, die konzentrierten Fraktionen neu kombinieren und 4x mit 15 ml pH 10 NaOH in der 30 kDa Zentrifugationskolorein waschen.</li>
	<li>Nehmen Sie für Massenmessungen 1/3 der Lösung (ca. 66 l) und teilen Sie sich in drei Glasfläschchen auf. Im Vakuumofen über Nacht bei 40 °C unter einem Vakuum von 27 mmHg trocknen.</li>
	<li>Lösen Sie die anderen 2/3 der konzentrierten Lösung in 250 l PBS auf und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung.</li>
	<li>Vor der Verwendung der FA-CuS NPs, beschallen Sie sie für 30 min in einem Bad Beschallungsgerät auf einer hohen Einstellung.</li>
</ol>2. NP-Charakterisierung
<ol><li>Dynamische Lichtstreuung (DLS) Hinzufügen von 10 l konzentrierten FA-CuS NPS in PBS-Lösung von Schritt 1.1.14 bis 2 ml DI-Wasser. Beschallen Sie die Partikel vor der Charakterisierung durch DLS 30 min in einem Badbeschalltosonicator auf einer hohen Einstellung und filtern Sie durch einen 0,2 m sterilen Filter, um Reststaub zu entfernen.</li>
	<li>Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durchführen: Fügen Sie 10 L konzentrierte FA-CuS NPS in PBS-Lösung zu einem Stück Wachspapier hinzu. Invertieren Sie ein Formvar beschichtetes Kupfergitter auf der Oberseite des Tröpfchens und lassen Sie 2 min sitzen. Berühren Sie den Rand des Formvar-beschichteten Gitters auf ein Stück Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Die Luft trocknen lassen. Bild des Kupfergitters mit einem Elektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV. HINWEIS: Typische Ergebnisse der FA-CuS NPS-Charakterisierung sind in Abbildung 1dargestellt.</li>
</ol>3. Zellkultur
<ol><li>Dieses Protokoll verwendet SKOV-3-Zellen. Sofern nicht anders angegeben, Kultur SKOV-3-Zellen in McCoys 5A-Medium mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin ergänzt, und halten bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Inkubator.</li>
</ol>4. Fluoreszierende Kennzeichnung von FA-CuS NPS für die Mikroskopie
<ol><li>Fügen Sie Texas-Red-X Succinimidylester (0,2 mg in DMSO in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst) zu einer Lösung hinzu, die 2 mg FA-CuS NPs in 1 ml mit 0,1 M NaHCO3 (pH-9) Puffer enthält.</li>
	<li>Rühren Sie das Reaktionsgemisch mit einem magnetischen Rührstab für 1 h, weg vom Licht bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Konzentrieren Sie das Reaktionsgemisch in einer 4 ml 30 kDa MWCO Zentrifugationskolorekationskolonne, indem Sie 10 min bei 4.000 x g drehen.</li>
	<li>Waschen Sie die konzentrierte Lösung 3x mit 4 ml 0,1 M NaHCO3 Puffer (pH 9) in einer Zentrifugationskolonne. Anschließend die konzentrierte Lösung mit 4 ml DI-Wasser 3x waschen oder nur eine Spurenmenge fluoreszenz im Durchfluss durch UV-VIS sichtbar bleibt.</li>
</ol>5. FA-CuS NPS Aufnahme durch Eierstockkrebszellen
<ol><li>Vor der Inkubation mit FA-CuS NPs sKOV-3-Zellen in einem T75-Kolben mit 8-15 ml folsäurefreiem RPMI-1640-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin für mindestens 24 h inkubieren.</li>
	<li>Samenzellen in 0,5 ml folsäurefreiem RPMI-1640 vervollständigen Wachstumsmedien mit einer Dichte von 0,1 x 106 Zellen/ml in eine 24-Well-Platte.</li>
	<li>Am nächsten Tag inkubieren Sie Zellen mit 400 g/ml FA-CuS NPS in 0,5 ml folsäurefreiem RPMI-1640 komplettem Wachstumsmedium für 2 h.</li>
	<li>Nach dieser Inkubation versuchen Sie die Zellen mit 0,5 ml 0,25% Trypsin mit EDTA. Fügen Sie mindestens 1 ml folsäurefreie RPMI-1640 komplette Wachstumsmedien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 123 x g für 6 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 2 ml PBS wieder auf und zentrifugieren Sie bei 123 x g für 6 min. Führen Sie diesen Waschschritt 2x durch, um ungebundene NPs zu entfernen.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 1 x 2 ml PBS mit 2% Tween-Lösung aus.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Weitere verdünnte Zellen, wenn die Zellzahl zu hoch ist. Verdünnung der Zellen in PBS mit 2% Tween zur gewählten Konzentration zum Nachweis.</li>
	<li>Die Zellen können nun vom PAFC-System analysiert werden.</li>
</ol>6. Fluoreszenzmikroskopie der FA-CuS NPS-Aufnahme
<ol><li>Wiederholen Sie die in Schritt 5.1 aufgeführten Schritte, und fahren Sie mit dem protokoll unten für die Mikroskopie fort.</li>
	<li>Samenzellen mit einer Dichte von 0,1 x 106 Zellen/ml in 0,5 ml folsäurefreiem RPMI-1640 komplettem Wachstumsmedium auf Glasabdeckungen in einer 24-Well-Platte.</li>
	<li>Am nächsten Tag inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszierend markierten FA-CuS NPs in Dreifache, in Konzentrationen von 100 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml und 400 g/ml in 0,5 ml folsäurefreier RPMI-1640-</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit den NPs für 2 h im 37 °C-Inkubator</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen nach dieser Inkubationszeit 3x mit PBS. HINWEIS: Für alle Waschschritte, fügen Sie vorsichtig die Lösung auf der Seite der Brunnenplatte, um die Zellen nicht zu stören. Nach dem Hinzufügen, vorsichtig kippen Sie die Platte und ziehen Sie die Lösung von der Seite des Brunnens.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml 3,7% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min und übertragen Sie die Glasabdeckungen auf eine neue 24 Wellplatte. VORSICHT: PFA ist ein bekanntes Karzinogen. Machen Sie alle Fixierung in einer belüfteten chemischen Rauchhaube und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einer Lösung von 3,7% PFA mit 0,1% Triton-X in PBS für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für jeweils 5 min und übertragen Sie die Abdeckungen auf eine neue Platte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml einer PBS-Lösung, die DAPI enthält (20 l/ml einer 0,5 mg/ml-Stammlösung wird für die Färbung verwendet) für 5 min, weg vom Licht.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit PBS 3x.</li>
	<li>Nach der abschließenden PBS-Wäsche die Abdeckungen auf Dias mit Montagemedium montieren.</li>
	<li>Die Zellen sind nun bereit, durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet zu werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die typische Zellcharakterisierung durch Fluoreszenzmikroskopie.</li>
</ol>7. Strömungssystemarchitektur
<ol><li>Strömungskammerbau HINWEIS:Eine SolidWorks-Datei eines 3D-gedruckten Durchflussbehälters finden Sie in den Ergänzungsmaterialien.<ol>
<li>Drucken Sie den Durchflussbehälter mit der mitgelieferten SolidWorks-Datei mit ABS-Thermoplast oder PLA-Kunststoff. Dimensionen werden unten angegeben, wenn SolidWorks nicht verfügbar ist. Abbildung 3A zeigt eine Darstellung dieses Modells. Der Körper des Durchflussbehälters ist 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm groß. Die weiten Enden des Durchflussbehälters enthalten Löcher mit einem Durchmesser von ca. 5 mm, um den Eintritt von Schläuchen zu ermöglichen, die das Kapillarrohr enthalten. HINWEIS: Der Durchflussbehälter hat ein 1 cm loch, senkrecht zur Ausrichtung des Kapillarrohres, für die Platzierung des Ultraschallwandlers. Eine zylindrische Extrusion mit dem gleichen Innendurchmesser wie das Loch erstreckt sich 6 mm in den Tank. Für die Echtzeit-Bildgebung verfügt der Durchflussbehälter über einen Schlitz von 1 mm x 3 mm direkt unter dem Kapillarrohr.</li>
		<li>Nach dem Drucken des 3D-Durchflussbehälters das System reinigen und montieren.</li>
		<li>Legen Sie Glasabdeckungen über den Schlitz 1 mm x 3 mm und das 1 cm Loch in das Durchflusssystem.</li>
		<li>Sorgfältig mit Silikon versiegeln, um Leckagen zu vermeiden.</li>
		<li>Das Kapillarrohr in die silikongehärteten Rohre einbauen. Stecken Sie die Rohre in die Durchflusskammer durch die Seite des Durchflussbehälters, so dass sich das Glaskapillarrohr direkt über und vor dem 3 mm Schlitz und dem 1 cm Loch befindet.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Schläuche mit Silikon, um Leckagen zu verhindern.</li>
	</ol></li>
	<li>Photoakustisches Durchflusssystem-Setup ANMERKUNG: Abbildung 3B und Abbildung 3C zeigen ein Beispiel für die Strömungssystemarchitektur.<ol>
<li>Schließen Sie den Messumformer an einen Ultraschallpulser/Empfänger an. Verstärken Sie das Signal mit einer 59 dB Verstärkung.</li>
		<li>Schließen Sie den Ausgang des Filters an ein vielseitiges, rekonfigurierbares Oszilloskop mit integriertem, programmierbaren Feld-Gate-Array an.</li>
		<li>Verbinden Sie eines der Rohre, die aus der Durchflusskammer kommen, an eine T-Kreuzung, die an jedem Zweig mit zwei Spritzenpumpen verbunden ist.</li>
		<li>Füllen Sie eine der Spritzenpumpen mit Luft und die andere Pumpe mit der zu analysierenden Probe. Stellen Sie die Mitluftpumpe auf einen Durchfluss von 40 l/min und die Pumpe, die die Probe enthält, auf einen Durchfluss von 20 l/min. Der resultierende zweiphasige Durchfluss erzeugt Probenvolumen von 1 L. Bei dieser Durchflussrate testet das System ca. 6,4 Proben pro Minute. HINWEIS: Um eine konsistente Verteilung der Zellen aufrechtzuerhalten, wirbeln Sie jede Probe unmittelbar vor dem Test leicht aus. Drehen Sie die Spritze außerdem alle paar Minuten, um zu verhindern, dass sich die Zellen in der Lösung absetzen.</li>
		<li>Schließen Sie das verbleibende Rohr, das das Durchflusssystem verlässt, an einen Behälter mit 10% Bleichmittel an, um Zellen nach dem Verlassen des Durchflusssystems zu entsorgen. HINWEIS: Prüfen Sie vor der Nutzung des Durchflusssystems, ob Leckagen vorgewirkt werden, da diese den Durchfluss beeinflussen können. Zellen müssen in einem geschlossenen System enthalten sein, um die biologische Sicherheit während des Verfahrens aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Das Design des 3D-gedruckten Tanks ermöglicht eine konsistente und wiederholbare Ausrichtung zwischen Messumformer und Laserlicht bei minimaler Kalibrierung. Wenn sie richtig in den kundenspezifischen Tank gelegt werden, sorgt das Quarzkapillarrohr dafür, dass Der Messumformer und der Laser direkt ausgerichtet sind.</li>
		<li>Stellen Sie den Abschnitt des Quarzkapillarrohres in direkter Ausrichtung mit dem Messumformer in das Sichtfeld des Mikroskops, so dass die optische Faser über der Probe sorgfältig platziert werden kann, so dass sie die gesamte Breite des Rohres beleuchtet.</li>
		<li>Bestrahlen Sie die Probe mit einer optischen Faser, die einen diodengepumpten Festkörperlaser kanalisiert, der mit einer Wellenlänge von 1.053 nm arbeitet. Das Laserlicht, das auf die Probe einwirkt, und der Messumformer, mit dem der photoakustische Effekt gemessen wird, sind beide unfokussiert.</li>
		<li>Die Energie des Lasereinfalls auf der Probe beträgt ca. 8 mJ und die 10 Hz-Laserrate reicht aus, um jede Probe beim Durchlaufen des Systems mehrmals zu beleuchten.</li>
		<li>Platzieren Sie das Durchflusssystem auf einem invertierten Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sowohl der Laserpuls als auch der Pfad der Probe sichtbar sind, während die Probe durch das Durchflusssystem verläuft. Zeichnen Sie den Durchfluss mit einer mit dem Mikroskop montierten Kamera auf.</li>
		<li>Zeichnen Sie die Ultraschallerfassungen mithilfe von Datenerfassungssoftware auf (siehe Tabelle der Materialien). Lösen Sie Ultraschall und gepulsten Laser mit dem FPGA. Verwenden Sie PBS mit 2% Tween und FA-CuS NPs mit einer Konzentration von 100 g/ml in PBS 2% Tween, als negative bzw. positive Kontrollen.</li>
		<li>Zeichnen Sie mithilfe einer mit dem Mikroskop montierten Kamera sowohl das Abfeuern des Lasers als auch den Durchgang von Proben durch das Durchflusssystem auf. Diese Aufnahmen werden verwendet, um das vom Messumformer aufgezeichnete akustische Signal mit dem Abfeuern des Lasers zu korrelieren. Wenn die Proben vor dem Abfeuern des Lasers verlaufen, kann das Signal dann zur Analyse mit dem resultierenden photoakustischen Signal korreliert werden. Bei einer Abtastrate von 10 Hz beleuchtet der Laser jeden Stecker mehrmals.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Nachbearbeitung
<ol><li>Berechnen Sie für jede Signalaufnahme s(t) die Hilbert-Transformation H[s(t)], um ein analytisches Signal zu erzeugen.</li>
	<li>Erstellen Sie einen komplexen Umschlag, se(t), indem Sie <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"> die Größe des Analysesignals berechnen, so dass und integrieren Sie den Umschlag, um das Gesamtsignal zu messen, das aus jeder Erfassung resultiert. Vergleichen Sie die Signale jeder Testgruppe (d. h. PBS, markierte Zellen, FA-CuS-NPs, Zellen allein) unter Verwendung eines t-Tests in der r.-Statistiksoftware. Rohe photoakustische Signale und ihre Hilbert-Transformationen sind in Abbildung 4dargestellt.</li>
	<li>Normalisieren Sie für die Bildrekonstruktion den komplexen Umschlag basierend auf dem maximalen Peak während des gesamten Laufs. Wenn Sie eine Reihe von Durchläufen vergleichen, normalisieren Sie den komplexen Umschlag mithilfe der maximalen Spitze über die gesamte Serie hinweg. Konvertieren Sie nach der Normalisierung jede Erfassung in eine Reihe von Pixelwerten. Stellen Sie jede Reihe von Pixelwerten als Spalte in der Bildrekonstruktion dar. Repräsentative Rekonstruktionen von PBS- und FA-CuS-NPs-Signalen sind in Abbildung 5dargestellt, wo beide Bilder mit der maximalen Spitze über beide Durchläufe normalisiert wurden.</li>
</ol>

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<li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
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<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll ist eine einfache Methode zur Erkennung von Eierstock-CTCs unter Verwendung von PAFC und einem gezielten CuS-Kontrastmittel. Viele Methoden wurden für den Nachweis von Eierstock-CTCs erforscht, einschließlich mikrofluidischer Geräte, RT-PCR und Fluoreszenz-Flow-Zytometrie23,24,25. Diese reichen von Komplexität, Kosten und Genauigkeit, wodurch ihre Wirksamkeit in klinischen Umgebungen eingeschränkt wird. PAFC bie...

Eierstockkrebs ist eine der tödlichsten gynäkologischen Erkrankungen und führte 2018 weltweit zu schätzungsweise 184.800 Todesfällen1. Mehrere Studien haben die Korrelation zwischen der Progression von Eierstockkrebs (d. h. Metastasierung) und dem Vorhandensein von CTCs2,3,4gezeigt. Die gängigste Methode zur Detektion und Isolierung von CTCs nutzt das Cellsearch-System, das auf den EpCam-Rezeptor5abzielt. EpCam-Expression ist jedoch im epitheliale bis mesenchymalen Übergang, der in Krebsmetastasen verwickelt ist, downreguliert6. Trotz der Fortschritte leiden die aktuellen klinischen Technologien immer noch unter geringer Genauigkeit, hohen Kosten und Komplexität. Aufgrund dieser Nachteile sind neue Technologien für die Entdeckung und Aufzählung von Eierstock-CTCs zu einem wichtigen Forschungsgebiet geworden.
Kürzlich entwickelte sich PAFC als wirksame Methode zur nichtinvasiven Detektion von Krebszellen, zur Analyse von Nanomaterialien und zur Identifizierung von Bakterien7,8,9. PAFC unterscheidet sich von der herkömmlichen Fluoreszenzflusszytometrie durch die Detektion von Analyten im Fluss durch die Verwendung von Photoakustik. Der photoakustische Effekt wird erzeugt, wenn Laserlicht von einem Material absorbiert wird, das eine thermoelastische Ausdehnung verursacht und eine akustische Welle erzeugt, die von einem Ultraschallwandler10,11erkannt werden kann. Zu den Vorteilen von PAFC gegenüber herkömmlichen Durchflusszytometriemethoden gehören Einfachheit, einfache Übersetzung in klinische Umgebungen und der Nachweis von CTCs in beispiellosen Tiefen in Patientenproben12,13. Neuere Studien haben PAFC-Systeme für den Nachweis von Zellen mit endogenem und exogenem Kontrast14,15verwendet. Nahinfrarot (NIR) lichtabsorbierende Kontrastmittel wie indocyanine grüner Farbstoff und MetallNPs (z.B. Gold und CuS) wurden für die selektive Kennzeichnung von Zellen und Geweben in Kombination mit photoakustischer Bildgebung16,17,18verwendet. Durch die verbesserte Eindringtiefe von NIR-Licht in biologischen Geweben kann die photoakustische Detektion von Absorbern in größeren Tiefen für klinische Anwendungen durchgeführt werden. Aufgrund ihres großen Einsatzpotenzials in der Klinik hat die Kombination von gezielten NIR-Kontrastmitteln mit PAFC großes Interesse für den Nachweis von CTCs geweckt.
PAFC in Kombination mit gezielten Kontrastmitteln bietet einen verbesserten Ansatz für die Analyse von Patientenproben mit hohem Durchsatz mit verbesserter Genauigkeit und gezielter Detektion von CTCs. Eine der wichtigsten Nachweisstrategien für CTCs ist die spezifische Ausrichtung von Membranproteinen, die auf der Zelle von Interesse vorhanden sind. Ein bemerkenswertes Merkmal von Eierstock-CTCs ist die Überexpression von Folatrezeptoren auf ihrer äußeren Membran19. Folatrezeptor-Targeting ist eine ideale Strategie für die Identifizierung von Eierstock-CTCs im Blut, da endogene Zellen, die eine höhere Expression von Folsäurerezeptoren haben, in der Regel luminal sind und eine begrenzte Exposition gegenüber dem Blutkreislauf20haben. Kupfersulfid NPs (CuS NPs) wurden vor kurzem für ihre Fähigkeit, Folat-Rezeptoren auf Krebszellen exprimiert21anerkannt. Kombiniert mit ihrer Biokompatibilität, einfachen Synthese und Absorption tief im NIR, bilden diese NP-Kontrastmittel eine ideale Targeting-Strategie für den Nachweis von Eierstock-CTCs unter Verwendung von PAFC.
Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitung von FA-CuS NPs und deren Verwendung für den Nachweis von Eierstockkrebszellen in einem photoakustischen Strömungssystem. CuS NPs werden mit Folsäure modifiziert, um gezielt Ovarial-CTCs anzusprechen und ein photoakustisches Signal auszusenden, wenn sie mit einem 1.053 nm Laser stimuliert werden. Die Ergebnisse deuten auf den erfolgreichen Nachweis von Eierstockkrebszellen hin, die mit diesen photoakustischen Kontrastmitteln innerhalb des PAFC-Systems inkubiert werden. Diese Ergebnisse zeigen den Nachweis von Eierstockkrebszellen bis hin zu Konzentrationen von 1 Zelle/L, und die Fluoreszenzmikroskopie bestätigt die erfolgreiche Aufnahme dieser Partikel durch SKOV-3 Eierstockkrebszellen22. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der FA-CuS NPs Synthese, die Vorbereitung von Proben für die Fluoreszenzmikroskopie, den Aufbau des photoakustischen Strömungssystems und die photoakustische Detektion von Eierstockkrebszellen. Die vorgestellte Methode zeigt eine erfolgreiche Identifizierung von Eierstock-CTCs im Fluss unter Verwendung von FA-CuS NPs. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die klinische Anwendung dieser Technologie zur Früherkennung von Eierstockkrebsmetastasen konzentrieren.

<table><tbody><tr><td>0,025 % Trypsin mit EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0,2 & Mikro; m 1.000 mL Vakuumfiltrationseinheit</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>Zur Filtration größerer Mengen an VE-Wasser.</td></tr><tr><td>0,2 &Mikro; m steriler Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3D-gedruckter Tank</td><td></td><td>Maßgeschneiderte</td><td></td></tr><tr><td>Erfassungskarte</td><td>National Instruments</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8-Kanal, 14-Bit</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>Reinigungsmittel für die Reinigung von Glaswaren.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hämatozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-chlorid</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>206532500</td><td></td></tr><tr><td>Kupplungsobjektiv</td><td>Thorlabs</td><td>LMH-10x-532</td><td>Zum Ankoppeln gepulstes Licht auf optische Fasern.</td></tr><tr><td>Koppeltisch</td><td>Newport</td><td>F-91-C1-T</td><td>Tisch zur Einkopplung von gepulstem Licht an das Objektiv. Geeignet für digitale Ultraschall-Reinigungsbäder der CPX-Serie FP-1A und LMH-10x-532</td></tr> Modell CPX3800 <tr><td></td><td></td> Datenerfassungssoftware von Fisherbrand National Instruments <td>NI LabVIEW 2017 (32 Bit)</td><td>LabVIEW zur Synchronisierung von Laserpulsen und Datenerfassung.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Datenverarbeitungssoftware</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Rekonstruktionen und Diagramme, die mit der Matlab-Software erstellt wurden.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Faserfutter</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td>Wird verwendet, um die blanke Faser zu halten.</td></tr><tr><td>Faserkoppler</td><td>Newport</td><td>FP-1A</td><td>3-Achsen-Tisch zur Positionierung von Faserfutter und optischer Faser im Fokus des Objektivs.</td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Beschichtete TEM-Gitter</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Schlauch</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject 10 mL Spritzen</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Optische Faser</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>Wird verwendet, um Proben gepulstem Licht auszusetzen.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gepulster Laser</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>Gepulste Laserquelle mit Spezifikationen 1053 nm, 8 ns Puls, 10 Hz maximal.</td></tr><tr><td>Impulsgeber/Empfänger</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>Empfängt, filtert und verstärkt photoakustische Signale. Betrieben mit 59 dB Gain.</td></tr><tr><td>Quarz-Kapillarrohr</td><td>Sutter Instrument</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) Folsäurefrei</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silikon</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid-Kügelchen</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfid-Nonahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpen</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl Ester</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>Wandler</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>Ultraschalldetektor mit einer Zentralfrequenz von 50 MHz und einer fraktionierten Bandbreite von -6 dB von 82%.</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung 0,4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgel</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>Aquasonic 100</td><td>Ultraschallgel zur Schallkopfkopplung</td></tr></tbody></table>

ovarialkrebs-erkennung mit photoakustischer durchflusszytometrie

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Viele Studien deuten darauf hin, dass die Aufzählung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) als prognostisches Werkzeug für Eierstockkrebs vielversprechend sein könnte. Aktuelle Strategien für den Nachweis von CTCs umfassen Durchflusszytometrie, mikrofluidische Geräte und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Trotz der jüngsten Fortschritte fehlt es den Methoden zur Erkennung von frühen Ovarialkarzinastasen noch immer an der Empfindlichkeit und Spezifität, die für die klinische Übersetzung erforderlich sind. Hier wird eine neuartige Methode zum Nachweis von zellaren zirkulierenden Tumorzellen durch photoakustische Durchflusszytometrie (PAFC) unter Verwendung eines benutzerdefinierten dreidimensionalen (3D) gedruckten Systems, einschließlich einer Durchflusskammer und Spritzenpumpe, vorgestellt. Diese Methode verwendet Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel (FA-CuS NPs), um SKOV-3 Eierstockkrebszellen durch PAFC zu zielen. Diese Arbeit zeigt die Affinität dieser Kontrastmittel für Eierstockkrebszellen. Die Ergebnisse zeigen NP-Charakterisierung, PAFC-Detektion und NP-Aufnahme durch Fluoreszenzmikroskopie und zeigen damit das Potenzial dieses neuartigen Systems, Eierstock-CTCs in physiologisch relevanten Konzentrationen zu detektieren.

Abbildung 1A zeigt ein typisches TEM-Bild der synthetisierten Nanopartikel. Die durchschnittliche Größe des typischen Nanopartikels beträgt ca. 8,6 nm bei 2,5 nm. Die Nanopartikelmessung wurde in ImageJ durchgeführt. Schwellen- und Wassereinzugsgebietsfunktionen wurden angewendet, um die Partikel für die Messung zu trennen. Die horizontalen und vertikalen Durchmesser jedes Teilchens wurden senkrecht zueinander gemessen und weiter gemittelt. F...

Ein Protokoll wird vorgestellt, um zirkulierende Eierstocktumorzellen unter Verwendung eines maßgeschneiderten photoakustischen Strömungssystems und gezielter Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel zu detektieren.

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Aktuelle Maßnahmen zur Erkennung von Eierstockkrebs sind unspezifisch und mangelhafte Erkennung von zirkulierenden Tumorzellen. Unser photoakustisches Strömungssystem ermöglicht die Untersuchung von Patientenproben auf spezifische Eierstockkrebsmarker im Blutkreislauf. Dieses Verfahren bietet eine einzigartige Plattformtechnologie mit Verbesserungen gegenüber den aktuellen Techniken in Bezug auf Einfachheit, niedrige Kosten, vielversprechende Erkennungsgrenzen und die Fähigkeit, auf breite Anwendungen angewendet zu werden.Mit dieser Arbeit wollen wir unser gezieltes Nanopartikelsystem für Eierstockkrebs aufbauen, um ex vivo Patientenproben auf CTCs zu testen. Dieses äußerst vielseitige PAFC-System ist in der Lage, für den klinischen Einsatz zu erweitern und das Vorhandensein einer breiten Palette von Biomarkern im Blut zu testen. Die richtige optische Ausrichtung ist entscheidend für die Detektion von Zielen innerhalb des photoakustischen Durchflusszytometriesystems.Um eine ordnungsgemäße akustische Kopplung zu gewährleisten, stellen Sie außerdem sicher, dass sich keine Blasen zwischen Glasschlitten und Messumformer befinden. Aufgrund der benutzerdefinierten Natur des Strömungssystems und seiner Komponenten ist die Visualisierung der Methode für eine genaue Reproduktion von Vorteil. In einer belüfteten chemischen Rauchhaube etwa 300 Milliliter entionisiertes Wasser durch einen sterilen 0,2 Mikrometer-Filter filtern.Fügen Sie 0,0134 Gramm Kupferchlorid und 100 Milliliter entionisiertes Wasser in einen sauberen 250 Milliliter runden Bodenkolben, um eine einMillimolar Kupferchloridlösung zu schaffen. Fügen Sie 0,015 Gramm Folsäure in den Kolben und verwenden Sie eine magnetische Rührstange, um die Lösung für etwa fünf Minuten zu mischen. Dann mischen Sie 0,024 Gramm Natriumsulfid-Nonahydrat mit 100 Mikroliter entionisiertem Wasser.Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um diese Lösung langsam über eine Dauer von etwa 10 Sekunden in das Reaktionsgemisch einzutragen. Begrenzen Sie das Reaktionsgefäß. Legen Sie das Gefäß in ein Ölbad, das auf 90 Grad Celsius eingestellt ist, und rühren Sie weiter.Nach ca. 15 Minuten oder wenn das Ölbad den Temperaturbereich zwischen 85 und 90 Grad Celsius erreicht hat, lassen Sie die Reaktion für eine weitere Stunde ablaufen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Reaktionsgefäß aus dem Ölbad und lassen Sie es bei Raumtemperatur 10 bis 15 Minuten abkühlen, bevor Sie es in ein Eisbad übertragen. Sobald die Reaktion abgekühlt ist, stellen Sie den pH-Wert mit einem Mol-Natriumhydroxid auf ca. 10 an.Fügen Sie die Mischung in einer 30-Kilodalton-Zentrifugationskolore in 15-Milliliter-Chargen und Zentrifuge bei 3, 082 mal g für 15 Minuten hinzu, um das Reaktionsgemisch zu reinigen. Mischen Sie zunächst die Folsäure-kupfersulfid-Nanopartikel in der richtigen Konzentration in frischen RPMI-Medien. Fügen Sie diese Nanopartikellösung zu jedem Brunnen der vorbereiteten 24-Well-Platte hinzu, die SK-OV-3-Zellen mit einer Konzentration von 400 Mikrogramm pro Milliliter enthält.Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für zwei Stunden inkubieren. Danach versuchen, die Zellen mit 0,5 Milliliter von 0,25%Trypsin und EDTA. Um das Trypsin zu neutralisieren, fügen Sie mindestens einen Milliliter folsäurefreien RPMI 1640 komplette Wachstumsmedien hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen sechs Minuten lang bei 123 mal g.Um die Zellen zu waschen, entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter PBS und Zentrifuge bei 123 mal g für sechs Minuten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, um ungebundene Nanopartikel zu entfernen. Setzen Sie dann die Zellen mit einem bis zwei Millilitern einer 2%Tween-Lösung in PBS wieder aus.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypan Blue. Verdünnen Sie die Zellen in einer Lösung von 2%Tween in PBS auf die gewählte Konzentration zur Detektion. Verwenden Sie die mitgelieferte dreidimensionale STL-Datei, um den Durchflussbehälter mit ABS-Thermoplast oder PLA-Kunststoff zu drucken.Nach dem Drucken des Tanks, reinigen und montieren Sie das System für den Einsatz. Glasabdeckungen über den ein Millimeter mal drei Millimeter langen Schlitz und das ein Zentimeter lange Loch in das Strömungssystem legen und vorsichtig mit Silikon versiegeln, um Leckagen zu vermeiden. Als nächstes passen Sie das Kapillarrohr in die silikongehärteten Rohre.Setzen Sie die Rohre durch die Seite des Durchflussbehälters so in die Strömungskammer ein, dass sich das Glaskapillarrohr direkt über und vor dem Drei-Millimeter-Schlitz und dem ein Zentimeter langen Loch befindet. Versiegeln Sie die Schläuche mit Silikon. Schließen Sie dann den Messumformer an einen Ultraschallpulser und Empfänger an.Verstärken Sie das Signal mit einer 59-Dezibel-Verstärkung. Schließen Sie den Ausgang des Filters an ein vielseitiges, rekonfigurierbares Oszilloskop mit integriertem, programmierbaren Feld-Gate-Array an. Verbinden Sie eines der Rohre, die aus der Durchflusskammer kommen, an eine T-Verbindung, die an jedem Zweig mit zwei Spritzenpumpen verbunden ist.Füllen Sie eine der Spritzenpumpen mit Luft und die andere Pumpe mit der zu analysierenden Probe. Stellen Sie die Luftmenge auf einen Durchfluss von 40 Mikroliter pro Minute ein und stellen Sie die Pumpe, die die Probe enthält, auf einen Durchfluss von 20 Mikroliter pro Minute. Als Nächstes verbinden Sie das verbleibende Rohr, das das Durchflusssystem verlässt, mit einem Behälter mit 10% Bleichmittel, um Zellen zu entsorgen, nachdem sie das Durchflusssystem verlassen haben.Platzieren Sie den Abschnitt des Quarzkapillarrohres in direkter Ausrichtung mit dem Messumformer in der Feldansicht des Mikroskops, um eine sorgfältige Platzierung der optischen Faser über der Probe zu ermöglichen, so dass sie die gesamte Breite des Rohres beleuchtet. Bestrahlen Sie die Probe mit einer optischen Faser, die einen diodengepumpten Festkörperlaser kanalisiert, der mit einer Wellenlänge von 1 053 Nanometern arbeitet. Verwenden Sie eine mit dem Mikroskop montierte Kamera, um den Durchfluss, das Abfeuern des Lasers und den Durchgang von Proben durch das Durchflusssystem aufzuzeichnen.In dieser Studie werden die photoakustische Durchflusszytometrie und das gezielte Kupfersulfid-Targeting-Mittel verwendet, um zirkulierende Tumorzellen zu detektieren. Ein typisches TEM-Bild der synthetisierten Nanopartikel zeigt, dass die durchschnittliche Größe eines typischen Nanopartikels etwa 8,6 Nanometer beträgt. Die horizontalen und vertikalen Durchmesser jedes Teilchens werden dann senkrecht zueinander gemessen und weiter gemittelt.Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser für diese Partikel beträgt 73,6 Nanometer. Kupfersulfid-Nanopartikel haben eine charakteristische Absorptionskurve, die sich bis ins Nahinfrarot erstreckt. Es gibt ein leichtes Artefakt um 850 Nanometer, das durch das Schalten von Lasern durch das Spektralphotometer verursacht wird.Fluoreszenzmikroskopiebilder von Zellen, die mit fluoreszierend markierten Nanopartikeln inkubiert werden, zeigen, dass die Nanopartikelaufnahme durch das Vorhandensein von Fluoreszenz in der Zelle visualisiert werden kann. Zellen, die nicht mit Nanopartikeln inkubiert werden, zeigen kein fluoreszierendes Signal. Das Vorhandensein dieses fluoreszierenden Signals zeigt die erfolgreiche Aufnahme der Partikel und ihre Fähigkeit, im Strömungssystem detektiert zu werden.Beispiele für typische Datenerfassungssignale werden hier gezeigt. Die Rohdaten zeigen die Signalunterschiede zwischen den nanopartikelmarkierten Zellen, PBS und Folsäure-kupfersulfid-Nanopartikeln an. Unter Verwendung der benutzerdefinierten Laboransicht und MATLAB-Software werden Bildrekonstruktionen von positiven und negativen Kontrollen in Echtzeit bzw. nach der Erfassung durchgeführt.Einzelne Umschläge werden anschließend in Pixelwerte konvertiert und als unabhängige Spalten angezeigt. Deutliche Unterschiede im photoakustischen Signal treten zwischen PBS und den Folsäure-kupfersulfid-Nanopartikeln in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, den Ultraschallwandler, das Mikroskop und die Faseroptik innerhalb des photoakustischen Durchflusszytometriesystems richtig auszurichten.Bestätigen Sie die Systemausrichtung, indem Sie positive und negative Kontrollen testen. Aufgrund der Vielseitigkeit der photoakustischen Targeting-Techniken und der vielfältigen Einsatzmöglichkeiten mit PAFC ebnet diese Technik den Weg für translational wichtige klinische und Forschungsanwendungen. Um die klinische Anwendung zu gewährleisten, sollten sich weitere Studien auf die Prüfung von Patientenproben und die Reduzierung der Verfahrensschritte konzentrieren.Die Synthese der Nanopartikel sollte in einer chemischen Rauchhaube unter Verwendung der richtigen Schutzausrüstung erfolgen. Menschliche Zelllinien müssen gemäß den Richtlinien Ihrer Institution behandelt werden. Der Einsatz des Lasers erfordert ein Strahlensicherheitstraining und entsprechende PSA.Lasernutzung und photoakustische Tests sollten nur von hochqualifiziertem Personal durchgeführt werden.

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Wir beschreiben eine nicht-invasive Bildgebungsplattform für Tiere, die die Erkennung, Quantifizierung und Überwachung des Wachstums und Wiederauftretens von Eierstockkrebs ermöglicht. Dieses intraperitoneale Xenotransplantatmodell ahmt das klinische Profil von Patientinnen mit Eierstockkrebs nach.

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Ein gemeinsames Ultraschall- und photoakustisches Bildgebungsprotokoll für die transvaginale Bildgebung von Ovarialläsionen

Veränderungen des Blutflusses der Eierstöcke während der präovulatorischen Periode sind für den Eisprung unerlässlich. Die Doppler-Sonographie wurde bei Menschen und Großtieren eingesetzt, um die Hämodynamik und Perfusion der Eierstöcke zu beurteilen. Es wird ein Protokoll für die Anwendung der Doppler-Sonographie zur Beurteilung der ovariellen Hämodynamik während der präovulatorischen und periovulatorischen Phase bei Mäusen vorgestellt.

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Lernen Sie die photoakustische Durchflusszytometrie zur Erkennung von Ovarialkrebs mit spezifischen Nanopartikeln. Diese Methode ermöglicht die kostengünstige und einfache Detektion zirkulierender Tumorzellen im Blut.

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

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