Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Wir haben eine Montagemethode für die Zeitraffer-Bildgebung entwickelt, die ein uneingeschränktes Wachstum empfindlicher Zebrafischembryonen ermöglicht und sie gleichzeitig in einer völlig festen Position hält. Diese Montagemethode ist schnell, einfach und kostengünstig und funktioniert für die Labor-Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop. Wir haben diese Methode zur Abbildung lebender Zebrafischembryonen entwickelt, aber sie könnte für die Abbildung anderer kleiner Aquatiermodelle modifiziert werden.

Beginnen Sie mit der Zucht der erwachsenen Zebrafische. Am Nachmittag legen Sie die Fische in Zuchtbecken mit einem Verhältnis von 1 zu 2 von Mann zu Frau. Dann bereiten Sie eine Lagerlösung von 1%niedriger Schmelze Agarose in Embryo-Medien und lösen Sie es durch Erhitzen in einer Mikrowelle.

Aliquot die Agarose-Lösung in 1,5-Milliliter-Röhren. Machen Sie eine Lagerlösung von 4%Tricain in destilliertem Wasser und lagern Sie die Agarose und Tricaine bei vier Grad Celsius. Tricain ist giftig und muss gewogen und in einer Dunstabzugshaube zubereitet werden.

Nach der Paarung die Zebrafisch-Embryonen in E3 in einer Petrischale ernten und bei 26,5 Grad Celsius für etwa 28 Stunden vor der Montage bebrüten. Anästhetisieren Sie die Embryonen mit 0,02% Tricain und dechorionieren Sie sie unter dem Mikroskop, indem Sie sanft greifen und ziehen Sie die Chorion auseinander, um den Embryo zu befreien. Kurz vor der Montage die Agarose-Lösung auf 65 Grad Celsius erhitzen und dann auf ca. 30 Grad Celsius abkühlen lassen, damit der Embryo nicht durch die Hitze geschädigt wird, und Der Agarose-Lösung Tricain hinzufügen.

Verwenden Sie 35 Millimeter Glasbodenschalen mit einer Zahl Null Coverglas Boden. Legen Sie vorsichtig einen dechorionierten Embryo mit einer seiner Seiten zur Unterseite der Schale mit einer Glaspipette oder einer Mikropipette, dann entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden E3 mit einer Mikropipette. Fügen Sie die erste Agarose-Lösung zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch das an der Unterseite der Schale befestigte Deckglas erstellt wurde, um den Embryo zu bedecken, um sicherzustellen, dass die Agarose den kleinen Brunnen bedeckt, aber nicht überfließt.

Bedecken Sie den kleinen Brunnen mit einem Deckglas, um einen schmalen Agarose-gefüllten Raum mit dem Embryo zwischen den beiden Deckgläsern zu schaffen. Legen Sie eine Schicht von 1%Agarose-Lösung auf die Oberseite des Deckglases auf der unterdem der Schale, die das Deckglas an Ort und Stelle halten wird, wie es erstarrt. Dann füllen Sie den restlichen Teil der Schale mit E3 mit 0,02%Tricain, um das System hydratisiert zu halten.

Um die optimale Agarose-Konzentration für Schicht eins zu identifizieren, montieren Sie die Embryonen in zunehmenden Konzentrationen von Agarose und führen Sie Zeitraffer-Bildgebung durch, um die Konzentration zu identifizieren, die die Embryoverzerrung und Beweglichkeit minimiert, und testen Sie dann einen feineren Konzentrationsbereich auf der Grundlage der Ergebnisse. Der wichtigste Schritt dieses Protokolls besteht darin, die optimale Konzentration von Agarose für Schicht eins zu identifizieren. Testen Sie verschiedene Nanokonzentrationen von Agarose, wie 0,030%0,032% usw.

um die optimale Konzentration zu finden. Um die Embryonen mit Zeitraffer zu bebildern, verwenden Sie ein Mikroskopstadium mit einem Inkubator von 28,5 Grad Celsius und einem Bild für bis zu 55 Stunden. Um mehrere Embryonen gleichzeitig abzubilden, verwenden Sie einen Bühnenadapter, der mehrere Gerichte hält, und drehen Sie die Gerichte nacheinander, so dass die Embryonen horizontal positioniert sind.

Wählen Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung, lokalisieren Sie dann die Embryonen mit dem Okular und richten Sie sie schließlich horizontal aus, indem Sie die Gerichte drehen. Zeichnen Sie den Standort der Embryonen in der Software auf, und erstellen Sie einen Dateinamen zum automatischen Speichern der Daten. Legen Sie die Lochgröße, die Scangeschwindigkeit, die Bildgröße und den Zoom fest.

Wählen Sie dann eine höhere Vergrößerung für die Aufnahme von Bildern und die zu bebildernden Fluoreszenzkanäle aus. Passen Sie für jeden Kanal die Laserleistung und die Hochspannung des Detektors an, um den bestmöglichen Dynamikbereich zu erfassen und gleichzeitig Sättigung zu vermeiden und das Bleichen von Fotos zu begrenzen. Um als Nächstes den gesamten Embryo mit einem 10-fachen Objektiv abzubilden, legen Sie die Einstellungen für die große Bildaufnahme in der Software fest, um mehrere Sichtfelder abzubilden und sie zusammenzufügen und die Position des Embryos anzupassen, um sicherzustellen, dass er in diesen großen Bildbereich passt.

Konfigurieren Sie die Einstellungen für die Erfassung von Z-Stacks entsprechend den Manuskriptrichtungen. Um den Fokus mehrerer Embryonen während der Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung zu erhalten, verwenden Sie einen automatisierten Fokus und passen Sie die einzelnen Offset-Werte für jeden Embryo an, um sich auf die Referenzebene zu konzentrieren. Richten Sie dann Zeitrafferparameter in der Mikroskopsoftware ein, um für eine Dauer von 55 Stunden in Einem Stunde-Intervallen abzubilden.

Erfassen Sie in jedem Zyklus zwei Embryo-Datasets sequenziell und speichern Sie Daten automatisch. Verwenden Sie die Mikroskop-Software, um die Bilder zu verarbeiten. Wenn mehr als ein Embryo abgebildet wurde, erstellen Sie unabhängige Dateien für jeden Embryo, indem Sie die Datensätze basierend auf dem Speicherort der Abbildung aufteilen.

Konvertieren Sie die 3D-Zeit-Datasets mithilfe von Projektionen mit maximaler Intensität oder einem ähnlichen Werkzeug in 2D-Zeit-Datasets. Erstellen Sie schließlich Filmdateien, indem Sie sie als AVI speichern und die Option "Keine Komprimierung" mit 200 Millisekundenintervallen für eine Wiedergabegeschwindigkeit von fünf Bildern pro Sekunde auswählen. Diese geschichtete Montagemethode ermöglicht es, Zebrafisch-Embryonen abzubilden, während sie wachsen können, aber gleichzeitig ihre Bewegung einschränken.

Wenn die Agarose-Konzentration zu hoch ist, werden die Embryonen verzerrt. Aber wenn es zu niedrig ist, werden sie während der Zeitraffermikroskopie aus dem Sichtfeld herauskommen. Die optimale Agarose-Konzentration lag zwischen 0,028 und 0,034%Live-transgenen Zebrafischen, die RFP im gesamten Embryo und GFP in den Endothelzellen der Vaskulatur exzessierten, wurden 55 Stunden lang abgebildet, während der das intersegementale Gefäß sprießen, subintestinale und Kopfvaskulatur entwickelten und kaudalen Venenplexuskondensation mit Rumpfdehnung auftraten.

Embryonen, die GFP und motorische Neuronen exezieren, wurden abgebildet, um die Entwicklung des motorischen Neuronens zu visualisieren. Die motorischen Neuronaxone sprießen aus dem ventralen Neuralrohr über die Sods zur ventralen Seite des Embryos. Die Ko-Entwicklung des dorsalen Keimens von motorischen Neuronaxonen in Bezug auf die Position der intersegmentalen Gefäße wurde mit einer höheren Vergrößerung abgebildet.

Dies ermöglichte es, die feineren Details des ventralen Axons, das aus dem Neuralrohr sprießen, sowie des dorsalen Axons zu visualisieren. Mit zunehmender Zahl verlängern sich die Soden auch in Länge und Breite. Dieser Prozess wurde mit transgenen Embryonen abgebildet, die GFP in den Muskeln exzessizieren.

Da die optimale Konzentration von Agarose sehr gering ist, ist sie bei der Herstellung der Vorratslösung von Agarose sehr empfindlich gegenüber kleinen Messschwankungen und muss für jede neue Charge von Agarose-Lösung neu definiert werden. Es ist wichtig, die bildgebenden Parameter wie Bildgröße und -auflösung, Scangeschwindigkeit, Zoom, Hochspannung des Detektors und Laserleistung sorgfältig einzustellen, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu gewährleisten und auch die Möglichkeit von Fototoxizität und Fotobleiche während der Langzeitzeitraffis-Bildgebung zu reduzieren. Mit dieser Montagemethode für transgene Zebrafischembryonen, gefolgt von einer erweiterten Zeitraffer-Bildgebung des gesamten Organismus, können wir visualisieren, wie sich verschiedene Gewebe zusammen entwickeln.