Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Die zellfreie Proteinsynthese ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie für die In-vitro-Produktion von Proteinen. Zellfreie Proteinsynthesesysteme haben keine Zellwand, so dass wir direkten Zugang zu Metaboliten haben. In diesem Protokoll quantifizieren wir die absoluten Messungen von 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt sind, was es uns ermöglicht, den zellfreien Stoffwechsel zu charakterisieren.

Das Protokoll beruht auf der Metastasierung der Verbindungen mit Aniline, was eine bessere Trennung und eine höhere Massenspektrometrieauflösung ermöglicht. Darüber hinaus verwenden wir interne Standards mit einem Isotop, das wir aniline kennzeichnen, für die absolute Quantifizierung der Metaboliten. Die markierten Metaboliten coelute, die die Auswirkungen der Eisenunterdrückung eliminiert.