Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
25. Oktober 2019
Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.
Die zellfreie Proteinsynthese ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie für die In-vitro-Produktion von Proteinen. Zellfreie Proteinsynthesesysteme haben keine Zellwand, so dass wir direkten Zugang zu Metaboliten haben. In diesem Protokoll quantifizieren wir die absoluten Messungen von 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt sind, was es uns ermöglicht, den zellfreien Stoffwechsel zu charakterisieren.
Das Protokoll beruht auf der Metastasierung der Verbindungen mit Aniline, was eine bessere Trennung und eine höhere Massenspektrometrieauflösung ermöglicht. Darüber hinaus verwenden wir interne Standards mit einem Isotop, das wir aniline kennzeichnen, für die absolute Quantifizierung der Metaboliten. Die markierten Metaboliten coelute, die die Auswirkungen der Eisenunterdrückung eliminiert.
Ermöglicht die genaue Quantifizierung der Verbindungen. In einer Haube arbeiten, kombinieren 550 Mikroliter der Aniline, mit 337,5 Mikroliter LC-MS-Grade Wasser. Und 112,5 Mikroliter 12 Molsalzsäure in einem Zentrifugenrohr.
Vortex gut, und speichern Sie die sechs Mol aniline Lösung bei pH 4,5 und vier Grad Celsius. Zur Herstellung einer sechs mollaren Carbon-13-Aniinlösung bei pH 4,5 werden 250 Milligramm Kohlenstoff-13-Aniin mit 132 Mikroliter Wasser und 44 Mikroliter 12 Molsalzsäure kombiniert. Vortex gut, und lagern bei vier Grad Celsius.
Um 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung vorzubereiten, lösen Sie zwei Milligramm EDC in 10 Mikroliter Wasser für jede Probe, die getaggt werden soll. Und Wirbel gut. Um Proben zuzubereiten, löschen und fällen Sie die Proteine in einer zellfreien Proteinsynthesereaktion, indem Sie der zellfreien Synthesereaktion ein gleiches Volumen eiskaltes 100%Ethanol hinzufügen.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 12 000 mal g, für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand der Probe in ein neues Zentrifugenrohr. Um die Probe mit Carbon-12-Anilinelösung zu kennzeichnen, übertragen Sie sechs Mikroliter der Probe in ein neues Zentrifugenrohr und bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 50 Mikroliter.
Fügen Sie 5 Mikroliter von 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung hinzu, mischen Sie die Carbon-12-Aniinlösung gut und übertragen Sie 5 Mikroliter in die Röhre. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach zwei Stunden die Rohre vom Shaker entfernen und in eine Dunstabzugshaube geben.
Fügen Sie 1,5 Mikroliter Triethylamin zu jeder Reaktion hinzu, um die Aniline-Tagging-Reaktion zu stoppen und die Verbindungen zu stabilisieren. Zentrifuge bei 13, 500 mal g für drei Minuten. Und den Überstand retten.
Um die internen Standards mit Carbon-13-Aniline-Lösung zu kennzeichnen, verdünnen Sie die interne Lagerlösung auf 80 Mikromolar mit einem Endvolumen von 50 Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter der 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung und fünf Mikroliter der gut gemischten Carbon-13-Aniinlösung hinzu. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Nach zwei Stunden, entfernen Sie die Rohre aus dem Shaker, und fügen Sie 1,5 Mikroliter Triethylamin zur Reaktion in einer Rauchhaube. Zentrifuge bei 13, 500 mal g für drei Minuten und den Überstand speichern. Um den getaggten internen Standard und die getaggte Probe zu göttlich zu machen, mischen Sie jeweils 25 Mikroliter in einer Autosampler-Durchstechflasche.
Und analysieren Sie nach dem LC-MS-Verfahren. Um dann eine Standardkurve für nicht getaggte Metaboliten zu erstellen, verdünnen Sie zunächst die Stammlösung von nicht markierten Metaboliten auf verschiedene Konzentrationen mit einem Volumen von 50 Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter der 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung und fünf Mikroliter Kohlenstoff-12-Aniinlösung zu jeder Konzentration hinzu.
Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Und fahren Sie mit der Triethylamin-Behandlung fort. Und Zentrifugalisierung vor der Analyse durch die LC-MS wie bisher.
Nach der Initialisierung von LC-MS, gemäß den Anweisungen des Herstellers, injizieren Sie fünf Mikroliter der Probe in die Säule. Und erwerben Sie die entsprechenden m über z Ionenintensitäten für die Carbon-12-Aniin-getaggte Probe. Dann injizieren Sie fünf Mikroliter der gleichen Probe erneut.
Und erwerben Sie die m over z Ionenintensitäten für die Carbon-13 Aniline-markierten Standards. In diesem Protokoll wurden Metaboliten, die grünes fluoreszierendes Protein in einer E.coli-basierten zellfreien Proteinsynthese exdrücken, quantifiziert. 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt waren, wurden anhand interner Standards nachgewiesen und quantifiziert.
Während eine Standardkurve für fünf der Metaboliten, die nicht mit Aniline markiert wurden, ebenfalls entwickelt wurde. Die verschiedenen Metaboliten, die an diesen Bahnen beteiligt waren, waren eine Klasse von phosphorylierten Zuckern, Phospho-Carbonsäuren, Carbonsäuren, Nukleotiden und Co-Faktoren. Darüber hinaus ermöglichte das Verfahren die Trennung von strukturellen Isomerpaaren wie Glucose-Sechsphosphat und Fructose-sechs Phosphat in einem einzigen LC-MS-Lauf.
Der wichtigste Schritt ist die Kennzeichnung der entproteinisierten Probe mit Aniline. Da sich die aniline Lösung trennt, ist es wichtig, schnell und effektiv zu arbeiten und dabei gute Sicherheitspraktiken beizubehalten. Diese Methode hilft, den zellfreien Stoffwechsel mit der Quantifizierung von 40 Metaboliten zu charakterisieren.
Aber, zusätzliche Verbindungen sind in der zellfreien Mischung, wie Aminosäuren, die quantifiziert werden können. Dies würde helfen, einen umfassenderen Blick in den zellfreien Stoffwechsel zu bieten. Diese Methode zeigte, dass zellfreie Systeme komplexe Stoffwechselhaben haben, die immer noch in Betrieb sind und potenziell für eine bessere Energieeffizienz und Kohlenstoffausbeute genutzt werden können.
Das Protokoll beruht auf der Kennzeichnung der Verbindungen mit Aniin mit der Verwendung von EDC als Katalysator. Beide Reagenzien sind gefährlich und sollten mit Vorsicht angewendet werden.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung von 40 Metaboliten, die an dem zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel während der proteinfreien Proteinsynthese beteiligt sind. Durch die Verwendung von Anilin zur Derivatisierung verbessert das Protokoll die Trennung in der umgekehrten Phasen-Flüssigkeitschromatographie und setzt Massenspektrometrie zur genauen Quantifizierung ein.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Proteinsynthese ohne Zellen
- Metabolomik
- Massenspektrometrie
Hintergrund
- Die proteinfreie Proteinsynthese ermöglicht direkten Zugang zu Metaboliten.
- Das Verständnis des zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsels ist entscheidend für die Charakterisierung zellfreier Systeme.
- Die Derivatisierung mit Anilin verbessert Trennung und Auflösung bei der Analyse.
- Isotopisch markierte interne Standards erleichtern die absolute Quantifizierung.
Zweck der Studie
- Quantifizierung von Metaboliten, die an der zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt sind.
- Verbesserung des Verständnisses zellfreier Stoffwechselprozesse.
- Bereitstellung eines robusten Protokolls für Forschende in der synthetischen Biologie.
Verwendete Methoden
- Ableitung von Metaboliten mit Anilin.
- Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie zur Trennung.
- Massenspektrometrie zur Quantifizierung unter Verwendung isotopenmarkierter Standards.
- Koelution markierter Metaboliten zur Minimierung von Ionensuppressionseffekten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Quantifizierung von 40 Metaboliten.
- Verbesserte Trennung und Auflösung in der Massenspektrometrie.
- Effektive Eliminierung von Ionsuppressionseffekten durch Coelution.
- Einrichtung eines zuverlässigen Protokolls für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine umfassende Methode zur Quantifizierung von Metaboliten.
- Es vertieft das Verständnis metabolischer Wege in zellfreien Systemen.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf verschiedene Projekte der synthetischen Biologie erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung zentraler Kohlenstoff- und Energiestoffwechselprodukte in der proteinfreien Zellsynthese ermöglicht eine vorhersagende Bewertung der Systemleistung, Ausbeute und Energieeffizienz. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Risikominderung zellfreier Plattformen für die bedarfsgerechte Herstellung von Biologika, indem metabolische Engpässe und Cofaktorlimitierungen identifiziert werden. Die Methode liefert translationsrelevante, biomarkerähnliche metabolische Messgrößen, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der frühen Entdeckungs- und präklinischen Entwicklungsphase unterstützen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem der Metabolitenfluss mit der Proteinsyntheseleistung in zellfreien Systemen verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Bietet eine quantitative metabolische Profilierung, um die Zielvalidierung durch Klärung von Wirkwegen und funktionelle Bewertung risikoärmer zu gestalten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht eine standardisierte, reproduzierbare Quantifizierung von 40 Metaboliten, um die Assay-Eignung für zellfreie Screening-Plattformen zu unterstützen.
- Operationaler Wert: Erleichtert hochdurchsatzfähige LC/MS-Arbeitsabläufe mit 10-Minuten-Läufen und ermöglicht dadurch ein skalierbares Metaboliten-Screening unter verschiedenen Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die metabolische Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung charakterisiert wird.
- Operationaler Wert: Erzeugt Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Lead-Substanzen, indem die metabolische Effizienz mit Proteinausbeute und Produktivität verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie Stoffwechsel-Flussdaten bereitstellt, die die Zielstrukturauswahl und die Optimierung von Wegen vor der Identifizierung von Leitverbindungen unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Stoffwechselwegen durch absolute Quantifizierung von Intermediaten der Glykolyse, des TCA-Zyklus und des Pentosephosphatwegs.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch Normalisierung auf interne Standards und Eliminierung ionensupprimierender Effekte mittels Co-Elution.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen abhängiger Variablen (Metabolitkonzentrationen über 2–3 Größenordnungen), die einen Vergleich zwischen Bedingungen und eine statistische Auswertung ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem metabolische Referenzgrößen für Energieeffizienz und Kohlenstoffausbeute in zellfreien Systemen etabliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, auf LC/MS basierende Metabolomik-Plattform zur wiederholten Charakterisierung zellfreier Bedingungen über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit der Leistung von zellfreien Systemen durch umfassende metabolische Kartierung und Verringerung mechanistischer Unschärfen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch interne Standardkorrektur und schnelle chromatographische Durchläufe innerhalb von 10 Minuten.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und reduziertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige Identifizierung metabolischer Limitierungen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf quantifizierbaren Parametern des Energiestoffwechsels und der Cofaktorregenerierung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Derivatisierung von Metaboliten, der Bedienung von LC/MS sowie im Umgang mit gefährlichen Reagenzien (Anilin, EDC, HCl).
- Setzt eine Infrastruktur für umgekehrte Phasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie mit Elektrospray-Ionisationsfähigkeit voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probeninaktivierung, Proteinfällung und Derivatisierungszeitpunkten, um eine korrekte Mitelution und genaue Quantifizierung sicherzustellen.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die Erweiterung der Methode auf Aminosäuren und andere nicht-zentrale Kohlenstoffmetaboliten, die in zellfreien Gemischen vorkommen.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Notwendigkeit einer sorgfältigen pH-Kontrolle während der Derivatisierung sowie in möglichen Störungen durch komplexe Probenmatrizes, trotz Maßnahmen zur Minderung der Ionenunterdrückung.
