Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Die umlaufende Ösophagusreparatur ist in einem Rattenmodell technisch anspruchsvoll und erfordert die Entwicklung einer gewebegefertigten Speiseröhre, die die Regeneration von Speiseröhrenschleimhaut und Muskel ohne Ösophagus-Anastomose-Leckage ermöglicht. Als Pilotmodell haben wir ein zweilagiges Röhrengerüst implementiert, das aus innerer Nanofaser und einem äußeren 3D-Druckstrang in Verbindung mit einer mikrovaskulären Anastomose besteht, um Speichellecks nach der Transplantation zu minimieren. Herkömmliche Standard-Ösophader-Rekonstruktion ist mit einer Vielzahl von Komplikationen und Morbidität verbunden.

Daher kann Diesophagus-Gewebetechnik eine vielversprechende Alternative zur Entwicklung von Native-Patienten-Ösophagusmodellen sein. Die Kombination aus Hybridgerüst, Bioreaktoranbau und einem oralen Ernährungssystem kann auf jedes System angewendet werden, das eine ähnliche kontaminierte Umgebung mit seinem kontinuierlichen mechanischen Druck hat. Beginnen Sie mit der Sterilisation eines 3D-gedruckten Speiseröhrengerüsts mit einer einstündigen Exposition gegenüber ultraviolettem Licht, einem 10-minütigen Einweichen in Ethanol und drei Wärjahren mit PBS.

Nach der letzten Wäsche das zweilagige Röhrengerüst in eine nicht haftende 24-Well-Gewebekulturplatte geben und sanft, aber gleichmäßig ein mal 10 zu den sechs adipose-abgeleiteten humanen mesenchymalen Stammzellen pro Milliliter Kellermembranmatrix hinzufügen, ergänzt mit Wachstumsmedium zur inneren Oberfläche des Gerüstes. Verwenden Sie ein pulsatiles Durchfluss-Bioreaktorsystem, um das zellsaatierte Rohrgerüst fest am Acrylhalter in der Kulturkammer des Bioreaktors zu fixieren und 500 Milliliter Wachstumsmedium in die Kammer zu geben. Dann 1 Dyne pro Zentimeter quadratisch strömungsinduzierte Scherspannung unter einer feuchten Atmosphäre anwenden, die 5% Kohlendioxid enthält.

Verwenden Sie nach fünf Tagen ein LIVE/DEAD Viability Assay Kit, um die Zellreaktionen auf der innenoberfläche des Gerüsts nach Standardprotokollen zu bestimmen und die Zellen durch konfokale Mikroskopie abzubilden. Vor Beginn des chirurgischen Eingriffs bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex in der anästhesierten Ratte, und legen Sie das Tier in die Rückenlage auf einem sterilen Vorhang. Verwenden Sie Clipper, um das Haar von der chirurgischen Stelle zu entfernen, und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit sequenziellen BETADINE und 70% Ethanol Peelings.

Für T-Rohr Platzierung, machen Sie einen Mittellinien-Haut- und Muskelschnitt im Bauch der Ratte, und verwenden Sie eine Skalpellklinge, um eine Drei-Millimeter-Öffnung in der vorderen Magenwand zu erstellen. Setzen Sie die Spitze eines Silikon-T-Rohrs in die Defektstelle ein, um sie an der Magenwand zu befestigen, und verschließen Sie das Rohr vorsichtig an das Magenmuskelgewebe. Besaugen Sie die Bauchwand mit 4-0 VICRYL Naht.

Setzen Sie vorsichtig das distale Ende des implantierten T-Rohrs durch den subkutanen Tunnel in den Nacken ein und verwenden Sie einen Angiokatheter, um eine Heparinkappe an das Ende des T-Rohrs anzuschließen, um zu verhindern, dass der Mageninhalt rückwärts fließt. Wenn die Kappe an Ort und Stelle ist, verwenden Sie 4-0 Polyglactin Nähte, um alle Schichten der Bauchhaut zu schließen, und legen Sie die Ratte in einen Stoffwechselkäfig mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Eine Woche nach der T-Rohrplatzierung bereiten Sie die Ratte wie gezeigt auf eine Operation vor.

Stellen Sie die Ratte unter das Mikroskop und machen Sie einen vorderen medialen Halsschnitt in der exponierten desinfizierten Haut. Trennen Sie die Riemenmuskeln, um die tracheoesophageale Struktur freizulegen. Isolieren Sie die linke Seite der Speiseröhre von der Luftröhre.

Trennen Sie vorsichtig den oberen Teil der Speiseröhre von der Schilddrüse und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen fünf Millimeter langen vollständigen Umfangsfehler zu erstellen, der alle Schichten der Speiseröhre enthält. Als nächstes legen Sie eine 9-0 Naht zwischen dem rechten inferoposterior Rand der oberen Speiseröhre Rest und Gerüst, und weiterhin naht von rechts nach links zwischen der oberen Speiseröhre Rest und das Gerüst, um eine Mikroanastomose am oberen Ende des distalen Ösophagusdefekt zu schaffen. Dann anastomose das Gerüst in der gleichen Weise wie der obere Rand der unteren Speiseröhre Rest.

Wenn die Anastomosen fertig sind, legen Sie die umgebende Schilddrüsenklappe über die transplantierte Stelle, um eine gefäßvaskuläre Versorgung und eine stabile Wartung des Transplantats zu gewährleisten. Dann nähen Sie den subkutanen Muskel und das Hautgewebe mit einer 4-0 VICRYL Naht, und legen Sie die Ratte in einen Stoffwechselkäfig auf einem Infrarot-Wärmegerät mit Überwachung bis zur vollen Resüonität. Nach einer gleichmäßigen Anwendung auf die Innenwand des Gerüstes mittels Injektion demonstriert die humane mesenchymale Stammzell-eingebettete Kellermembranmatrix die erwartete mesenchymale Stammzellmorphologie, die durch Rasterelektronenmikroskopie beurteilt wird.

Nach der Ösophaarterientransplantation in Ratten mit vollen umlaufenden Ösophariendefekten, wie gezeigt, wird das Transplantat mit einer Schilddrüsenklappe für eine stabile Fixierung und Gefäßversorgung der implantierten Stelle bedeckt. Die ösophaal transplantierten Ratten bleiben bei 340 Gramm bis etwa neun Tage nach dem Eingriff, an dem die Tiere schnell abnehmen aufgrund verschiedener Ursachen, was zum Tod am Tag 15. Obwohl die meisten Ratten nicht-ösophageale Obstruktion durch Haarbälle verursachen, gibt es insgesamt keine groben Beweise für Perforation, Anastomose-Leckage mit Fistel, Serom-Akkumulation, Abszessbildung, oder umgebende Weichgewebe-Nekrose bei jedem Versuchstier.

Eine Reepithelisierung der Transplantationsstelle kann durch Immunfluoreszenzfärbung für Keratin bestätigt werden, und die regenerierte Kollagenschicht und die Elastinfasern können durch Massons Trichromfärbung deutlich beobachtet werden. Die Regeneration der Ösophalie-Muskelschicht wird auch durch eine reichliche Neovaskularisation belegt, die durch eine immunhistochemische Analyse desmin beurteilt wird. Der Erfolg dieses Verfahrens beruht auf der stabilen Wartung des T-Rohrs durch Fixierung hinter dem Hals, um die Ernährung während der Ösophale Rekonstruktion zu gewährleisten.

Um die für dieses Verfahren typische frühe Sterblichkeit zu überwinden, könnte nach der Ösophawälimplantation eine organoide oder frühe Vaskularisationstechnologie eingesetzt werden, um die funktionelle Ösophatolrekonstruktion zu unterstützen.