Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development
29. Oktober 2019
Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.
Die C.elegans embryogenese dauert etwa 13 Stunden und wird in der Regel durch Das Filmen eines Embryos nach dem anderen überwacht. Unser Protokoll ermöglicht jedoch die gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung von 80 bis 100 Embryonen. Die Möglichkeit, Daten für eine große Anzahl von sich entwickelnden C.elegans-Embryonen zu sammeln, eröffnet eine neue Reihe von Experimenten, einschließlich der quantitativen Analyse von Entwicklungsereignissen und Großbildschirmen.
Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um verschiedene Entwicklungsprozesse zu erfassen oder Embryonen abzubilden, die eine beliebige Kombination von Markern in geweben von Interesse ausdrücken. Es ist eine Herausforderung, die Embryonen in den Brunnen richtig zu zerstreuen. Sie sollten dicht beieinander liegen, um die Erfassung mehrerer Embryonen pro Feld zu ermöglichen, ohne in verschiedenen Z-Ebenen zu verklumpen.
Wir empfehlen, zwei Forscher für die Seitenzerlegung, auf Eis und das Absperren ungenutzter Brunnen zu verwenden. Wir werden auch einige nützliche Tricks zeigen, um schnell eine gut inszenierte 384-Well-Platte einzurichten. Beginnen Sie mit dem Abdichten einer 384-Well-Platte mit PCR-Klebefolie, um ungenutzte Brunnen zu maskieren.
Verwenden Sie ein Rasiermesser oder Skalpell, um die Folie zu schneiden, um eine Teilmenge der Brunnen für den Einsatz freizulegen. 70 Mikroliter frisch zubereiteten TMHC in jeden Brunnen geben und die Platte auf Eis halten. Schließen Sie die äußeren beiden Reihen der Platte aus, um Kanteneffekte zu verhindern.
Für eine schnelle Probenvorbereitung wird eine Seiten-an-Seite-Sektion von zwei Forschern empfohlen. Wenn die gesamte Lösung plattiert ist, verwenden Sie eine feine Pinzette und ein Seziermikroskop, um etwa 10 gravid Erwachsene in 150 Mikroliter eiskalter TMHC-Lösung innerhalb eines Depressionsschlittens pro Zustand zu übertragen. Mit der Pinzette und einem Skalpell sezieren Sie die Würmer, um die Embryonen freizusetzen und eine gezogene Kapillarpipette in einen Mundsauger zu laden.
Verwenden Sie die Mundpipette, um alle zwei- bis achtzelligen Stadium-Embryonen in einzelne Brunnen der vorbereiteten Platte zu übertragen und die Platte zu untersuchen, um zu bestätigen, dass keine Aggregate in irgendwelchen Brunnen vorhanden sind. Wenn alle Embryonen gesammelt wurden, legen Sie die Proben durch Zentrifugation ab und verwenden Sie ein mit Ethanol getränktes Tuch, um Rückstände vom Boden der Platte zu entfernen. Legen Sie die Platte in den Plattenhalter eines konfokalen Mikroskops, das mit einer temperaturgeregelten Umgebung ausgestattet ist, und verwenden Sie das 10X-Objektiv, um einen Vorscan jedes Brunnens durchzuführen, um Felder mit geeigneten Embryonen zu identifizieren.
Wechseln Sie am Ende des Scans zum 60X-Objektiv, passen Sie die Brennebene an jedem Punkt auf Bild eins bis vier Felder pro Bohrwert an und erfassen Sie 18 Z-Abschnitte in zwei Mikrometerintervallen alle 20 Minuten für 10 Stunden. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, führen Sie einen niedrigen, ganzen, gut hellen Feldscan durch, etwa 20 bis 24 Stunden nach Dem Beginn der nächtlichen Bildgebung, um die embryonale Letalität zu bewerten. Für das automatisierte Zuschneiden mit embryoCropUI ausführbar, laden Sie zuerst das Programm von Zenodo und die Testdateien.
, um festzustellen, ob das Programm auf der Plattform ordnungsgemäß funktioniert. Nach dem Herunterladen entpacken und navigieren Sie, um die ausführbare Datei embryoCropUI zu finden, und doppelklicken Sie, um das Programm zu starten. Wählen Sie öffnen aus, um das erste spezifische 4D-Ansichtsfeld zum Zuschneiden zu laden.
Wenn Sie eine TIFF-Serie mit mehreren Dimensionen zuschneiden, laden Sie nur das erste Bild der Serie innerhalb des Ordners. Wenn alle Bilder geladen wurden, geben Sie die Bildparameter an, wählen Sie Die Hintergrundsubtraktion und Dämpfungskorrektur aus, und legen Sie die Reihenfolge der Bildsammlung und die Mikrometer pro Pixel fest. Wählen Sie dann ausführen aus, ein neuer Zuschneidewert mit der Bezeichnung "Unterordner" wird im gleichen Pfad wie der nicht zugeschnittene Ordner erstellt, und die zugeschnittenen Versionen werden an diesem Speicherort gespeichert.
Für die Visualisierung, laden Sie die offene und kombinierte MSV2 ImageJ Plugin und grafische BenutzeroberflächenAnweisungen Zenodorepov2. docx von Zenodo und öffnen Sie das Plugin in IMageJ. Suchen Sie die Zeilen drei und vier, und geben Sie den Speicherort ein, an dem die Bildordner nach dem Zuschneiden gespeichert werden.
Die Bildordnernamen der zu verarbeitenden Bedingungen und der eindeutige alphanumerische Bezeichner für jedes Nachtexperiment. Wenn alle Informationen eingegeben wurden, klicken Sie auf Ausführen. Es wird ein Fenster angezeigt, das eine Aufforderung zum Navigieren in den äußeren Ordner mit den zugeschnittenen Bildordnern startet.
Sobald ausgewählt, wird ein anderes Fenster angezeigt, das die Angabe der Bildparameter ermöglicht. Klicken Sie auf okay. Die zusammengesetzte Datei beginnt mit der Montage.
Wenn der Verbund generiert wurde, überprüfen Sie die geöffneten Dateien. In Verbindung mit benutzerdefinierten Reporterstämmen werden informative Auslesungen für die meisten wichtigen Entwicklungsereignisse angezeigt. Einschließlich Sulfatspezifikation, dorsale Interkalation, epidermale skalianische skalianische, Dehnung und Neurogenese.
24 Stunden nach der Injektion ist ein optimaler Zeitpunkt für die Bildgebung. Ab diesem Zeitpunkt sind die erschöpfung des mütterlichen Proteins und die Hemmung der zygotischen Genexpression wirksam und liefern unterschiedliche, hoch reproduzierbare Signatur-Phänotypen über ein breites Spektrum von Genen, die an der Sulfatspezifikation und Morphogenese beteiligt sind. Es ist wichtig, während der Sezieren und Embryo-Selektionsschritte geduldig zu sein.
Die Minimierung des Klumpens und die Auswahl der geeigneten Brennebenen sind ebenfalls unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten. Unser Protokoll kann mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Markerstämmen und in Kombination mit RNAi oder Mutanten durchgeführt werden. Unsere Verarbeitungswerkzeuge ermöglichen eine optimierte, automatisierte oder manuelle Datenanalyse.
Mit den hier beschriebenen Stämmen, Methoden und Werkzeugen führte unsere Gruppe einen RNAi-basierten Bildschirm mit hohem Gehalt durch, der auf etwa 2 000 Gene abzielte, die für die embryonale Entwicklung benötigt wurden. Für dieses Projekt waren halbhohe Durchsatzmethoden unerlässlich.
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Übersicht
Diese Arbeit beschreibt ein halb-hochdurchsatzfähiges Protokoll, das die simultane 3D-Zeitraffer-Aufnahme der Embryogenese in 80–100 C. elegans-Embryonen in einem einzigen, über Nacht laufenden Durchgang ermöglicht. Die Möglichkeit, Daten von einer großen Anzahl sich entwickelnder C. elegans-Embryonen zu sammeln, eröffnet eine neue Bandbreite an Experimenten, einschließlich der quantitativen Analyse von Entwicklungsereignissen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Die Embryogenese von C. elegans dauert etwa 13 Stunden.
- Herkömmliche Methoden beinhalten die Aufnahme eines Embryos zur Zeit.
- Durch gleichzeitige Bildgebung wird eine umfassendere Datensammlung ermöglicht.
- Spezielle Reportersorten können für eine detaillierte Überwachung verwendet werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Hochdurchsatz-Bildgebung von C. elegans-Embryonen.
- Ermöglichung der quantitativen Analyse von Entwicklungsprozessen.
- Unterstützung von groß angelegten Untersuchungen der embryonalen Entwicklung.
Verwendete Methoden
- Semihochdurchsatz-3D-Zeitrafferaufnahmeprotokoll.
- Bildverarbeitungs- und Visualisierungswerkzeuge zur Datenanalyse.
- Spezielle Reportersysteme zur Überwachung bestimmter Entwicklungsmerkmale.
- Anpassung des Protokolls für verschiedene Entwicklungsprozesse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche simultane Bildgebung von 80–100 Embryonen.
- Vereinfachte Datenanalyse durch benutzerdefinierte Werkzeuge.
- Verbesserte Fähigkeit, die Embryogenese detailliert zu überwachen.
- Potenzial zur Anpassung an unterschiedliche experimentelle Anforderungen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll erhöht die Effizienz von Embryogenesestudien erheblich.
- Es erschließt neue Ansatzpunkte für die quantitative Analyse in der Entwicklungsbiologie.
- Zukünftige Anwendungen könnten verschiedene Entwicklungsprozesse und Markerkombinationen umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der semi-hochdurchsatzfähigen 3D-Bildgebung der Embryogenese von C. elegans wird eine quantitative, multiplexfähige Analyse von Entwicklungsphänotypen unter verschiedenen genetischen oder experimentellen Bedingungen ermöglicht. Diese Fähigkeit beschleunigt die frühe Entdeckung, indem sie groß angelegte, parallelisierte Hypothesentests und die Reduzierung mechanistischer Unsicherheiten in der Entwicklungsbiologie unterstützt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit und verbessert die Auswahl von Projekten bei der Untersuchung von Genfunktionen und Signalwegen in der präklinischen Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die systematische Untersuchung der Genfunktion während der embryonalen Entwicklung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch die Visualisierung phänotypischer Ergebnisse bei unterschiedlichen genetischen Störungen.
- Erleichtert Screenings mit hohem Informationsgehalt zur Zielvalidierung und zur Abbildung von Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte, multiplexierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Workflows vor.
- Standardisiert die Bildgebung und Datenverarbeitung für reproduzierbare, quantitative Ergebnisse.
- Ermöglicht eine skalierbare, parallele Evaluierung von Gen-Knockdowns oder Wirkstoffeffekten.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt phänotypische Messgrößen mit krankheitsrelevanten Entwicklungsprozessen, wenn aussagekräftige Reportersysteme verwendet werden.
- Gewährleistet einen nahtlosen Übergang von der genetischen Entdeckung zur Validierung präklinischer Modelle.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung auf Grundlage robuster, quantitativer Phänotypisierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Ablauf für Bildgebung und Analyse verbindet die frühe Entdeckung, den Screening-Prozess und die präklinische Validierung, indem er eine multiplexe, quantitative Phänotypisierung in einem Modellorganismus-System ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen mithilfe bildbasierter, parallelisierter Analysen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die sich für großangelegte genetische oder Wirkstoff-Screenings eignen.
- Analytik: Bietet automatisierte Werkzeuge zur Bildzuschnitterstellung, Ausrichtung und Visualisierung zur standardisierten Datenanalyse.
- Translationale Forschung: Verbindet Entwicklungsphänotypen mit biologischen Prozessen, die für Krankheiten relevant sind, sofern geeignete Marker verwendet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform für Bildgebung und Analyse, die an unterschiedliche experimentelle Anforderungen und genetische Hintergründe angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Untersuchung der Genfunktion in der Entwicklung.
- Operationaler Wert: Beschleunigt die Datenerfassung, -verarbeitung und -visualisierung für Hochdurchsatzexperimente.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen und eine effizientere Kapitalnutzung, indem robuste, skalierbare phänotypische Screenings unterstützt werden.
- Portfolio-Wirkung: Erleichtert die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und Signalwegen für die weitere Entwicklung.
Durchführungsaspekte
- Benötigt eine Mikroskopie-Infrastruktur mit Punkte-Scanning-Funktion und Temperaturregelung.
- Setzt Fachkenntnisse in der Handhabung von Embryonen, der Bildgebung und den Workflows zur Datenanalyse voraus.
- Profitiert von einer standardisierten Festlegung der Bildgebungsparameter und Datenverarbeitungsprotokolle über Teamgrenzen hinweg.
- Kann an verschiedene fluoreszierende Markersorten und genetische Hintergründe angepasst werden.
- Hängt von einer sorgfältigen Probenvorbereitung ab, um das Verklumpen von Embryonen zu vermeiden und die Datenqualität sicherzustellen.
