Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Organoide des menschlichen Gehirns sind ein wichtiges Werkzeug, um Krankheiten in einem System zu untersuchen, das leicht manipuliert werden kann und eine menschliche Einstellung und die entsprechende Interaktion mehrerer Zelltypen beinhaltet. Diese Technik kann angewendet werden, um zahlreiche Erkrankungen des Gehirns zu studieren, einschließlich Neuroentwicklungsstörungen, toxische Beleidigungen, und das Wachstum und die Behandlung von Krebs im Gehirn. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Fähigkeit, hoch reproduzierbare Gehirnorganoide mit einer Vielzahl von neuronalen Zelltypen zu erzeugen.

Dies geschieht mit einem sehr vereinfachten Workflow, der von den meisten Laboratorien durchgeführt werden könnte. Und diese werden in einer vorübergehend geeigneten Weise ohne den Einfluss von spezialisierten Wachstumsfaktoren oder undefinierten Matrizen hergestellt, was es zu einem sehr einfachen und kostengünstigen System macht. Kombinieren Sie zunächst 100 Mikroliter Matrix mit 5,9 Millilitereisis tudeniskalte Dulbeccos Modified Eagle Medium oder F12 Medien in einem 15 Milliliter konischen Rohr.

Beschichten Sie jeden Brunnen in einer Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter der Membranmatrix. Den Teller in Paraffinfolie wickeln und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Tag, aspirieren überschüssige Medien aus jedem Brunnen, spülen Sie die Brunnen mit F12, und fügen Sie H9 hESCS in einem Gesamtvolumen von zwei Milliliter mTeSR1 Medien pro Brunnen.

Kultur die Zellen von Woche zu Woche. Versorgen Sie täglich zwei Milliliter mTeSR1-Medien und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius niedrigen Sauerstoff-Inkubator mit 5% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid. Verwenden Sie Glaswerkzeuge, um Zellen von der Kultur zwischen den Passagen zu unterscheiden.

Aktualisieren Sie die Medien täglich. Zellen sollten vier bis sechs Tage vor der Verwendung der H9-Zellen für die organoide Produktion durchgehen. Um die Zellen zu durchdringen, beginnen Sie damit, sie mit DMEM F12-Medien zu spülen und die überschüssige Flüssigkeit zu aspizieren.

Nach dem Spülen prokubieren Sie protease-Lösung und inkubieren Sie die Zellen für 40 Minuten, damit Kolonien innerhalb des Brunnens schwimmen. Als nächstes waschen Sie die Zellen dreimal mit DMEM F12 und bei Bedarf Tittrat, um die Stücke zu verkleinern. Dann verteilen Sie die Zellen im Verhältnis von 1 zu acht auf vier Sechs-Well-Platten und legen Sie die Platten in den Inkubator und füttern Sie täglich.

Nach vier bis sechs Tagen erreichen die Zellen etwa 80% Konfluenz. Wechseln Sie sie zu einem regulären Inkubator. Verdünnen Sie die Protease-Stammlösung auf eine Arbeitskonzentration, indem Sie fünf Milliliter DMEM oder F12-Medium pro sechs-Well-Platte hESCS einen Milliliter der Stammlösung hinzufügen.

Aspirieren und entfernen Sie die Zellkulturmedien, dann decken Sie das hESCS mit der Protease-Lösung ab. Legen Sie die Platten in den Inkubator für 10 bis 15 Minuten oder bis die Ränder der Kolonien runden sich auf und beginnen, von der Matrix zu trennen, aber bevor sie vollständig aufrunden. Neigen Sie die Platte, aspirieren Sie die Proteaselösung und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit zwei Milliliter DMEM oder F12 für jeden Brunnen dreimal.

Stellen Sie sicher, dass die Kolonien an der Matrix befestigt bleiben. Daher ist es wichtig, dass die Teile der ES-Zellen in der entsprechenden Größe sind, also stellen Sie sicher, dass sie für die entsprechende Zeit in Dispase sind. Wenn sie zu kurz drin sind, kann es sehr schwierig sein, sie abzuspülen und auseinander zu brechen.

Und wenn sie zu lange drin sind, können sie tatsächlich nur während der Waschschritte aussteigen. Fügen Sie etwa ein bis 1,5 Milliliter frische mTeSR-Medien zu jedem Brunnen hinzu und spülen Sie die Zellen mit sanfter Pipettierung in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Aspirieren und dosieren Sie hESCS innerhalb der Platte, bis sie etwa 1/30 ihrer ursprünglichen Größe erreichen.

Heute ähneln die Koloniehaufen 250 bis 350 Mikrometer großen Stücken. Übertragen Sie die Zellen in einen einzigen ultraniedrigen T75-Kolben, der 30 Milliliter mTeSR-Medien ohne bFGF enthält. Am nächsten Tag kippen Sie den Kolben so, dass die lebenden Zellen in der Ecke poolieren.

Wenn es eine große Anzahl von Zellen gibt, die an der Unterseite des Kolbens haften geblieben sind, verwenden Sie eine 10 Milliliter Pipette, um die Zellen in einen neuen Kolben zu übertragen. Erwarten Sie eine hohe Population von abgestorbenen Zellen für die ersten paar Tage. Sobald sich die Zellen absetzen, aspirieren Sie die Medien und abgestorbene Zellen und hinterlassen etwa 10 Milliliter Medien, die die lebenden Zellen enthalten, und fügen Sie 20 Milliliter niedriger bFGF-Medien hinzu, die mit 30 Nanogramm pro Milliliter bFGF ergänzt werden.

Überprüfen Sie nach zwei Tagen die Zellen. Die meisten Zellen sollten gesund und hell aussehen. Wenn jedoch mehr als ein Drittel der Zellen dunkel erscheinen, kippen Sie den Kolben und ersetzen Sie 20 Milliliter Medien durch 20 Milliliter niedrige bFGF-Medien, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter bFGF.

Entfernen Sie am dritten Tag die Hälfte der Medien und ersetzen Sie sie durch 15 Milliliter hESC-Medien, die mit 10 Nanogramm pro Milliliter bFGF ergänzt werden. Ersetzen Sie am fünften Tag die Hälfte der Medien durch 15 Milliliter neuronaler Induktionsmedien. Danach, jeden zweiten Tag, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mit neuronalen Induktionsmedien.

Nach drei Wochen kultur, fügen Sie 100X Penicillin-Streptomycin in den Medien bei einer endgültigen Konzentration von 1X, wenn gewünscht. Erfrischen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte der Medien. In diesem Protokoll sahen die gebildeten Gehirnorganoide hell und ähnlich in der Größe ohne dunkle sterbende Zellen in den Zentren dieser Cluster aus.

Die Zellen wurden nach und nach von bFGF entwöhnt. Am fünften Tag wurden sie in neuronale Induktionsmedien versetzt und blieben während der gesamten Kulturzeit in diesen Medien. Obwohl die Organoide im Laufe der Zeit größer und damit dunkler wurden, dehnten sich die neuronalen Rosetten-ähnlichen Strukturen aus, was auf die Einleitung der neuronalen Differenzierung hindeutet und Merkmale des embryonalen Neuralrohrs enthält.

Um die Genexpression in den Zellen genauer unter die Lupe zu nehmen, wurde eine qPCR-Analyse durchgeführt. Der Glutamattransporter VLGUT1 wurde nach zweieinhalb Wochen ausgedrückt, stieg um fünf Wochen und blieb durch fünf Monate Kultur konstant. Ein Vorderhirn-Marker Foxg1 wurde auf niedrigem Niveau bis fünf Wochen in der Kultur ausgedrückt.

Der Tiefschichtmarker Tbr1 erreichte rund fünf Wochen und nahm danach ab. Während die Expression des oberen Schichtmarkers Satb2, des ventralen Markers Eng1, des Hinterhirnrückenmarks-Markers Hoxb4 sowie des Oligodendrozytenmarkers Olig2 im Laufe der Zeit zugenommen hat. Im Gegensatz dazu nahm der Stammzellmarker Sox2 im Laufe der Zeit ab.

Der Gleitmarker GFAP erreichte mit fünf Wochen seinen Höhepunkt und blieb danach relativ konstant. Denken Sie daran, die größte Sorgfalt beim Umgang mit ES-Zellen in frühen Phase Organoiden zu nehmen, um Kontamination zu vermeiden, da sie ohne Antibiotika angebaut werden und denken Sie auch daran, nach Zeitplan zu füttern. Nach diesem Verfahren können Sie die Organoide mit Techniken wie quantitativer RT-PCR für Genexpression und Immunfluoreszenz für die Proteinexpression und Lokalisation bewerten.

Mit dieser Technik konnten wir die Fähigkeit eines kleinen Moleküls untersuchen, Aspekte der menschlichen neonatalen hypoxischen Verletzung zu lindern, wie sie in einer Hypoxiekammer modelliert sind. Es ist bezeichnend, dass sich diese Organoide des menschlichen Gehirns ähnlich wie in vivo Mausexperimente verhielten.