Name: Erzeugung von Porcine Hodenorganoiden mit Testis-spezifischer Architektur mit Microwell-Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung von porcinen Hodenorganoiden mit testisspezifischer Architektur mittels Microwell-Kultur. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht Studien zur Hodenmorphogenese und Hochdurchsatz-Screenings.

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Diese Arbeit wurde von NIH/NICHD HD091068-01 an Dr. Ina Dobrinski unterstützt.

HINWEIS: Die Hoden von einwöchigen Ferkeln wurden von einer gewerblichen Schweinehaltung als Nebenprodukt aus der Kastration von Handelsschweinen gewonnen. Die Beschaffung von Hoden wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary genehmigt.
1. Herstellung von Enzymlösungen für die Gewebeverdauung
HINWEIS: Es werden drei verschiedene enzymatische Lösungen benötigt, die zwei verschiedene Kollagenase-IV-Lösungen (Lösung A, B) und eine Desoxyribonuklease-I-Lösung (DNase I) umfassen.
<ol><li>Um Lösung A vorzubereiten, lösen Sie 20 mg Kollagenase IV S (Materialtabelle) und 40 mg Kollagenase IV W (Materialtabelle) in 25 ml hochglukosen Dulbecco es Modified Eagle es Medium (DMEM). Anschließend wird der Filter mit einem 0,22-m-Filter sterilisiert. Fügen Sie 0,4 ml fetales Rinderserum (FBS) zu Lösung A hinzu, um die Trypsinaktivität zu hemmen.</li>
	<li>Um Lösung B vorzubereiten, lösen Sie 80 mg Kollagenase IV W (Materialtabelle) in 40 ml DMEM auf. Anschließend wird der Filter mit einem 0,22-m-Filter sterilisiert.</li>
	<li>Um DNase I Lösung (7 mg/ml) vorzubereiten, 70 mg DNase I in 10 ml DMEM auflösen. Anschließend wird der Filter mit einem 0,22-m-Filter sterilisiert. HINWEIS: Die hier beschriebene Enzymkonzentration für Kollagenase-IV-Lösungen unterscheidet sich von den im ursprünglichen Artikel14genannten Konzentrationen (2 mg/ml). Das aktuelle Protokoll ergibt Zellen mit etwas höherer Lebensfähigkeit. Jedoch, Zellen, die durch beide Protokolle isoliert produzieren Organoide mit identischer Gewebearchitektur.</li>
</ol>2. Testisgewebe enzymatische Verdauung
<ol><li>Die Hoden in ein steriles Becherglas einsammeln und mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) waschen, die 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält. Nach dem Waschen die Hoden auf eine 100 mm Gewebekulturschale mit PBS mit 1% P/S übertragen und die Tunika vaginalis und epididymis mit autoklavierter Schere und Zange entfernen. Die isolierten Hoden auf eine neue 100-mm-Schale übertragen und gründlich mit PBS mit 1% P/S waschen.</li>
	<li>Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, verwenden Sie einen anderen Satz steriler Schere und Zangen, um das Hodenparenchym aus der Tunika albuginea zu schälen. Schneiden Sie die Hoden entlang der Längsachse direkt unter der Tunika. Dann die Hoden mit zwei Zangen aus der Tunika schälen und in eine neue 100-mm-Schale mit 1 ml DMEM mit 1% P/S geben.</li>
	<li>Die geschälten Hoden mit steriler Schere in 1-2 mm Gewebestücke zerkleinern. Nach dem Hacken verwenden Sie sterile Zangen, um weiße Fragmente des Bindegewebes zu entfernen.</li>
	<li>Die gehackten Gewebestücke in Lösung A übertragen und auf 50 ml mit DMEM aufziehen, um eine Konzentration von 0,4 mg/ml für Kollagenase IV S (Materialtabelle) und eine Konzentration von 0,8 mg/ml für Kollagenase IV W (Materialtabelle)zu erhalten. Lösung A mit den Gewebeteilen 30 min in ein 37 °C-Wasserbad geben, die Röhrchen alle 5 min sanft umkehren und visuell auf die Freisetzung von DNA überprüfen.<ol>
<li>Fügen Sie 500 l DNase I hinzu, wenn frei schwebende DNA beobachtet wird. Nach 30 min zentrieren Sie das Rohr bei 90 x g mit Bremsen bei 25 °C für 1,5 min und entsorgen Sie den Überstand. HINWEIS: DNA würde als trübe Substanz erscheinen. Wenn die Röhren geschüttelt werden, setzen sich die Gewebestücke ab, während die DNA über Wasser bleiben würde.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie Lösung B in das Rohr und aufladen Bis zu 50 ml mit DMEM, um eine Konzentration von 1,2 mg/ml Kollagenase IV W (Materialtabelle) zu erhalten. Legen Sie das Rohr 30 min in ein 37 °C-Wasserbad und alle 5 min. das Rohr sanft umkehren. Fügen Sie 500 l DNase I hinzu, wenn frei schwebende DNA beobachtet wird.</li>
	<li>Nach 30 min zentrieren Sie das Rohr bei 90 x g mit Bremsen bei 25 °C für 1,5 min. Danach den Überstand entsorgen und einmal mit PBS mit 1% P/S waschen. HINWEIS: Die ausrangierten Überstande aus Lösung A und B enthalten in erster Linie interstitielle Zellen.</li>
	<li>Das Rohr mit PBS bis zu 50 ml aufladen. Sammeln Sie vorsichtig die Tubuli von oben und legen Sie sie in ein neues 50 ml Rohr. HINWEIS: Die großen unverdauten Gewebefragmente setzen sich schnell am Boden ab, während verdaute seminiferöse Tubuli in Suspension bleiben. Es sollten keine großen Gewebefragmente gesammelt werden. Dieses Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, bis die Lösung im Originalrohr fast klar ist und nur noch unverdaute Gewebefragmente verbleiben, die entsorgt werden können.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Tubuli bei 90 x g mit Bremsen bei 25 °C für 1,5 min und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie wieder frische PBS und Zentrifuge hinzu. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.</li>
	<li>Nach der letzten PBS-Wäsche den Überstand entfernen und die seminiferen Tubuli in 5 ml PBS wieder aussetzen. Dann 15 ml 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in die Tubuli geben. Legen Sie das Rohr in 37 °C Wasserbad und sanft alle 2 min invertieren. Wenn eine Menge frei schwebender DNA beobachtet wird, fügen Sie 500 l DNase I mit 5 ml DMEM hinzu.</li>
	<li>Bewerten Sie die enzymatische Verdauung von Tubuli an einzelnen Zellen unter dem Mikroskop (erst nach 5 min, dann alle 2 min). Wenn meist einzelne Zellen detektiert werden können, stoppen Sie die Reaktion mit 5 ml FBS und filtern Sie durch ein 70-m-Netz und dann durch ein 40-m-Netz. HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass die Kappen an den 50 ml-Rohren, die für die Verdauung verwendet werden (Lösung A, B und 0,25 % Trypsin-EDTA), ordnungsgemäß angezogen werden. Wenn eine Kontamination im Wasserbad ein Problem darstellt, kann Paraffinfolie um die Kappe gewickelt werden, um Sterilität zu gewährleisten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Einzelzellen bei 500 x g mit Bremsen bei 25 °C für 5 min, resuspendieren Sie im Anreicherungsmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) mit 5% FBS und 1% P/S) und zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Dies ist die Anfangszellenpopulation. Fixieren Sie 100 x 103 Zellen und führen Sie die Immunzytochemie für den Keimzellmarker UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) wie beschrieben12 durch und bestimmen Sie den Prozentsatz der Keimzellen in dieser Ausgangszellpopulation. HINWEIS: Keimzellmarker Promyelocytic Leukämie Zinkfingerprotein (PLZF)15 könnte auch als geeignete Alternative für UCHL1 verwendet werden. In der Anfangszellpopulation beträgt die erwartete Zellausbeute etwa 700-800 x 109/g Gewebe. Der Anteil der Keimzellen in dieser Zellpopulation sollte 4-5% betragen.</li>
	<li>Legen Sie etwa 20 x 106 dieser Ausgangszellpopulation in zwei ultraniedrige Aufsatz 100 mm Petrischalen (10 x 106 Zellen in 10 ml DMEM/F12 mit 1% P/S in jeder Schale) für 2 Tage in einem Gewebekultur-Inkubator (37 °C) , 5% CO2, 21% Sauerstoff). Führen Sie die Keimzellanreicherung mit den verbleibenden Zellen durch. HINWEIS: Um eine optimale Lebensfähigkeit und Zellqualität zu gewährleisten, während die Keimzellanreicherung und anschließende Quantifizierung stattfindet, wird die Ausgangszellpopulation in Kultur in ultra niedrigen Anhang Gewebekultur Gerichte für 2 Tage platziert.</li>
</ol>3. Keimzellanreicherung
HINWEIS: Das oben beschriebene Verfahren führt in erster Linie zu Sertoli-Zellen und Keimzellen. Unterschiedliche Haftungseigenschaften ermöglichen die Trennung von Sertoli-Zellen und Keimzellen durch Differentialbeschichtung.
<ol><li>Samen 20-25 x 106 Zellen der Ausgangszellpopulation pro 100 mm Gewebekulturschale in einem Gesamtvolumen von 8 ml Anreicherungsmedium (DMEM/F12 mit 5% FBS und 1% P/S) für Differentialbeschichtung. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator (37 °C, 5%CO2, 21%O2) und stellen Sie nach 1,5 h sicher, dass die Mehrheit der Sertoli-Zellen an der Platte befestigt ist.</li>
	<li>Sammeln und kombinieren Sie den Überstand (hauptsächlich keimzellenhaltiger) von 2 Platten zu einer neuen 100-mm-Platte und legen Sie ihn wieder in den Inkubator. Nach 1 h wieder den Überstand von 2 Platten zu einer neuen 100 mm Platte kombinieren. Legen Sie die Platten für die Nacht wieder in den Inkubator. HINWEIS: Die kombinierten Überstande enthalten in erster Linie Keimzellen. Die haftenden Zellen, die zusammen mit den Platten verworfen werden, sind in erster Linie hodenförmige somatische Zellen wie Sertoli und peritubuläre Myoidzellen.</li>
	<li>Sammeln Sie die angereicherten Keimzellen in zwei Fraktionen wie folgt. HINWEIS: Angereicherte Keimzellen haften unterschiedlich, nicht haftender Fraktion und leicht haftender Bruch. Beide Fraktionen bilden zusammen die angereicherte Keimzellpopulation<ol>
<li>Nicht haftende Fraktion: Sammeln Sie den Überstand.</li>
		<li>Leicht haftende Fraktion: Waschen Sie die Platten vorsichtig mit PBS, behandeln Sie mit 2 ml 1:20 Verdünnung von 0,25% Trypsin-EDTA für 5 min bei Raumtemperatur, stoppen Sie die Reaktion mit 2 ml Anreicherungsmedium und sammeln Sie in der gleichen Röhre wie nicht haftende Fraktion. HINWEIS: 0,25% Trypsin-EDTA muss mit PBS verdünnt werden, um eine 1:20 Trypsin-Lösung zu produzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Zellzähler, fixieren Sie 100 x 103 Zellen und führen Sie die Immunzytochemie für den Keimzellmarker UCHL1 wie beschrieben12 durch und bestimmen Sie den Prozentsatz der Keimzellen in dieser angereicherten Zellpopulation. HINWEIS: Der Prozentsatz der Keimzellen in dieser Zellpopulation sollte mindestens 60-70% betragen. Da die Immunzytochemie für die Quantifizierung 1 Tag erfordern würde, sollten die angereicherten Zellen in eine ultra niedrige Aufsatz 100 mm Petrischale mit DMEM/F12 ergänzt mit 1% P/S für die Dauer platziert werden, um eine optimale Zellqualität und Lebensfähigkeit zu gewährleisten.</li>
</ol>4. Vorbereitung von Zellen für die Aussaat
<ol><li>Um die Ausgangszellenzubereitung zu ernten, sammeln Sie den Überstand in einem 50 ml Rohr aus dem ultra niedrigen Aufsatz 100 mm Geschirr. Waschen Sie die Platten kräftig mit PBS, um die haftenden Zellen zu sammeln. Eine enzymatische Verdauung ist nicht erforderlich. HINWEIS: Einige der Hodenzellen, in erster Linie Sertoli-Zellen, können leicht an den ultraniedrigen Befestigungsplatten haften.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Ausgangszellpräparation und angereicherte Keimzellen zu einem Arbeitszellenpräparat mit 25% Keimzellen. Zentrifuge bei 500 x g mit Bremsen bei 25 °C für 5 min, Den Überstand entsorgen und die Zellen im Organoidbildungsmedium wieder aufsetzen (DMEM/F12 ergänzt mit Insulin 10 g/ml, Transferrin 5,5 g/ml, Selen 6,7 ng/ml, 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor , 1% P/S). Stellen Sie die Zelldichte auf 2,4 x 106 pro ml ein. HINWEIS: Jeder Brunnen in den Mikrowell-Platten, die13 in diesem Protokoll verwendet wurden, enthielt 1.200 Mikrobrunnen.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgende Formel, um die Anzahl der Zellen pro Brunnen zu berechnen, wie unten beschrieben. Anzahl der Zellen pro Bohrkörper = Anzahl der Mikrobrunnen x Anzahl der Zellen, die für jedes Organoid gruppiert werden sollen.</li>
	<li>Um Organoide aus jeweils 1.000 Zellen zu erzeugen, samen Sie jeweils mit (jeweils 1.200 x 1.000 Zellen=) 1,2 x 106 Zellen. Passen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension so an, dass die Zellen in einem Volumen von 0,5 ml Medium gesät werden. Für Organoide, die aus jeweils 1.000 Zellen gebildet werden, verwenden Sie eine Dichte von 2,4 x 106 Zellen pro ml (1,2 x 106 Zellen in 0,5 ml).</li>
</ol>5. Vorbereitung von Mikrobrunnen zur Aufnahme von Zellen
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Zellen nicht an der Mikrowell-Oberfläche haften, behandeln Sie mit einer Tensidspüllösung, die vom Hersteller zum Kauf erhältlich ist.
<ol><li>Fügen Sie 0,5 ml Spüllösung zu jedem Brunnen hinzu. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Brunnen gefangen sind. Um Luftblasen zu entfernen, zentrieren Sie die Platte bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min.</li>
	<li>Beobachten Sie die Platte unter einem invertierten Mikroskop mit geringer Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Blasen aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wenn eingeschlossene Blasen beobachtet werden, zentrifugieren Sie wieder bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min, um alle verbleibenden Blasen zu entfernen.</li>
	<li>Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der Behandlung die Spüllösung entfernen und die Platte sofort mit sterilem Wasser oder PBS waschen. Stellen Sie sicher, dass die Platte nach der Behandlung mit der Spüllösung nicht austrocknet.</li>
</ol>6. Erzeugung von Hodenorganoiden
<ol><li>Fügen Sie 0,5 ml Organoid-Formationsmedium (ohne Zellen) zu jedem Brunnen und Zentrifuge bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min, um alle eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Beobachten Sie den Brunnen unter einem invertierten Mikroskop mit geringer Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Luftblasen entfernt wurden. Wenn eingeschlossene Blasen beobachtet werden, zentrifugieren Sie wieder bei 2.000 x g mit Bremsen bei 25 °C für 2 min, um alle verbleibenden Blasen zu entfernen.</li>
	<li>0,5 ml der Arbeitszellenaufhängung hinzufügen und sanft mischen, indem sie nach oben und unten pfeifen. Zentrifuge bei 500 x g mit Bremsen bei 25 °C für 5 min. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen in den Mikrobrunnen gruppiert haben.</li>
	<li>Übertragen Sie die Platte für 5 Tage in einen Zellkultur-Inkubator und eine Kultur. Wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums.<ol>
<li>Um das Medium zu wechseln, ohne Organoide zu verlieren, berühren Sie die Pipettenspitze an die Wand des Brunnens und senken Sie sanft, um den Meniskus zu berühren und langsam das Medium zu zeichnen. Achten Sie darauf, den Meniskus zu folgen, wie es nach unten fällt. Um frisches Medium hinzuzufügen, berühren Sie die Pipettenspitze an der Wand des Brunnens auf der gleichen Seite wie das Medium Rückzug und fügen Sie frisches Medium sanft gegen die Brunnenwand, so dass es langsam die Wand hinunter fließen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Organoide zu erholen, pipette das Medium vorsichtig nach oben und unten mit einer breiten Mundpipette. Dies würde es den Organoiden ermöglichen, aus den Mikrobrunnen zu kommen.</li>
	<li>Organoide sammeln, mit PBS waschen, Immunzytochemie für Keimzellmarker (UCH-L1), Sertoli-Zellmarker (GATA Binding Protein 4-GATA4), peritubulären myoiden Zellmarker (-Smooth Muscle Actin-SMA) und Leydig-Zellmarker (Cytochrom) fixieren und durchführen P450-CYP450) wie beschrieben12 und visualisieren unter einem konfokalen Mikroskop.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
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<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li>
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</ol>

Dr. Ungrin hat als Erfinder ein finanzielles Interesse an der AggreWell-Technologie.

Wir haben eine einfache Methode etabliert, die die konsistente, wiederholbare Erzeugung einer großen Anzahl von Hodenorganoiden mit Gewebearchitektur ermöglicht, die Hoden in vivo12ähnelt. Während der Ansatz mit Schweine-Hodenzellen entwickelt wurde, ist er breiter angelegt auch auf Maus, nicht-menschliche Primaten und menschliche Hoden12anwendbar. Für die Herstellung von Hodenorganoiden 8,9,<sup class="x...

In den letzten Jahren ist das Interesse an dreidimensionalen (3D) Organoiden wieder gestiegen. Verschiedene Organe wie Darm1, Magen2, Bauchspeicheldrüse3,4, Leber5und Gehirn6 wurden erfolgreich in 3D-Organoid-Systeme abgeleitet. Diese Organoide haben architektonische und funktionelle Ähnlichkeiten mit den Organen in vivo und sind biologisch relevanter für die Untersuchung der Gewebemikroumgebung als monolayer Kultursysteme7. Als Ergebnis, Hodenorganoide haben begonnen, Interesse zu gewinnen sowie8,9,10,11,12. Die meisten bisher gemeldeten Methoden sind komplex, nicht hoher Durchsatz10 und erfordern die Zugabe von ECM-Proteinen8,10. Diese Komplexität führt auch zu Problemen mit der Reproduzierbarkeit. Es wird eine einfache und reproduzierbare Methode benötigt, die die Erzeugung von Hodenorganoiden mit Zellassoziationen ermöglicht, die wie Hoden in vivo sind.
Wir haben vor kurzem ein System gemeldet, um diese Anforderungen zu erfüllen12. Unter Verwendung des Schweins als Modell verwendeten wir einen zentrifugalen erzwungenen Aggregationsansatz im Mikrowell-System. Im Mikrowell-System enthält jeder Brunnen eine große Anzahl identischer kleinerer Mikrobrunnen13. Dies ermöglicht die Erzeugung zahlreicher Sphäroide einheitlicher Größe. Das Microwell-System ermöglichte die Erzeugung einer großen Anzahl einheitlicher Organoide mit einer testis-spezifischen Architektur. Das System ist einfach und erfordert keine Zugabe von ECM-Proteinen.

<table><tbody><tr><td>100 mm Gewebekulturschale mit extrem geringer Bindung</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Gewebekulturschale</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Adhärenz-Spüllösung</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>bezeichnet als Kollagenase IV S</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV Worthington</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td><td>bezeichnet als Kollagenase IV W</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der Rinderbauchspeicheldrüse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Modifizierter Adler" s Medium/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium - hoher Glukosegehalt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>R& D Systems</td><td>#236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Zellsiebe 70 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Zellsiebe 40 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen</td><td>Gibco</td><td>#41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>Hodengewebe von Schweinen</td><td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Kanada)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Sterile Zentrifugenröhrchen-Top-Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von porcine hodenorganoiden mit testis-spezifischer architektur mit microwell-kultur

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die aus mehreren Zelltypen bestehen, die in der Lage sind, Gewebearchitektur und Funktionen von Organen in vivo zu rekapitulieren. Die Bildung von Organoiden hat verschiedene Wege der Grundlagen- und Translationsforschung eröffnet. In den letzten Jahren haben Hodenorganoide Interesse auf dem Gebiet der männlichen Reproduktionsbiologie geweckt. Hodenorganoide ermöglichen die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, Gewebeentwicklung und der Keimzellnische Mikroumgebung und ermöglichen das Screening von Arzneimitteln und Toxizitäten mit hohem Durchsatz. Eine Methode ist erforderlich, um Hodenorganoide mit Hoden-spezifischer Gewebearchitektur zuverlässig und reproduzierbar zu erzeugen. Das Mikrobrunnenkultursystem enthält eine dichte Reihe von pyramidenförmigen Mikrobrunnen. Hodenzellen, die aus präpubertären Hoden gewonnen werden, werden in diese Mikrobrunnen zentrifugiert und kultiviert, um Hodenorganoide mit hodenspezifischer Gewebearchitektur und Zellassoziationen zu erzeugen. Tausende von homogenen Organoiden können über diesen Prozess erzeugt werden. Das hier berichtete Protokoll wird für Forscher, die die Männliche Fortpflanzung untersuchen, von breitem Interesse sein.

Isolierte Zellen aus 1 Wochen alten Schweinehoden, die in den Mikrobrunnen selbst organisiert in Sphäroide kultiviert wurden (Abbildung 1A, Abbildung 2), mit abgegrenzten und ausgeprägten äußeren (seminiferen Epithel) und Innenfächern ( interstitium) (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die beiden Fächer wurden durch eine Kollagen-IV+ve-Kel...

Hier stellen wir ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Schweinehodenorganoiden mit Testis-spezifischer Gewebearchitektur unter Verwendung des handelsüblichen Mikrowell-Kultursystems vor.

Erzeugung von Porcine Hodenorganoiden mit Testis-spezifischer Architektur mit Microwell-Kultur

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es die Erzeugung von Hodenorganoiden ermöglicht, die als Plattform für die Untersuchung der Hodenmorphogenese und für Tests mit hohem Tropomedikament und Toxizität spämisch genutzt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sehr reproduzierbar ist, eine relativ geringe Anzahl von Zellen benötigt und verwendet werden kann, um eine große Anzahl von Hodenorganoiden mit hodenspezifischer Architektur zu erzeugen. Diese Methode kann angewendet werden, um andere Systeme zu untersuchen, wie pluripotente Stammzellen oder Pankreas-Isletzellen mit den notwendigen Optimierungen.Demonstriert wird das enzymatische Verdauungsverfahren des Hodengewebes von Anna Voigt, einer Doktorandin aus meinem Labor. Die Hoden in ein steriles Becherglas einsammeln und mit PBS waschen, das 1%Penicillin-Streptomycin enthält. Nach dem Waschen den Hoden auf eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit PBS mit 1%Penicillin-Streptomycin übertragen.Verwenden Sie autoklavierte Schere und Zange, um die Tunika vaginalis und epididymis zu entfernen. Den isolierten Hoden auf eine neue 100-Millimeter-Schale übertragen und gründlich mit PBS waschen, das 1%Penicillin-Streptomycin enthält. Schneiden Sie die Hoden entlang der Längsachse direkt unter der Tunika.Dann schälen Sie die Hoden aus der Tunika mit zwei Zangen und legen Sie sie in eine neue 100-Millimeter-Schale mit 1 Milliliter DMEM mit 1%Penicillin Streptomycin. Den geschälten Hoden mit steriler Schere in ein bis zwei Millimeter Gewebestücke zerkleinern. Nach dem Hacken verwenden Sie sterile Zangen, um die weißen Fragmente des Bindegewebes zu entfernen.Übertragen Sie die gehackten Gewebestücke in Lösung A in einem 50-Milliliter-Rohr und verladen Sie sie auf 50 Milliliter mit DMEM, um eine Konzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter für Diekolagenase 4S und eine Konzentration von 0,8 Milligramm pro Milliliter für Kolagenase 4W zu erhalten. Legen Sie das Rohr mit den Gewebeteilen 30 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad. Umkehren Sie das Rohr alle fünf Minuten sanft.Nach 30 Minuten zentrieren Sie das Rohr bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, ad 40 Milliliter der Lösung B, und toppen Sie bis zu 50 Milliliter mit DMEM, um eine Konzentration von 1,2 Milligramm pro Milliliter Kolagenase 4W zu erhalten. Legen Sie die Röhre für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und umkehren Sie das Rohr alle fünf Minuten sanft.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Danach den Überstand entsorgen und einmal mit PBS mit 1%Penicillin Streptomycin waschen. Sammeln Sie die Tubuli vorsichtig von oben und legen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Rohr.Aufladen Sie das Rohr mit PBS bis zu 50 Millilitern. Zentrifugieren Sie die Tubuli bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie frische PBS hinzu, um zwei weitere Male zu waschen.Nach der letzten PBS-Waschung entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die seminiferen Tubuli in fünf Milliliter PBS wieder auf. Dann fügen Sie 15 Milliliter 0.25%Trypsin EDTA zu den Tubuli hinzu. Legen Sie das Rohr in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und alle zwei Minuten sanft umkehren.Nach fünf Minuten die enzymatische Verdauung von Tubuli an einzelnen Zellen unter dem Mikroskop mit 10 Mikrolitern Probe auf einer Gewebekulturplatte bewerten. Alle zwei Minuten stellen Sie die Probe unter das Mikroskop, um sie zu beobachten. Wenn meist einzelne Zellen nachgewiesen werden können, stoppen Sie die Reaktion mit fünf MilliliterFBS und filtern durch ein 70-Mikron-Netz und dann durch ein 40-Mikron-Netz.Zentrifugieren Sie die einzelnen Zellen bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Re-suspend in 50 Milliliter Anreicherungsmedium, und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer. Übertragen Sie 20 Millionen dieser Ausgangszellpopulation in jede der beiden ultra-niedrigen Befestigung 100 Millimeter Petrischalen und inkubieren in einem Gewebe-Kultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff für zwei Tage.Cede 20 bis 25 Millionen Zellen der verbleibenden Ausgangszellpopulation pro 100 Millimeter Gewebekulturschale in einem Gesamtvolumen von acht Milliliter n an reicherieren. Legen Sie die Schale in einen Inkubator und stellen Sie nach 1,5 Stunden sicher, dass die Mehrheit der Sertoli-Zellen an der Platte befestigt sind. Neigen Sie zwei Platten leicht, um die Überräube zu sammeln und in einer neuen 100-Millimeter-Platte zu kombinieren und wieder in den Inkubator zu legen.Nach einer Stunde wieder die Überräube zweier Platten zu einer neuen 100-Millimeter-Platte kombinieren. Legen Sie die Platten über Nacht wieder in den Inkubator. Dann sammeln Sie die angereicherten Keimzellen in zwei Fraktionen, nicht-anhaftende Fraktion und leicht anhaftende Fraktion.Sammeln Sie den Überstand als die nicht-haftende Fraktion. Für die leicht haftende Fraktion die Platten vorsichtig mit PBS waschen und mit zwei Millilitern einer einbis 20 Verdünnung von 0,25%Trypsin EDTA fünf Minuten bei Raumtemperatur behandeln. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Milliliter Anreicherungsmedium hinzufügen und in der nicht haftenden Bruchröhre sammeln.Kombinieren Sie das Ausgangszellpräparat mit den angereicherten Keimzellen in einer Röhre, um ein Arbeitszellenpräparat mit 25% Keimzellen zu erhalten. Zentrifuge bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliterorganoid-Bildungsmedium, um eine Konzentration von 2,4 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen.In einem neuen Rohr fügen Sie einen Milliliter der Lösung, die Zellen enthält. Fügen Sie 0,5 Milliliter Tensidspüllösung zu jedem Brunnen in einer Mikrobrunnenplatte hinzu. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Brunnen gefangen sind.Um Luftblasen zu entfernen zentrifugieren die Platte bei 2 000 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für zwei Minuten. Beobachten Sie die Platte unter einem invertierten Mikroskop mit niedriger Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Blasen aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Nach der Behandlung ist die Spüllösung vollständig entfernen und sofort waschen Sie die Platte mit sterilem Wasser oder PBS. Fügen Sie 0,5 Milliliter Organoid-Formationmedium zu jedem Brunnen und Zentrifuge bei 2.000 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für zwei Minuten, um alle gefangenen Luftblasen zu entfernen. Beobachten Sie den Brunnen unter einem invertierten Mikroskop mit niedriger Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Luftblasen entfernt wurden.0,5 Milliliter der Arbeitszellenaufhängung hinzufügen und sanft vermischen, indem man nach oben und unten pfeift. Zentrifuge bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen in den Mikrobrunnen gruppiert haben.Übertragen Sie die Platte für fünf Tage in einen Zellkultur-Inkubator und eine Kultur. Wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums. Um die Organoide zu erholen, verwenden Sie eine Breitmaulpipette, um das Medium sanft nach oben und unten zu pipette.Dadurch können die Organoide aus den Mikrobrunnen herauskommen. Sammeln Sie die Organoide, fixieren und führen Sie Immunzytochemie für Keimzellmarker, Sertoli-Zellmarker, peritubulären Myoidzellmarker und Leydig-Zellmarker durch und visualisieren Sie unter einem konfokalen Mikroskop. In dieser Studie isolierten Zellen aus einwöchigen Schweinehoden, die in Mikrobrunnen selbst organisiert in Sphäroide mit abgegrenzten und unterschiedlichen Außen- und Innenfächern kultiviert wurden.Die beiden Fächer wurden durch eine Kollagen IV positive Kellermembran getrennt. GATA4-positive Sertoli-Zellen und UCHL1-positive Keimzellen befanden sich im Außenfach auf der Kellermembran. aSMA positive peri-tubuläre Myoidzellen wurden entlang der Innenseite der Kellermembran lokalisiert, während CYP450 positive Leydig-Zellen im Zentrum des Interstitiums waren.Diese Struktur ähnelt Den In-Situ-Bedingungen, bei denen sich Leydig-Zellen, peri-tubuläre Myoidzellen, im Interstitium, im Interstitiial-Kompartiment und keimzellen befinden, Sertoli-Zellen befinden sich am Seminiferepithel. Es ist wichtig sicherzustellen, dass Zellen, die verwendet werden, um Organoide zu erzeugen, eine optimale Qualität haben. Während der Trypsinisierungsphase der enzymatischen Verdauung sollte sorgfältig darauf geachtet werden.Nach diesem Verfahren können die Organoide langfristig kultiviert werden, um die Keimzelldifferenzierung zu untersuchen oder auf Genexpression und sezernierte Proteine oder Hormone zu analysieren. Die Fähigkeit, Organoide mit hodenspezifischen Zellassoziationen zu erzeugen, bietet ein neuartiges In-vitro-System zur Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, die für die Entwicklung von Hoden und die Keimzellfunktion wichtig sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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