Name: In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Rekonstitution räumlicher Zellkontaktmuster mit isolierten Caenorhabditis elegans-Embryoblastomeren und funktionalisierten Polystyrolperlen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kontaktabhängiger zellulärer Verhaltensweisen.

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Wir danken James Priess und Bruce Bowerman für die Beratung und Bereitstellung von C. elegans Stämmen, Don Moerman, Kota Mizumoto und Life Sciences Institute Imaging Core Facility für den Austausch von Geräten und Reagenzien, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim für die Wartung von C. elegans und die kritische Lektüre unseres Manuskripts. Unsere Arbeit wird vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442) unterstützt.

1. Herstellung von Klebstoff-Polystyrol-Perle
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert keine aseptische Technik.
<ol><li>Wiegen Sie 10 mg Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 1 ml 2-(N-Morpholino)Ethanulfonsäure (MES) Puffer in die Röhre. Da der MES-Puffer kein Phosphat und Acetat enthält, was die Reaktivität von Carbodiimid reduzieren kann, ist er für die Proteinkopplungsreaktion geeignet. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.</li>
	<li>Drehen Sie das Rohr für 60 s bei 2.000 x g über eine Tischzentrifuge.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen erneut mit 1 ml MES-Puffer, indem Sie die Schritte 1.2-1.4 befolgen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml MES-Puffer mit 10 mg EDAC in das Rohr, um die Oberflächen-Carboxylgruppen zu aktivieren. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.</li>
	<li>Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Drehen Sie die Perlen für 60 s bei 2.000 x g.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.</li>
	<li>Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 1 ml Phosphat gepufferte Saline (PBS) in das Rohr. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.</li>
	<li>Drehen Sie das Rohr für 60 s bei 2.000 x g.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen erneut mit 1 ml PBS, indem Sie den Schritten 1.10-1.12 folgen.</li>
	<li>Die endgültige Konzentration von Rhodamine verwendet wird, hängt von der Belastung abgebildet. Bereiten Sie 1 ml 1-, 10-, 100- und 1000-fache Verdünnungsserie von Rhodamine Red-X aus der 0,65 mM Rhodamine Red-X-Lagerlösung vor.</li>
	<li>Pipette 20 L Perlen in jedes serielle Verdünnungsrohr.</li>
	<li>Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml PBS, indem Sie die Schritte 1.10-1.12 wiederholen.</li>
	<li>1 ml PBS in das Rohr geben und bis zu 6 Wochen bei 4 °C lagern. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität der Perlen unter einem Mikroskop, das für die Live-Bildgebung verwendet wird. Die entsprechende Konzentration des Rhodamine-Rot-X-Succinimidylesters hängt von den bildgebenden Bedingungen ab (Abbildung 1). HINWEIS: Perlen ohne Rhodamine Red-X Behandlung nicht an zelle haften. Rhodamine Red-X dient als Fluoreszenzmarker sowie Als Klebemolekül. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen positiv geladenem Rhodamine Red-X und negativ geladener Plasmamembran ist eine vermeintliche Ursache der Adhäsion.</li>
</ol>2. Montage der Mundpipette
<ol><li>Schneiden Sie breite (6,35 mm Innendurchmesser) und schmale (3,175 mm Innendurchmesser) Tygon-Rohre auf ca. 25 cm bzw. 40 cm Länge(Abbildung 2).</li>
	<li>Verbinden Sie die Tygon-Röhren mit einem Polytetrafluorethylen-Filter (PTFE) (0,2 m Porengröße) (Abbildung 2).</li>
	<li>Zerlegen Sie ein handelsübliches Saugrohr und befestigen Sie den Kapillarhalter und das Mundstück am Ende der schmalen bzw. breiten Tygon-Rohre (Abbildung 2). HINWEIS: PTFE-Filter wurde verwendet, um das Einatmen von Dämpfen der Hypochloritlösung über Mundpipetten zu verhindern.</li>
</ol>3. Isolierung von Embryoblastomer
HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe und Labormantel, um Schnitt und Kontakt mit der Bleichlösung zu vermeiden.
<ol><li>Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare (Kapazität; 10 L) mit der rechten und linken Hand.</li>
	<li>Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung aufzutragen und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren zu machen (Abbildung 3A).</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen unter dem Seziermikroskop und befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mundpipettiergerät (Abbildung 2). Bereiten Sie zwei Arten von Pipetten vor. Die Spitzenöffnungsgrößen für die Pipetten sollten etwa 2x und 1x der kurzen Achslänge von C. elegans Embryonen (30 'm) für den Embryotransfer und die Eischalenentfernung bzw. Abbildung 3B-Dbetragen.</li>
	<li>Pipette 45 l Eisalzlösung auf einen Brunnen eines Multiwell-Schlittens(Abbildung 4A; unten).</li>
	<li>5-10 erwachsene C. elegans auf eine gut enthaltende Eisalzlösung geben.</li>
	<li>Um frühe C. elegans Embryonen zu erhalten, schneiden Erwachsene in Stücke, indem Sie zwei Nadeln rechts und links des C. elegans Körpers positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben(Abbildung 4A; obere Schaltpläne).</li>
	<li>Pipette 45 l Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der brunnenhaltigen Eisalzlösung(Abbildung 4B).</li>
	<li>Pipette 45 l des Wachstumsmediums von Sheltons auf die folgenden drei Brunnen neben der brunnenhaltigen Hypochloritlösung (Abbildung 4B).</li>
	<li>Übertragen Sie 1-Zell-Stadium- und frühe 2-Zellen-Embryon in die Hypochloritlösung durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für embryonale Übertragung (Abbildung 4B).</li>
	<li>Warten Sie auf 40-55 s.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen, indem Sie die Embryonen aus der Hypochloritlösung in Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 4B).</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen erneut, indem Sie die Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 4B).</li>
	<li>Übertragen Sie die gewaschenen Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer. Mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung, wiederholen Sie sorgfältig die Pipettierung(Abbildung 4C; mittlere Schaltpläne). Wenn die Eierschale erfolgreich entfernt wird, werden die embryonalen Zellen kugelförmiger(Abbildung 4C;rechts).</li>
	<li>Trennen Sie die 2-Zellen-Stadium embryonale Blastomere durch sanfte und kontinuierliche Pipettierung mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung (Abbildung 4D).</li>
</ol>4. Rekonstitution von Kontaktmustern mit Blastomer und Perle
HINWEIS: Arbeiten Sie unter dem Bildgebungsmikroskop, um eine Trennung einer Zelle von einer Perle zu vermeiden und die rechtzeitige Bildaufnahme zu erleichtern.
<ol><li>Um dies mit einem invertierten Mikroskop zu beobachten, bereiten Sie eine Bildkammer wie in Abbildung 5vor.<ol>
<li>Legen Sie einen Deckelslip auf einen Decksliphalter(Abbildung 5A).</li>
		<li>Verkleben Sie die Kanten des Deckels, um ihn zu stabilisieren. Die Seite mit Klebeband ist die "Rückseite"(Abbildung 5A,B).</li>
		<li>Drehen Sie den Deckelhalter auf die "Vorderseite" und ziehen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis auf den Deckel (Abbildung 5C). HINWEIS: Jede Glasbodenschale funktioniert auch, sofern die Embryonen durch die Mundpipette manipulierbar sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie Sheltons Wachstumsmedium innerhalb des Kreises hinzu, der vom hydrophoben Marker gezeichnet wird (Abbildung 5D).</li>
	<li>Übertragen Sie das isolierte Blastomer in die Bildkammer.</li>
	<li>Geben Sie ein kleines Volumen der chemisch funktionalisierten Perlen mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer.</li>
	<li>Steuern Sie die Position der Polystyrolperlen, indem Sie in die handgezeichnete Kapillare blasen, bis die Perle an dem isolierten Blastomer befestigt wird.</li>
	<li>Montieren Sie einen Deckelschlupf, um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden (Abbildung 5E). Führen Sie Live-Bildgebung durch.</li>
</ol>5. Herstellung wichtiger Reagenzien
<ol><li>Eisalzlösung (10 ml): Kombinieren Sie 235 l von 5 M NaCl und 240 l von 2 M KCl mit 9525 l dH2O.</li>
	<li>Hypochloritlösung (10 ml): Kombinieren Sie 7,5 ml Clorox (mit ca. 7,5 % Natriumhypochlorit) mit 2,5 ml 10 N NaOH (Endkonzentration von Natriumhypochlorit beträgt ca. 5,625%). HINWEIS: Obwohl viele veröffentlichte Methoden Chitinase verwendet haben, um chitinöse Eierschalen zu verdauen, haben wir eine Methode mit Hypochloritlösung11angenommen. Durch die Vermeidung der Batch-zu-Batch-Variationen von Chitinase-Aktivitäten glauben wir, dass diese Methode reproduzierbarer und kostengünstiger ist.</li>
	<li>0,81 mM Inulin Lösung (40 ml)<ol>
<li>0,2 g Inulin zu 40 ml dH2O hinzufügen.</li>
		<li>Autoklav aufzulösen. HINWEIS: Hält 1 Monat bei 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,5 M MES Puffer (500 ml)<ol>
<li>48,81 g MES in 400 ml destilliertem Wasser (dH2O) auflösen.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 6,0 ein.</li>
		<li>Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 500 ml mit dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS-Lösung (1 l)<ol>
<li>Um 10-fache PBS-Lösung herzustellen, lösen Sie 1 Packung PBS-Vormischungspulver in 1 L dH2O auf.</li>
		<li>Kombinieren Sie 100 ml 10-fach-PBS-Lösung mit 900 ml dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5% Polyvinylpyrrolidon (PVP) Lösung (4 ml)<ol>
<li>Unter sterilen Bedingungen 0,2 g PVP in 4 ml Drosophila Schneiders Medium auflösen. HINWEIS: Öffnen Sie immer Schneider es Medium Stock in Tissue Culture (TC) Haube. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,65 mM Rhodamine Red-X Stofflösung (2 ml)<ol>
<li>Wiegen Sie 1 mg Rhodamine Red-X.</li>
		<li>2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zum Auflösen hinzufügen.</li>
		<li>Aliquot und lagern bei -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Shelton es Growth Medium (SGM) (10,25 ml)<ol>
<li>Kombinieren Sie unter sterilen Bedingungen 8 ml Medium von Drosophila Schneider, 1 ml PVP-Lösung, 1 ml Inulin-Lösung, 1 ml Basal Medium Eagle (BME)-Vitamine, 50 l Penicillin-Streptomycin und 100 l Lipidkonzentrat.</li>
		<li>Aliquot 325 l SGM in 1,5 ml Mikroröhren. HINWEIS: Etwa 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.</li>
		<li>Am Tag der Blastomer-Isolierung 175 L fetales Rinderserum (FBS) zum SGM hinzufügen (bei einem Gesamtvolumen von 500 l). HINWEIS: FBS bei -20 °C aufbewahren und vor Gebrauch auftauen. FBS muss nicht wärmeabgetötet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Die Rekonstitution vereinfachter Zellkontaktmuster ermöglicht es Forschern, die Rollen bestimmter Zellkontaktmuster in verschiedenen Aspekten der Morphogenese zu testen. Wir haben diese Technik verwendet, um zu zeigen, dass die Zellteilungsachse durch den physischen Kontakt mit Klebeperlen10gesteuert wird. Da die Divisionsachsenspezifikation für die multizelluläre Entwicklung entscheidend ist, indem sie zur Morphogenese14,Stammzellteilung15,</su...

Während der multizellulären Entwicklung werden die zellulären Verhaltensweisen (z.B. Divisionsachse) einzelner Zellen durch verschiedene chemische und physikalische Hinweise spezifiziert. Zu verstehen, wie einzelne Zellen diese Informationen interpretieren und wie sie die mehrzellige Baugruppe als auftauchende Eigenschaft regulieren, ist eines der ultimativen Ziele von Morphogenesestudien. Der Modellorganismus C. elegans hat wesentlich zum Verständnis der zellulären Regulation der Morphogenese wie Zellpolarität1,Zellteilungsmuster1, Zellschicksalsentscheidung2und Gewebe-Skala-Vorschriften wie neuronale Verdrahtung3 und Organogenese4,5beigetragen. Obwohl es verschiedene genetische Werkzeuge zur Verfügung, Gewebe-Engineering-Methoden sind begrenzt.
Die erfolgreichste Tissue-Engineering-Methode in der C. elegans-Studie ist die klassische Blastomer-Isolation6; Da C. elegans Embryo von einer Eierschale und einer Durchlässigkeitsbarriere7umgeben ist, ist ihre Entfernung eines der hauptverfahren dieser Methode. Während diese blastomere Isolationsmethode eine vereinfachte Rekonstitution des Zell-Zell-Kontakts ermöglicht, erlaubt sie nicht die Eliminierung unerwünschter Hinweise; Der Zellkontakt stellt nach wie vor sowohl mechanische (z. B. Haftung) als auch chemische Hinweise dar, wodurch unsere Fähigkeit, den kausalen Zusammenhang zwischen dem Cue und dem zellulären Verhalten vollständig zu analysieren, eingeschränkt wird.
Die in diesem Papier vorgestellte Methode verwendet Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen, die kovalent an alle amin-reaktiven Moleküle binden können, einschließlich Proteine wie Liganden. Insbesondere haben wir eine amin-reaktive Form von Rhodamine Red-X als Liganden verwendet, um Perlen sowohl visuell nachvollziehbar als auch klebend an der Zelle zu machen. Die Carboxylgruppen der Perlenoberfläche und der primären Amingruppen von Ligandenmolekülen werden durch wasserlösliches Carbodiimid 1-ethyl-3-(Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDAC)8,9gekoppelt. Erhaltene Klebeperlen ermöglichen die Auswirkungen des mechanischen Hinweises auf die Zelldynamik10. Wir haben diese Technik verwendet, um mechanische Hinweise zu identifizieren, die für die Zellteilungsausrichtung10erforderlich sind.

<table><tbody><tr><td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1080703</td><td>Für die Bead-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Aspirator Tube</td><td>Assembly Drummond</td><td>21-180-13</td><td>Für die Blastomerisolierung.</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans-Stamm: N2, Wildtyp</td><td>Caenorhabditis Genetics</td><td>Center N2-Stamm</td><td>in dieser Studie</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans-Stamm: KSG5, Genotyp: zuIs45; itIs37</td><td>im Haus</td><td>KSG5-Stamm</td>, <td>der in dieser Studie verwendet</td></tr><tr><td>wurde Kalibrierte Mikropipetten, 10 &; Mikro; L</td><td>Drummond</td><td>21-180-13</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>Carboxylat-modifizierte Polystyrolkügelchen (30 & Mikro; m Durchmesser)</td><td>KISKER Biotech</td><td>PPS-30.0COOHP</td><td>Für die Bead-Präparation</td></tr><tr><td>CD Lipid Concentrate</td><td>Life Technologies</td><td>11905031</td><td>Für die Blastomerisolierung. Arbeiten in der Gewebekulturhaube.</td></tr><tr><td>Clorox</td><td>Clorox</td><td>N. A.</td><td>Für die Blastomer-Isolierung. Öffnen Sie eine neue Flasche, wenn die Hypochlorit-Behandlung nicht gut wirkt.</td></tr><tr><td>Deckglashalter</td><td>Im Haus</td><td>N.A.</td><td>Für die Blastomer-Isolierung.</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop: Zeiss Stemi 508 mit Stativ M. Die Lichtquelle ist die eingebaute LED. Die Vergrößerung des Okulars beträgt 10X.</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td>Für die Blastomerisolierung.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, Qualified One Shot, kanadischer Ursprung</td><td>Gibco</td><td>A3160701</td><td>Für die Blastomerisolierung. Arbeiten in der Gewebekulturhaube.</td></tr><tr><td>Injektionsnadeln für den allgemeinen Gebrauch und Präzisionsgleiten, 25 gauge</td><td>BD</td><td>14-826AA</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>Inulin</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1842509</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>MEM-Vitaminlösung (100x)</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>Für die Blastomerisolierung.</td></tr><tr><td>MES (Fine White Crystals)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP300-100</td><td>Für die Bead-Präparation</td></tr><tr><td>Multitest Slide 10 Well</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN6041805</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP665-1</td><td>Für die Bead-Präparation</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>Für die Blastomer-Isolierung.</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP431-100</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td></td><td>Bioshop POC888</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>Rhodamin Red-X, Succinimidylester, 5-Isomer</td><td>Molekulare Sonden</td><td>R6160</td><td>Für die Bead-Präparation</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Steriles Medium</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td>Für die Blastomerisolierung. Arbeiten in der Gewebekulturhaube.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>Natriumhydroxidlösung, 10 N</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS255-1</td><td>Für die Blastomerisolierung</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop mit Spinning-Disk: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert invertiertes Zielfernrohr, Quant EM 512 Kamera, 63X NA 1.4 Plan Apochromat-Objektiv. Das System wurde über Slidebook 6.0 gesteuert.</td><td>Intelligent Imaging Innovation</td><td>N.A.</td><td>Für Live-Imaging</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, PTFE, unsteril</td><td>Basix</td><td>13100115</td><td>Für die Blastomerisolierung.</td></tr><tr><td>Tygon S3 Laborschlauch, Formulierung E-3603, Innendurchmesser 3.175 mm</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>89403-862</td><td>Für die Blastomerisolierung.</td></tr><tr><td>Tygon S3 Laborschlauch, Formulierung E-3603, Innendurchmesser 6,35 mm</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>89403-854</td><td>Für die Blastomerisolierung.</td></tr></tbody></table>

in vitro rekonstitution von räumlichen zellkontaktmustern mit isolierten caenorhabditis elegans embryo blastomeren und klebstoff polystyrol perlen

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In mehrzelligen Systemen sind einzelne Zellen von den verschiedenen physikalischen und chemischen Hinweisen umgeben, die aus benachbarten Zellen und der Umgebung stammen. Diese Gewebekomplexität verwirrt die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrinsischen Cues und zellulärer Dynamik. Ein synthetisch rekonstituiertes mehrzelliges System überwindet dieses Problem, indem es Forschern ermöglicht, auf einen bestimmten Hinweis zu testen und andere zu eliminieren. Hier stellen wir eine Methode zur Rekonstituierung von Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans blastomer und klebenden Polystyrolperlen vor. Die Verfahren umfassen die Entfernung von Eierschalen, blastomere Isolierung durch Unterbrechung der Zell-Zell-Adhäsion, Die Herstellung von klebenden Polystyrolperlen und die Rekonstitution von Zellzell- oder Zellperlenkontakt. Schließlich stellen wir die Anwendung dieser Methode vor, um die Ausrichtung zellulärer Teilungsachsen zu untersuchen, die zur Regulierung der räumlichen zellulären Musterung und Zellschicksalsspezifikation bei der Entwicklung von Embryonen beiträgt. Diese robuste, reproduzierbare und vielseitige In-vitro-Methode ermöglicht die Untersuchung direkter Zusammenhänge zwischen räumlichen Zellkontaktmustern und zellulären Reaktionen.

Für die Perlenpräparation haben wir die optimale Menge an Rhodamin-Rot-X-Succinimidylester für den transgenen Stamm bestimmt, der GFP-Myosin II und mCherry-Histon exzessiiert (Abbildung 1A-D). Wir verwendeten mCherry mit Histon als Marker für die Zellzyklusprogression. Da sowohl Rhodamine Red-X als auch mCherry mit einem 561 nm Laser beleuchtet werden, ist die optimale Intensität des Rhodamine Red-X Signals mit der von Histone vergleichbar, um eine gleichzeitige Bildgebung v...

Gewebekomplexitäten multizellulärer Systeme verwirren die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrazellulären Hinweisen und individuellen zellulären Verhaltensweisen. Hier stellen wir eine Methode vor, um den direkten Zusammenhang zwischen kontaktabhängigen Cues und Divisionsachsen mit C. elegans embryo blastomeres und klebenden Polystyrolperlen zu untersuchen.

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Multizelluläre Gewebe komplex, stellt dieses Protokoll zelluläre Verhalten in einer vereinfachten Weise. Eine Sache ist diese Technik, um die direkten Beziehungen zwischen zellulären Leiter protonen und zelluläre Reaktion zu studieren. Dieses Protokoll verwendet chemisch funktionelle Polystyrolperlen, um die Zellleiterprotonen zu rekonstruieren.Die Perlen können mit allen Protonen von Interesse geschnitten werden, um ihre Auswirkungen auf die zelluläre Reaktion zu testen. Wir haben diese Methode in C-Elegance auf Mausembryonen verwendet. Daher kann dieses Protokoll aufrecht zu den Studien von weit verbreiteten Organismen sein.Da Embryonen nach einer hohen vollflächigen Chloritbehandlung zerbrechlich sind, ist eine signifikante Praxis erforderlich, bevor man Blastomer erfolgreich isolieren kann. Visuelle Demonstration wird ein besseres Verständnis dafür bieten, wie man Kapillaren während Blastomer-Isolationsmethoden handhaben sollte. Zunächst wiegen Sie 10 Milligramm Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen in einem 1,5-Milli-Liter-Mikrozentrifugenrohr.Fügen Sie einen Milliliter MES-Puffer in das Rohr zum Waschen. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen. Drehen Sie das Rohr für 60 Sekunden bei 2000XG über Diebzentrifuge.Dicard den Überstand durch sorgfältiges Pipettieren des Puffers. Waschen Sie die Perlen erneut mit einem Milliliter MES-Puffer. Nach dem Waschen einen Milliliter MES-Puffer mit 10 Milli-Gramm EDAC in das Rohr geben, um die Oberflächen-Carboxylgruppen zu aktivieren.Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen. Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Perlen für 60 Sekunden bei 2000XG.Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer vorsichtig ausrohren, und waschen Sie ihn mit einem Milliliter PBS. Wirbeln Sie das Rohr, um die Perlen zu mischen und wiederholen Sie die PBS waschen ein anderes Mal. Bereiten Sie einen Milliliter einer, 10, 100 und tausendfachen Verdünnungsserie von Rhodamine Red-X aus der 0,65-Milli-Liter-Rhodamine Red-X-Lagerlösung vor.Pippette 20 Mikroliter Perlen in jede serielle Verdünnungsröhre. Drehen und inkubieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Perlen zweimal mit einem Milli-Liter PBS.Nach dem Waschen einen Milliliter PBS in die Schläuche geben und bis zu sechs Wochen bei vier Grad Celsius lagern. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität der Perlen unter einem Mikroskop, das für die Live-Bildgebung verwendet wird. Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare bei einem Fassungsvermögen von 10 Mikrolitern mit rechter und linker Hand.Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung aufzutragen, und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren herzustellen. Schneiden Sie unter dem Seziermikroskop die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen. Machen Sie die beiden Spitzenöffnungsgrößen etwa zweimal und ein Mal die kurze Zugangslänge von C-Elegance Embryos für den Embryotransfer bzw. die Eischalenentfernung.Befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mund-Pippetting-Gerät. Pippette 45 Mikroliter Eisalzlösung auf einen Brunnen einer mehrwelligen Rutsche. Platz fünf bis zehn Erwachsene C-Elegance auf den Brunnen.Um frühe C-Elegance-Embryonen zu erhalten, schneiden Erwachsene in Stücke, indem sie zwei Nadeln rechts und links des Körpers von C-Elegance positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben. Pippette 45 Mikroliter Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der gut haltigen Ei-Salz-Lösung und Pippette 45 Mikroliter von Sheltons Wachstumsmedium auf die folgenden drei Brunnen. Übertragen Sie eine Zellstufe und frühe zwei Zellstadium Embryonen in die Hypochlorit-Lösung durch den Mund Pippette mit der größeren Größe Öffnung und warten Sie für 40 bis 55 Sekunden.Waschen Sie die Embryonen, indem Sie sie mit Sheltons Wachstumsmedium in die nächsten drei Brunnen übertragen. Mit jeweils ein bis zwei Sekunden in jedem der ersten beiden Brunnen. Mit der handgezeichneten Kapillare mit der kleineren Öffnung sorgfältig wiederholen Rohrleitung den Embryo für die Eischalenentfernung.Danach pippette kontinuierlich mit der handgezeichneten Kapillare, um die zweizelligen embryonalen Blastomere zu trennen. Nach der Entnahme der Eierschale minimieren Sie die Kraft beim Pippetting der Embryonen nach oben und unten, um ein Platzen zu verhindern. Bereiten Sie eine Bildkammer vor, indem Sie einen Deckelslip auf einen Deckelhalter legen und die Kanten des Abdeckungsslips verkleben, um ihn zu stabalisieren.Drehen Sie den Deckelhalter, und zeichnen Sie einen Kreis auf dem Coverslip mit einem hydrophoben Stift. Fügen Sie Sheltons Wachstumsmedium innerhalb des vom hydrophoben Marker gezeichneten Kreises hinzu und übertragen Sie das isolierte Blastomere in die Bildkammer innerhalb des Kreises. Geben Sie nun mit der handgezeichneten Kapillare mit der größeren Öffnung ein kleines Volumen der chemisch funktionalisierten Perlen auf den Deckel.Steuern Sie die Position der Perlen, indem Sie in die handgezeichnete Kapillare blasen, bis sich die Perlen an dem isolierten Blastomer befestigen. Montieren Sie den Deckelschlupf, um die Verdunstung von Medien zu vermeiden, und führen Sie Live-Bildgebung mit einem invertierten Mikroskop durch. In dieser Studie war das fluoreszierende Signal der mit 0,005 Mikrogramm pro Milliliter Rhodamine Red-X Succinimidylester behandelten Perle für den transgenen Stamm, der GFP Miosin-2 und M-Cherihiston exsetiert, zu schwach.Auf der anderen Seite war das fluoreszierende Signal der perlen, die mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Rhodamine Red-X Succinimidylester behandelt wurden, zu stark. Die Konzentration von Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester bei 0,5 Mikrogramm pro Milliliter war für diesen speziellen transgenen Stamm optimal. Während der Live-Bildgebung wurde eine Ebene identifiziert, wo zwei Zentrosomen vertikal ausgerichtet waren.Die Ebene mit plus oder minus 90 Grad Winkel dieser Ebene ist Spindelebene. Der Winkel der Spindelausrichtung relativ zur Zell-/Perlenkontaktschnittstelle nach zytokinese zeigt, dass beide Tochterzellen in einer Linie, die beide Kontaktsichten passiert, an der Perle befestigt waren, als Kontaktausrichtung verwendet wurde. Man muss lernen, wie Embryonen und Eierschalen auf bestimmte äußere Kräfte reagieren, die von der Mundpippette angewendet werden.Theoretisch kann jede zelluläre Reaktion untersucht werden, zum Beispiel kann die Sulfatspezifikation durch Kultivieren von Zellen und Kontakt mit Klebeperlen über längere Laufzeiten untersucht werden. Diese Technik wurde verwendet, um den kontaktabhängigen Ausrichtungsmechanismus für die Zellteilung zu verstehen. PTF-Filter wurde verwendet, um das Einatmen von Dämpfen der Hypochloritlösung über Mundpippette zu verhindern.

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Research

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JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen eine einfache Methode für die Platzierung Zellen an gewünschten Stellen auf einem Substrat. Diese Methode Mustern Zellen, indem ein Silikon-Chip mit Vertiefungen, die mit Zellen auf dem Substrat gefüllt. Diese Methode bietet eine neue Art und Weise zu modulieren diffusionsfähig und juxtacrine Signalisierung zwischen den Zellen.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Zeitraffer-Aufnahme von 3D-Gewebekultur ermöglicht das Studium Zugverhalten von einzelnen Zellen, die aus ganglionären Eminenz in Reaktion auf fraktionierte Proteinextrakt aus Großhirnrinde.

Zugverhalten von Zellen in ganglionären Eminenz Kulturen Generated

Dieses Video stellt eine Methode vor, mit der C. elegans-Blastomere aus frühen Embryonen isoliert werden können. Die resultierenden Zellen eignen sich für Zellkultur- oder ex vivo-Experimente.

C. elegans Blastomer-Dissektion: Eine Methode zur Entfernung der Eierschale und zur Dissoziation embryonaler Zellen

Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C angewendet werden elegans kultivierten Zellen.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

Wir berichten über eine Vorrichtung und ein neues Verfahren Zellen und Embryonen zu untersuchen. Einzelne Zellen werden in Mikroresonator-Arrays genau bestellt. Ihre 3D Haft ist ein Schritt in Richtung 3D-Umgebungen unter physiologischen Bedingungen auf und lässt zu Organell Orientierung. Durch die Steuerung der Zellform, minimiert diese Setup-Variabilität in Standardtests berichtet.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um Aggregate von embryonalen Stammzellen der Maus zu erzeugen, die eine Selbstorganisation, Symmetriebrechung und Verlängerung parallel zur axialen Entwicklung aufweisen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung axialer Entwicklungsprozesse und die Erzeugung von Zelltypen, die sonst in Monolayer-Kulturen nur schwer durchzuführen sind.

Generation von Aggregaten von embryonalen Stammzellen der Maus, die Symmetriebrechung, Polarisation und Emergent Collective Verhalten anzeigen<em&gt; In-vitro-</em

Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Der Aufbau und die Positionierung der mitotischen Spindel hängen von den kombinierten Kräften ab, die durch die Dynamik der Mikrotubuli, Motorproteine und Vernetzer erzeugt werden. Im Folgenden stellen wir unsere neu entwickelten Methoden vor, bei denen der geometrische Einschluss von sphärischen Emulsionströpfchen für die Bottom-up-Rekonstitution basischer mitotischer Spindeln genutzt wird.

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Hier stellen wir einen kombinatorischen Ansatz vor, bei dem hochauflösende Mikroskopie, Rechenwerkzeuge und Einzellen-Beschriftungen in lebenden C. eleganischen Embryonen verwendet werden, um die Einzelzellendynamik während der Neuroentwicklung zu verstehen.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Die hier vorgestellte Methode verwendet Mikromuster ungemilzt mit quantitativer Bildgebung, um die räumliche Organisation innerhalb von Säugetierkulturen aufzuzeigen. Die Technik ist in einem Standardlabor für Zellbiologie leicht zu etablieren und bietet ein beschreibbares System zur Untersuchung von Mustern in vitro.

Kartierung der Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells mit Mikromustern und quantitativer Bildgebung

Extrazelluläre Matrixliganden können auf Polyacrylamid-Hydrogele gemustert werden, um die Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu ermöglichen. Diese Methode kann mit Traktionskraftmikroskopie und biochemischen Assays kombiniert werden, um das Zusammenspiel zwischen Gewebegeometrie, zellgenerierten Kräften und Schicksalsspezifikation zu untersuchen.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Lernen Sie die In-vitro-Rekonstitution räumlicher Zellkontaktmuster mit isolierten Caenorhabditis elegans-Embryoblastomeren und funktionalisierten Polystyrolperlen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kontaktabhängiger zellulärer Verhaltensweisen.

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen (Video) | JoVE Journal

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

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