Name: Automatisiertes Gegenstromzentrifugalsystem für die Kleinzellverarbeitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Pufferaustauschmethode für die Kleinzellherstellung mittels Gegenstromzentrifugation. Dieses geschlossene System ermöglicht hohe Zellrückgewinnung und konzentrierte Produktabgabe.

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Diese Arbeit wird durch das Operational Infrastructure Support Program der viktorianischen Regierung und den Technologiegutschein der viktorianischen Regierung unterstützt, der vom Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources bereitgestellt wird. RL ist Träger eines National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship. AL ist Träger des Australian Postgraduate Award.

1. Herstellung von Reagenzien und Zellen für den Pufferaustausch
<ol><li>Vorbereiten von Puffern (siehe Materialtabelle)in einer laminaren Strömungshaube der Klasse 2. Mit einer Spritze und Nadelbaugruppe 50 ml Salinelösung aus einem 500 ml-Salinebeutel entfernen. Ersetzen Sie dies durch 50 ml 20% humanes Serumalbumin (HSA), um 2% HSA in Saline zu bilden, was als Waschpuffer dient.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zellen aus den Kulturgefäßen, und führen Sie eine Zellanzahl aus, um die Anfangszellenmenge und Lebensfähigkeit durch Trypan-Blauausschluss zu bestimmen. Laden Sie die Zellen in einen Transferbeutel. HINWEIS: In diesem Protokoll wurden Jurkat-Zellen in RPMI und MSCs in DMEM:F12 kultiviert. Beide Medien wurden mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotischen Lösungen ergänzt. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%CO2kultiviert. Bei MSCs oder anhaftenden Zellen fügen Sie ein Verdauungsenzym (z. B. Trypsin) in die Kulturgefäße ein, um die Zellen zu lösen, und löschen Sie mit Kulturmedien, sobald die Zellen getrennt sind. In diesem Protokoll wurde ein Transferbeutel verwendet, da die Zellen in Kulturgefäßen erweitert wurden. Wenn die Zellen jedoch in einem Zellkulturbeutel kultiviert werden, kann es über steriles Rohrschweißen direkt mit dem Einweg-Kit verbunden werden. In diesem Protokoll wurden entweder 3 x 107 Jurkat-Zellen oder 1 x 107 MSCs für jeden Durchlauf verwendet, wobei Zellen in 40 ml Kulturmedien suspendiert wurden.<ol>
<li>Laden Sie Zellen in einen Transferbeutel (siehe Materialtabelle)mit einer Spritze und einer Nadelbaugruppe, wenn ein steriler Rohrschweißer zur Verfügung steht, um den Transferbeutel mit dem Einweg-Verarbeitungskit zu verbinden.</li>
		<li>Alternativ können Sie das Verbindungsrohr mit ca. 10 cm Restanstrich an der Transfertasche mit einer Autoklavenschere schneiden und am Ende des Schlauches einen weiblichen Luer-Stecker hinzufügen. Verwenden Sie eine Spritze, um Zellen und Medien zu aspirieren, schließen Sie die Spritze dann an den Luer-Stecker an und laden Sie Zellen mit dem Transferbeutel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schließen Sie den Beutel mit den Zellen, den Waschpufferbeutel mit 500 ml Waschpuffer in Schritt 1.1, Abfallbeutel und Sammelspritze an das Einweg-Kit an (Abbildung 1B). HINWEIS: Die Verbindungsposition jedes Beutels hängt von den Einstellungen im Programm ab. In diesem Protokoll haben wir den Abfallbeutel an Position A, Waschpuffer an Position B, Zellbeutel an Den Positionen D und F und Sammelspritze an Position H (Abbildung 1C) angeschlossen.</li>
</ol>2. Programm für automatisiertes Pufferaustauschprotokoll
<ol><li>Öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche (GUI) des Geräts und drücken Sie die "START"-Taste auf einem Laptop-PC oder Tablet. Öffnen Sie dann "einvorhandenes Protokoll oder drücken Sie "Neu", um ein neues zu erstellen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Schaltfläche "Vorwärts" und "Rückwärts", um durch jeden Schritt zu navigieren, wählen Sie die zu öffnenden/geschlossenen Ventile, die Zentrifugalgeschwindigkeit, die Pumpengeschwindigkeit, die Pumpenrichtung und die Aktionsauslöser aus. Die Einstellungen für jeden Schritt sind in Tabelle 1zusammengefasst. Speichern Sie dann das Protokoll.</li>
</ol>3. Einrichten der Maschine
<ol><li>Legen Sie das Einweg-Verarbeitungskit auf die Maschine und hängen Sie die angeschlossenen Beutel entsprechend auf. Drücken Sie die rote Taste "Stop/Reset", um alle Ventile in die standardmäßig geschlossene Position zurückzusetzen. HINWEIS: Die Maschine führt einen Test durch, wenn die Tür geschlossen ist, um sicherzustellen, dass das Kit richtig platziert wurde und dass alle Ventile ordnungsgemäß funktionieren.</li>
	<li>Schließen Sie die GUI an das Verarbeitungsgerät an und drücken Sie die Schaltfläche "Verbinden". Laden Sie dann das gespeicherte Programm herunter. Wenn die grüne"Play"-Taste leuchtet, zeigt sie an, dass das Protokoll startbereit ist.</li>
	<li>Öffnen Sie die manuellen Klemmen für den Transferbeutelschlauch. HINWEIS: Wenn der Bediener vergisst, die Klemmen zu öffnen, stoppt das Gerät und die Warnung des Drucksensors wird angezeigt. Drücken Sie die Taste "Stopp", um das Gerät zurückzusetzen und die Klemmen zu öffnen, um erneut zu starten.</li>
</ol>4. Automatisierter Pufferaustausch
<ol><li>Drücken Sie "Start", um das Pufferaustauschprogramm zu initiieren. HINWEIS: Um den automatisierten Prozess manuell zu ändern, drücken Sie die Taste"Nächster", um zum nächsten Schritt zu wechseln, bevor Sie denTriggererreichen, oder drücken Sie "Pause", um den Prozess in Schach zu halten. Dadurch werden die Zellen durch das Kit umgewälzt, während nur die Ventile J und K geöffnet bleiben (Abbildung 1C).</li>
	<li>Am Ende von Automatisierungsschritt 6 (Tabelle 1) wird der Prozess angehalten, wenn Luft im nun geleerten Beutel den Blasensensor auslöst. Drücken Sie "Weiter", um den Prozess auf den nächsten Schritt zu verschieben, wenn der Beutel tatsächlich leer ist, oder drücken Sie "Pause", um die Verarbeitung fortzusetzen, wenn der Sensor durch eine Blase in der Linie ausgelöst wurde.</li>
</ol>5. Sammeln und Abtasten der Zellen
<ol><li>Wenn der automatisierte Prozess abgeschlossen ist, schließen Sie alle Rohrklemmen. Öffnen Sie die Tür und nehmen Sie das Einweg-Kit aus dem Gerät. Trennen Sie die Spritze, um die Zellen für nachfolgende Prozesse zu sammeln. Nehmen Sie eine Probe der gesammelten Zellen für eine Zellanzahl und Lebensfähigkeitsprüfung (siehe Schritt 6.2).</li>
</ol>6. Prozessvalidierung
<ol><li>Führen Sie Steuerungsexperimente mit einem manuellen Pufferaustauschprotokoll durch.<ol>
<li>Zentrifugenzellsuspension bei 200 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 30 ml Zellwaschpuffer wieder auf. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min wieder bei 200 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 10 ml Zellwaschpuffer wieder auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Zellzählung über den Trypan-Blau-Ausschluss-Assay durch, um die Zelllebensfähigkeit mithilfe eines automatisierten Zellzählers zu bewerten.</li>
	<li>Führen Sie einen MTS-Test durch, um die Zellproliferation bei 2, 24 und 48 h zu quantifizieren. HINWEIS: Der MTS-Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers auf einer 96-Well-Gewebekulturplatte durchgeführt. Nach dem Pufferaustauschprozess wurden 100 L Aliquot zellkulturmedien (mit 10.000 Jurkat-Zellen oder 1.500) pro Bohrgut plattiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden in jedem Brunnen 20 L MTS-Reagenzien zugegeben und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde mit einem Plattenleser bei 490 nm bewertet.</li>
	<li>Führen Sie funktionale Assays durch, um die Auswirkungen des automatisierten Prozesses mit dem manuellen Prozess auf die Jurkat-Zellen und die MSC-Funktion zu vergleichen.<ol>
<li>Kultur Jurkat-Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml stimuliert mit 50 ng/ml Phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA) und 1 g/mL-Ionomycin (Zellstimulationscocktail) in DMEM:F12-Medien mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) für 24 h. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2.</li>
		<li>Messen Sie die Interleukin-2-Produktion von Kulturüberstand mit perlenbasiertem ELISA-Assay (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Kultur MSCs in einer 12-Well-Platte bei der Dichte von 10.000 Zellen/cm2 in 1 ml DMEM:F12-Medien, die 10% FBS enthalten, ergänzt enden mit Interferon-50 Einheiten/ml für 48 h. Sammeln Überstand für den Kynurenin-Konzentrationstest zur Messung der Indollin-2,3-Dioxygenase (IDO)-Enzymaktivität von MSCs wie zuvor beschrieben21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+1%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li>
<li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factories+of+the+future%3A+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li>
<li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li>
<li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translation+of+cell-based+therapies%3A+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li>
<li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li>
<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li>
<li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li>
<li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%3A+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li>
<li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stromal+Cells%3A+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+%28CAR+T-Cells%29+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152(2018).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li>
<li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+automation+in+process+development%2C+manufacture+of+cell%2C+gene-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li>
<li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li>
<li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+%28CFCL%2FCCE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li>
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</ol>

SW, IF und DJ sind COO, CTO und CEO von Scinogy Pty. Ltd. Der Zugriff auf das CFC-Gerät wurde ebenfalls von Scinogy bereitgestellt.

Das beschriebene automatisierte Pufferaustauschprotokoll ist einfach und benutzerfreundlich. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte in diesem Protokoll, die kritisch sind und besondere Aufmerksamkeit erfordern. Nach unserer Erfahrung sollte jeder Durchlauf bei der Verarbeitung größerer Zellen wie MSCs (durchschnittlicher Durchmesser 10–15 m) mindestens 1 x 107 Zellen umfassen, um eine optimale Zellwiederherstellung zu erreichen (Abbildung 4B). Die Verarbeitung k...

Die Landschaft der modernen Medizin hat sich durch die jüngsten Entwicklungen in Gen- und Zelltherapien (GCT) rasant verändert. Als eines der am schnellsten wachsenden Bereiche der Translationsforschung steht auch der GCT-Sektor vor einzigartigen und beispiellosen Herausforderungen. Neben robusten klinischen Ergebnissen sind effiziente und kostengünstige Herstellungsverfahren entscheidend für den wirtschaftlichen Erfolg von GCT, der in der Kleinfertigung besonders schwer zu erreichen ist1. Die Kosten für Zeit, Arbeit und Qualitätssicherung werden erhöht, wenn jede Zellcharge nur wenige Dosen für einen Patienten anstatt für Hunderte oder Tausende produziert. Im Gegensatz zu allogenen Zelltherapien, bei denen die Herstellungsverfahren eher der Produktion von Antikörpern und rekombinanten Proteinen ähneln, werden autologe Zelltherapien typischerweise als kleinräumige Operationen produziert1. Als relativ neues Phänomen in der biopharmazeutischen Fertigung2sind die Möglichkeiten für die Zellverarbeitung in kleinem Maßstab derzeit recht begrenzt.
Der Pufferaustausch ist für die Zellfertigung unerlässlich. Es ist einer der nachgelagerten Prozesse, bei denen Zellen aus Kulturmedien entfernt und zur Kryokonservierung oder Infusion konzentriert werden. Derzeit wendet die Herstellung von Kleinzellen häufig Ähnliche Prozesse an wie im akademischen Forschungsumfeld und setzt auf spezialisierte Reinräume, um die Sterilität zu erhalten3. Manuelle nachgelagerte Prozesse verwenden häufig Tischzentrifugen, um Zellen zur Volumenreduzierung und Pufferaustausch zu besinnen und wieder auszusetzen. Diese offenen Prozesse sind kostspielig (d.h. Arbeits- und Reinraumpflege) und haben eine begrenzte Fertigungskapazität, die nicht ideal für die kommerzielle Produktion2,3sind.
Die Implementierung von Automatisierung wurde als Lösung zur Verbesserung der Fertigungseffizienz und zur Erreichung kommerzieller Produktionenvorgeschlagen 2. Sterilität kann in zellbasierten Produkten nicht durch traditionelle Methoden für Biologika wie Gammabestrahlung oder Endendfiltration erreicht werden. Stattdessen wird ein automatisiertes geschlossenes System eingesetzt, um das Risiko von Kontaminationen zu reduzieren, und Betreiber, die auf Reinräume angewiesen sind, um die Sterilität zu erhalten4. Die Prozessautomatisierung behebt auch das Problem der Skalierbarkeit, indem entweder mehrere Systeme parallel ausgeführt werden (Scale-out) oder die Verarbeitungskapazität eines einzelnen Geräts erhöht wird (Scale-up), wodurch die Variabilität zwischen den Operatoren minimiert wird. Darüber hinaus legt die Kostenmodellierungsanalyse autologer Therapiennahe, dass die Automatisierung die Herstellungskosten 5,6reduzieren kann. In einer autologen klinischen Stammzellstudie, in der eine automatisierte Fertigungsplattform verwendet wurde, wurde jedoch kein Kostenvorteil festgestellt7, was darauf hindeutet, dass der Kostenvorteil der Automatisierung vom einzelnen Herstellungsprozess abhängen kann.
Es gibt verschiedene Strategien, mit denen Automatisierung in einen bestehenden Fertigungsprozess eingeführt werden kann. Dies kann entweder durch die Implementierung einer vollständig integrierten Plattform oder einer modular enden basierten Verarbeitungskette erreicht werden. Es gibt mehrere voll integrierte Plattformen, die für die autologe Zellherstellung kommerziell erhältlich sind, wie CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) und Quantum (Terumo BCT). Diese integrierten Plattformen, die oft als "GMP-in-a-box" bezeichnet werden, haben geringe Anforderungen an die Infrastruktur und sind einfach zu bedienen. Die Fertigungskapazität eines vollständig integrierten Setups kann jedoch durch den an das System angeschlossenen Inkubator eingeschränkt werden. Beispielsweise ist die Kultivierungskapazität von Prodigy auf seine 400 ml Kammer8 begrenzt und die Quantum-Patrone hat eine begrenzunge Oberfläche von 2,1m2 (entspricht 120 T175-Kolben)7, was für Patienten, die höhere Zelldosenbenötigen, möglicherweisenicht ausreicht 9,10. Darüber hinaus haben Prodigy und Quantum ein gemeinsames Attribut, das ihre Verwendung einschränkt: Die Betriebseinheit wird während des gesamten Zellexpansionszeitraums von einer einzigen Charge nutzbesetzt, wodurch die Anzahl der Chargen begrenzt wird, die von jeder Einheit11hergestellt werden können. Der modulare Automatisierungsansatz besteht darin, eine Fertigungskette mit mehreren modularen Einheiten zu schaffen, die den kommerziellen Fertigungsprozess simuliert12,13. Dieser Ansatz, der das Kulturgerät vom Zellwaschgerät trennt, kann dadurch die Fertigungseffizienz maximieren. Ein ideales Verarbeitungsgerät wäre ein, das anpassungsfähig und skalierbar an Fertigungsanforderungen12ist.
Die CFC-Technologie (Counterflow Zentrifufugation), die bis in die 1970er Jahre zurückreicht, hat eine lange Geschichte in der Zellverarbeitung14. Es erreicht Zellkonzentration und Trennung durch Ausgleich der Zentrifugalkraft mit einer Gegenströmungskraft. Typischerweise tritt eine Zellsuspension vom schmalen Ende einer Zellkammer unter einer konstanten Durchflussrate ein, während sie einer Zentrifugalkraft ausgesetzt ist (Abbildung 1A). Der Fluss der Flüssigkeit wird in entgegengesetzter Richtung zur Fliehkraft ausgeübt. Dies wird als Gegenstromkraft bezeichnet, die einen Gradienten innerhalb der Zellkammer bildet. Die Gegenströmungskraft nimmt dann ab, wenn sich die Zellkammer von der Spitze der kegelförmigen Zellkammer wegweitet. Zellen mit höherer Dichte und größerem Durchmesser haben eine höhere Sedimentationsrate und erreichen so das Kraftgleichgewicht zur Spitze der kegelförmigen Zellkammer. Kleinere Partikel können das Gleichgewicht zur Basis der Kammer erreichen oder zu klein sein, um in der Kammer zurückgehalten zu werden und werden weggewaschen. Die FCKW-Technologie ist vor allem für ihre Anwendung in der Verarbeitung von Blutapherese-Produkten bekannt, wie die Isolierung von Monozyten für dendritische Zelltherapien15,16. Im Hinblick auf den Pufferaustausch wurde die FCKW-Technologie nur in der Großfertigung17 eingesetzt und muss noch für die kleinere Herstellung von autologen Zelltherapien eingesetzt werden.
Um dem Bedarf an einem geeigneten Gerät für die Herstellung kleiner Zellen gerecht zu werden, wurde kürzlich ein automatisiertes FCKW-Gerät (siehe Materialtabelle)entwickelt. Das automatisierte Zellverarbeitungsgerät nutzt die Gegenflusszentrifugationstechnologie, um Zellablagerungen zu entfernen und den Pufferaustausch zu erleichtern. Das Gerät führt einen Pufferaustausch mit einem Einweg-Kit durch, das steril mit einem Zelltransferbeutel verbunden werden kann, wodurch die Zellen in einem sterilen, geschlossenen System verarbeitet werden können. Hier untersuchen wir den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalgeräts zur Durchführung eines Pufferaustauschs in Säugetierzellkulturen in automatisierten Protokollen. In dieser Studie testeten wir das Pufferaustauschprotokoll mit Jurkat-Zellen und mesenchymalen Stromalzellen (MSCs), um nicht haftende bzw. anhaftende Zelltypen zu modellieren. Jurkat-Zellen sind verewigte T-Zellen, die häufig für die Untersuchung der akuten T-Zell-Leukämie19,20verwendet werden. MSCs sind adulte Stammzellen, die in klinischen Studien am Menschen für eine Vielzahl von Krankheiten untersucht wurden9.

<table><tbody><tr><td>20 ml Luer-Lock-Spritzen</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>20% Humanserumalbumin (HSA)</td><td>CSL Behring</td><td>AUST R 46283</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156477-25g</td><td></td></tr><tr><td>500ml IV Kochsalzbeutel</td><td>Fresenius Kabi</td><td>K690521</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger für Zellzählkammern</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Zellstimulationscocktail (500x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4970-93</td><td></td></tr><tr><td>Zelltransferbeutel</td><td>Terumo</td><td>T1BBT060CBB</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Zellproliferationsassay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>DMEM: F12 Medien</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>Al221C</td><td></td></tr><tr><td>Luer (weiblich) Anschlüsse</td><td>CPC</td><td>LF41</td><td></td></tr><tr><td>PC Laptop oder PC Tablet</td><td>Gerät ASUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser (SpectraMax i3)</td><td>Molekulares Gerät</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human IFN-& gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Rotea Gegenstrom-Zentrifugen-Zellverarbeitungsgerät</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rotea Einweg-Verarbeitungskit</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medien</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>ProSciTech</td><td>420SS</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399-250g</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Verdauungsenzym (TrypLE Express Enzym)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 12604013</td><td></td></tr></tbody></table>

automatisiertes gegenstromzentrifugalsystem für die kleinzellverarbeitung

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Eine erfolgreiche Kommerzialisierung von Gen- und zellbasierten Therapien erfordert kostengünstige und skalierbare Herstellungsprozesse. Pufferaustausch und Produktkonzentration sind wesentliche Komponenten für die meisten Fertigungsprozesse. In den frühen Stadien der Produktentwicklung werden diese Schritte jedoch häufig manuell ausgeführt. Die manuelle Sackgassenzentrifufugation für den Pufferaustausch ist arbeitsintensiv, kostspielig und nicht skalierbar. Ein geschlossenes automatisiertes System kann diesen mühsamen Schritt effektiv eliminieren, aber die Implementierung kann eine Herausforderung sein. Hier beschreiben wir ein neu entwickeltes Zellverarbeitungsgerät, das sich für die kleine bis mittlere Zellverarbeitung eignet und die Lücke zwischen manueller Verarbeitung und großflächiger Automatisierung überbrücken soll. Dieses Protokoll kann einfach auf verschiedene Zelltypen und Prozesse angewendet werden, indem die Durchflussrate und die Zentrifugationsgeschwindigkeit geändert werden. Unser Protokoll zeigte eine hohe Zellwiederherstellung mit kürzeren Verarbeitungszeiten im Vergleich zum manuellen Prozess. Zellen, die sich aus dem automatisierten Prozess erholten, hielten auch ihre Proliferationsraten aufrecht. Das Gerät kann als modulare Komponente in einem geschlossenen Fertigungsprozess eingesetzt werden, um Schritte wie Pufferaustausch, Zellformulierung und Kryokonservierung aufzunehmen.

In diesem Protokoll haben wir Jurkat-Zellen und MSCs als repräsentative Beispiele verwendet, um den automatisierten Pufferaustauschprozess zu demonstrieren. Während des Prozesses teilten Jurkat-Zellen und MSCs die gleichen Verarbeitungsschritte mit Unterschieden in der Zentrifugalkraft und Pumpengeschwindigkeit, die die Durchflussmenge steuern (Tabelle 1). Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder, die von der Kamera aufgenommen wurden, wie das wirbelgebundene Zellbett während...

Automatisierung ist der Schlüssel zum Upscaling und Kostenmanagement in der Zellfertigung. Dieses Manuskript beschreibt den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalzellverarbeitungsgeräts zur Automatisierung des Pufferaustauschs und der Zellkonzentrationsschritte für die kleinräumige Bioverarbeitung.

Automatisiertes Gegenstromzentrifugalsystem für die Kleinzellverarbeitung

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Dieses Protokoll bietet eine Lösung für den geschlossenen automatisierten Pufferaustausch und die Konzentration für die Herstellung kleiner Zellen. Wichtig ist, dass der Pufferaustausch mit einer hohen Rückgewinnung und einer Lieferung eines sehr kleinen Volumens konzentrierter Produkte durchgeführt werden kann. Neue Benutzer können Schwierigkeiten haben, alle Automatisierungsschritte zu befolgen.Das Programmieren dieser Schritte und das Durchführen von Testläufen mit Medium sind gute Möglichkeiten, sich mit dem Gerät vertraut zu machen. Bevor Sie mit dem Pufferaustausch beginnen, verwenden Sie in einem laminaren Strömungskopf der Klasse 2 eine Spritze und eine Nadeleinheit, um 50 Milliliter Saline-Lösung aus einem 500 Milliliter-Salinebeutel zu entfernen. Ersetzen Sie dieses Volumen durch 50 Milliliter 20% menschliches Serumalbumin, und ernten Sie die Zellen von Interesse aus ihren Kulturgefäßen.Verwenden Sie nach dem Zählen die Spritze, um die Zellen in einen Transferbeutel zu laden, und schließen Sie den Transferbeutel mit dem Luer-Schloss an ein Einweg-Verarbeitungskit an. Dann verbinden Sie den zuvor vorbereiteten Beutel mit Waschpuffer mit dem Einweg-Verarbeitungskit. Um einen automatisierten Pufferaustausch einzurichten, öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche des Geräts, und klicken Sie auf die Startschaltfläche.Klicken Sie auf neu, um ein neues Protokoll zu erstellen, und klicken Sie auf Diesteuerung, um die zu öffnenden und zu schließenden Ventile, die Zentrifugal- und Pumpengeschwindigkeiten, die Pumpenrichtung und die Aktionsauslöser auszuwählen. Wenn alle Parameter festgelegt wurden, klicken Sie auf Speichern. Hängen Sie die angeschlossenen entsprechenden Beutel auf das Gerät und legen Sie das Einweg-Verarbeitungskit auf die Maschine.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Verbinden und laden Sie das gespeicherte Programm herunter. Wenn die Wiedergabetaste leuchtet, kann das Protokoll gestartet werden. Um den automatisierten Pufferaustausch durchzuführen, öffnen Sie die manuellen Klemmen für den Transferbeutelschlauch, und klicken Sie auf Starten, um das Pufferaustauschprogramm zu initiieren.Am Ende des Automatisierungsschritts sechs wird der Prozess aufgrund der Auslösung des Blasensensors durch die Luft im nun leeren Beutel angehalten. Wenn die Tasche tatsächlich leer ist, drücken Sie neben, um den Vorgang zum nächsten Schritt zu verschieben. Wenn der automatisierte Prozess abgeschlossen ist, schließen Sie alle Rohrklemmen und öffnen Sie die Tür des Geräts.Entfernen Sie dann das Einweg-Kit aus dem Gerät und trennen Sie die Spritze, damit die Zellen für die nachfolgende Analyse gesammelt werden können. Typischerweise erscheint das wirbelierte Zellbett wie in diesem Bild dargestellt mit den Zellen, die sich in der Mitte und zur Vorderseite des Kegels ansammeln, einem kleinen Raum an der Spitze der Kammer, in dem sich die Zellen nicht ansammeln, und einer sichtbaren Öffnung innerhalb des Zelleinlasses. Das wirbelierte Zellbett kann komprimiert werden, wenn ein neuer Puffer eingeführt wird, der sich in einer anderen Viskosität oder Dichte befindet.Eine hohe Durchflussrate kann angewendet werden, um für lebende Zellen auszuwählen, da abgestorbene Zellen kleiner und leichter sind und durch Erhöhung der Durchflussrate aus der Kammer herausgedrängt werden können. Der automatisierte Prozess der Pufferaustauschverarbeitungszeit ist kürzer als der des manuellen Pufferaustauschprozesses. In dieser Analyse waren die Wiederherstellungsraten zwischen dem manuellen und dem automatisierten Prozess für beide getesteten Zelltypen ähnlich, und die Zelllebensfähigkeit wurde von keinem der beiden Prozesse beeinflusst.Die zurückgewonnenen Zellen zeigten ähnliche Proliferationsraten, Fähigkeiten zur Herstellung von Zytokinen und Ideo-Aktivitäten, unabhängig von der Art der Verarbeitung. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Protokoll nur als Richtlinie dient, und daher müssen Benutzer die Durchflussrate und Zentrifugationsgeschwindigkeit entsprechend ihrem Zelltyp und Puffer programmieren. Pufferaustausch ist ein Zwischenschritt in der Zellherstellung, der der Zellkulturexpansion oder Kryokonservierung und Formulierung folgen kann.Ziel ist es, Wege zu entwickeln, um den gesamten Prozess einzuschließen. Die Gegenflusszentrifufugation ist eine sehr vielseitige Plattform. Zukünftige Studien werden Anwendungen in der Zellauswahl untersuchen, wie z. B. die Entfernung von toten Zellen und die Mononukleuszellisolierung aus einem Chorisis-Produkt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Dieses Protokoll beschreibt eine Systemarchitektur für die Durchführung automatisierter Partikeltrennungen mit kleinen Volumina (0,15–1,5 ml) unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts und diskutiert Methoden zur Optimierung der Leistung und des Betriebs von akustofluidischen Geräten.

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Dieses Papier stellt eine Methode zum Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen, mehrkanaligen Perfusionszellkultursystems zur Messung der Dynamik der Sekretions- und Absorptionsraten von gelösten Stoffen in zellulären Prozessen vor. Das System kann Zellen auch dynamischen Reizprofilen aussetzen.

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem adhärente Zellen aus mehrschichtigen Kolben in einer geschlossenen, halbautomatischen Weise unter Verwendung eines Gegenstromzentrifugationssystems gewonnen werden können. Dieses Protokoll kann sowohl für die Ernte von adhärenten als auch von Suspensionszellen von anderen Zellexpansionsplattformen mit wenigen Änderungen an den bestehenden Schritten angewendet werden.

Humane mesenchymale Stammzellprozessierung für klinische Anwendungen in einem geschlossenen, halbautomatischen Workflow

Extrazelluläre Vesikel sind für biomedizinische Anwendungen sehr vielversprechend, aber die derzeitigen Isolierungsmethoden sind zeitaufwändig und für den klinischen Einsatz unpraktisch. In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das die direkte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großen Mengen von Bioflüssigkeiten in einer kontinuierlichen Weise mit minimalen Schritten ermöglicht.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Beschleunigung der Plasmid-DNA-Extraktion. Durch die Verwendung von maßgeschneiderten 3D-gedruckten Racks, die mit Standardrotoren mit Schaufelplatten kompatibel sind, können Forscher bis zu 48 Rotationssäulen mit Kappen oder bis zu 116 Rotationssäulen ohne Kappen gleichzeitig verarbeiten, was die Handhabungszeit im Vergleich zu manuellen Mikrozentrifugenmethoden deutlich verkürzt.

Mitteldurchsatz-Säulen-DNA-Extraktion mit 24-Well-Racks

Erfahren Sie die automatisierte Pufferaustauschmethode für die Kleinzellherstellung mittels Gegenstromzentrifugation. Dieses geschlossene System ermöglicht hohe Zellrückgewinnung und konzentrierte Produktabgabe.

Automatisiertes Gegenstromzentrifugalsystem für die Kleinzellverarbeitung

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