Erhöhung der Haltbarkeit dissoziierter neuronaler Zellkulturen unter Verwendung biologisch aktiver Korallenmatrix

Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es eine neue Möglichkeit bietet, die Haltbarkeit und das Wachstum von Neuronen, Gliazellen und Stammzellen in vitro zu erhöhen. Es ist auch für andere Zellen anwendbar. Der Hauptvorteil der Technik ist die Verwendung einer Matrix aus Korallenskelett.

Diese Matrix nährt und schützt die Neurozellen und fördert das Nachwachsen. Da das Korallenskelett in vitro die Nervenzellen unterstützt, kann es ähnlich wie ein regeneratives Implantat an Stellen von Hirnverletzungen funktionieren. Zu Beginn zerkleinern Sie das Korallenskelett mit einem Hammer und teilen es in 0,5 bis zwei Zentimeter große Fragmente.

Um organische und anorganische Rückstände aufzulösen, weichen Sie die Fragmente des Korallenskeletts 10 Minuten lang in 10%iger Natriumhypochloritlösung ein. Dann einmal mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Um die restlichen organischen Rückstände zu entfernen, weichen Sie die Fragmente fünf Minuten lang in einer einmolaren Natronlauge ein und waschen Sie sie dann einmal mit doppelt destilliertem Wasser.

Fahren Sie mit der Entfernung der organischen Ablagerungen fort, indem Sie die Fragmente 10 Minuten lang in 30%iger Wasserstoffperoxidlösung einweichen und die Fragmente dreimal mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Entfernen Sie so viel überschüssiges doppelt destilliertes Wasser wie möglich und lassen Sie die Korallenfragmente in der Haube trocknen. Reinigen Sie dann die Glasabdeckfolien, indem Sie sie in einer 100-Millimeter-Glas-Petrischale in 10 Millilitern 95%igem Ethanol einweichen.

Entfernen Sie nach 15 Minuten das Ethanol und waschen Sie es dreimal mit doppelt destilliertem Wasser, wobei Sie zwischen jedem Waschgang 10 Minuten warten. Entfernen Sie das doppelt destillierte Wasser und stellen Sie das Gericht auf eine vorgewärmte Heizplatte mit 80 Grad Celsius. Rühren Sie dann vorsichtig die Deckgläser um, bis das doppelt destillierte Wasser verdampft ist.

Autoklavieren Sie die Deckgläser. Zermahlen Sie die Fragmente des Korallenskeletts mit einem Mörser und Stößel, bis sie vollständig zerfallen sind. Es wird eine Mischung von Körnern mit Größen von 20 bis 200 Mikrometern erhalten.

Alternativ können Sie die Korallenskelettfragmente mit einer elektrischen Schleifmaschine mit einer Klingenlänge von sechs Zentimetern und einer Breite von 0,5 bis einem Zentimeter bei einer Geschwindigkeit von 1000 U/min für 30 Sekunden schleifen. Um die Körner zu reinigen, geben Sie die Körner auf ein elektrisches 40-Mikron-Filtersieb. Stellen Sie das elektrische Sieb so ein, dass es mit 600 Amplituden pro Minute schüttelt und sechsmal pro Sekunde hüpft.

Dann die Körner autoklavieren. Unter sterilen Bedingungen werden die Körner des Korallenskeletts in ein 20 Mikrogramm pro Milliliter PDL gegeben, das in Hanks Lösung gelöst ist, um die Konzentration von fünf Milligramm oder 10 Milligramm Körnern pro einem Milliliter PDL-Lösung zu erreichen. Die Lösung wird in einer Konzentration von etwa zwei Millilitern pro 25 Quadratzentimeter in Kolben und Schalen gegossen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.

Die Körner sinken ab und setzen sich am Boden fest. Waschen Sie am nächsten Tag die Kolben und das Geschirr einmal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser. Lassen Sie die Kolben und das Geschirr in der Haube trocknen.

Um das Deckglas zu beschichten, geben Sie zunächst Korallenskelettkörner in doppelt destilliertes Wasser in einer Konzentration von fünf oder 10 Milligramm pro Milliliter. Legen Sie die Deckgläser auf eine auf 80 Grad Celsius vorgewärmte Heizplatte. Dann träufeln Sie 40 Mikroliter der Getreidelösung auf die Mitte des Deckglases und warten Sie 15 Minuten, bis sie vollständig verdunstet ist.

Dies führt dazu, dass die Körner am Deckglas haften bleiben. Autoklavieren Sie die beschichteten Deckgläser und lagern Sie sie steril. Legen Sie anschließend die Deckgläser auf den Deckel einer sterilen 24-Well-Platte und fügen Sie 100 Mikroliter PDL-Lösung von 20 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Deckglas hinzu.

Stellen Sie mit der Spitze sicher, dass die Flüssigkeit den gesamten Kornbereich und den Rest der Deckglasoberfläche bedeckt. Decken Sie den Deckel mit dem Boden der Platte ab und umwickeln Sie die Seiten der Stelle mit Paraffinfolie. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Waschen Sie die Eindeckeinlagen am nächsten Tag einmal mit doppelt destilliertem Wasser und trocknen Sie sie in der Kapuze. Nachdem Sie die Köpfe der Rattenwelpen vorbereitet haben, halten Sie sie mit einer großen Pinzette aus dem Mund. Schneide die Haut, die den Schädel bedeckt, mit einer kleinen Schere ab.

Dringen Sie mit einer sauberen Schere seitlich des Kleinhirns unter den Schädel ein und schneiden Sie den Schädel nach rechts und links, um ihn entfernen zu können. Schälen Sie mit einer kleinen Pinzette den Schädel vom Gehirn ab. Trennen Sie das Gehirn vom Kopf und legen Sie es in eine 60-Millimeter-Petrischale, die zwei Milliliter kaltes MEM enthält.

Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop zwei kleine Pinzetten, um die Hippocampi zu sezieren. Den Hippocampus in die vorbereitete 35-Millimeter-Schale mit MEM geben. Schneide die Hippocampi mit dem Skalpell in etwa einen Millimeter große Scheiben.

Fügen Sie 200 Mikroliter Trypsinlösung hinzu. Vorsichtig mischen und bei 37 Grad Celsius und fünf bis 10 % Kohlendioxid 30 Minuten lang inkubieren. Geben Sie nach der Inkubation zwei Milliliter kaltes MEM in die Schale, um das Trypsin zu deaktivieren.

Verwenden Sie dann eine Pasteurpipette aus Glas mit dem größten Durchmesser, um das trypsinisierte Gewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, das einen Milliliter des auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Mediums für den ersten Tag enthält. Zerreiben Sie das Gewebe, indem Sie es 10 bis 15 Mal durch die Glaspipette mit dem größten Durchmesser führen. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang mit der Glaspipette mit dem mittleren Durchmesser.

Mit der Pipette mit dem kleinsten Durchmesser weiter verreiben. Vermeiden Sie Blasenbildung, um den Zelltod zu reduzieren. Lassen Sie die abgetrennten Gewebestücke zwei bis fünf Minuten einsinken.

Füllen Sie dann den Überstand in ein weiteres 15-Milliliter-Röhrchen um. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Um die bevorzugte Zelldichte zwischen 200.000 und 400.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Verwenden Sie das Medium am ersten Tag zur Verdünnung. Als nächstes säen Sie 100 Mikroliter Zellen auf jedem Glasdeckglas. Achten Sie darauf, dass das gesamte Deckglas mit Zellen bedeckt ist.

Inkubieren bei 37 Grad Celsius und fünf bis 10 % Kohlendioxid. Geben Sie am nächsten Tag 500 Mikroliter neuronales Wachstumsmedium in die Vertiefungen. Entfernen Sie mit einer Pinzette das Medium für den ersten Tag, indem Sie das Deckglas kippen und jedes Deckglas vorsichtig in die entsprechende Vertiefung legen.

Saugen Sie das restliche Medium vom Deckel ab. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und fünf bis 10 % Kohlendioxid. Halten Sie den Inkubator mit einer Schale mit Wasser am Boden des Inkubators maximal befeuchtet.

Tauschen Sie das Medium nicht aus. Kulturen können unter diesen Bedingungen bis zu einem Monat aufbewahrt werden. In dieser Studie lieferten sowohl das manuelle Schleifen als auch die elektrischen Schleifmaschinen ähnliche Ergebnisse mit einer Mischung von Körnern zwischen 20 und 200 Mikrometern.

Die manuellen oder elektrischen Siebe erzeugten zwei Arten von Getreidemischungen. Einer mit Körnern von 40 bis 200 Mikrometern Größe und der zweite mit einer Größe von 40 Mikrometern oder weniger. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Kultivierung von Hippocampuszellen auf Deckgläsern, die mit Korallenskelettkörnern beschichtet waren, in Abwesenheit und Gegenwart der Matrix komplexe neuronale Netzwerke bildete.

Die Zellkernfärbung zeigte, dass 14 Tage nach der Aussaat die Zelldichte auf der Matrix höher war als auf den unbeschichteten Deckgläsern. Die Färbung mit Mikrotubuli-assoziiertem Protein zwei zeigte, dass sich auf der Matrix im Vergleich zur Kontrolle ein komplexes neuronales und dendritisches Netzwerk bildete. Darüber hinaus erfuhren Gliazellen, die auf der Korallenskelettmatrix gezüchtet wurden, die mit dem sauren Protein der Gliafibrillen sichtbar gemacht wurden, signifikante morphologische Veränderungen.

Sie erhielten ein stacheligeres Aussehen mit längeren Fortsätzen als die auf dem Kontrollsubstrat gezüchteten Gliazellen, wo sie runder und flacher erschienen. Bei der Isolierung der Zellen ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten, den pH-Wert durch Zugabe von CO2 aufrechtzuerhalten, falls erforderlich, und so sanft wie möglich zu arbeiten, um eine Ablösung der Korallenkörner zu verhindern.