Name: Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Transwell-Kokulturmethode zur Untersuchung parakriner Signale von Tumorzellen und deren immunsuppressiver Wirkung auf Makrophagen. Diese Technik ermöglicht die Analyse sekretierter Faktoren ohne direkten Zellkontakt.

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Eric Ubil wurde zum Teil vom American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB) finanziert. Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (R01-CA205398) und einen Breast Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) an DIE HSE unterstützt.

Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Ernte und Verwendung von murinen Peritonealmakrophagen wurden an der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) durchgeführt und vom UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Makrophagenkultur
HINWEIS: Bei diesem Verfahren können primäre peritoneale Makrophagen (siehe unten im Detail), knochenmarkabgeleitete Makrophagen oder Makrophagenzelllinien wie J774 (ATCC) oder RAW264 (ATCC) verwendet werden.
<ol><li>Ernte peritoneale Makrophagen wie zuvor beschrieben16,17 und Platte direkt in die obere Kammer(n) einer 0,4 m Polyestermembran einfügen Co-Kultur 6 WellPlatte (Abbildung 1A). ANMERKUNG: Die ungefähre Ausbeute von Makrophagen aus jeder Isolierung beträgt 1 x 106 Zellen insgesamt, so dass die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Bohrkörper 1,5–1,6 x 105 Zellen in einer 6-Well-Platte beträgt.</li>
	<li>Kultur die geernteten Makrophagen in Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x Penicillin/Streptomycin, 20 ng/mL Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (M-CSF) für 3 Tage bei 37 °C, 5% CO2. ANMERKUNG: Die obere Kammer enthält 1 ml Kulturmedium, während die untere Kammer mit 1,5 ml gefüllt ist. Das Medium muss jeder Kammer hinzugefügt werden.</li>
</ol>2. Kokultur von Tumorzellen mit Makrophagen
<ol><li>Vor der Anwendung, Kultur kommerziell erhältlich Tumorzellen in ihrem jeweiligen Medium nach ATCC-empfohlenen Gewebekultur-Methoden.</li>
	<li>Anhängsige Tumorzellen einmal mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen, 0,05% Trypsin + Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügen und bei 37 °C brüten, bis sich die Zellen lösen. Setzen Sie die Zellen in FBS, die medium enthalten, wieder aus, quantitieren Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler und zentrieren Sie dann für 5 min bei 220 x g pellet.</li>
	<li>Während der Zentrifugation das Medium aus den oberen und unteren Kammern der makrophagenhaltigen durchlässigen Membranträgerplatten ansaugen und durch frisches Medium ersetzen.<ol>
<li>Für niedrigere Kammern, in denen Tumorzellen plattiert werden, füllen Sie mit 1 ml Medium statt 1,5 ml, um ein ausreichendes Volumen für die Zellzugabe zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie Daseinspirieren von pelletierten Tumorzellen und Resuspendzellen in DMEM/F12 mit 10% FBS, 1x Penicillin/Streptomycin und 20 ng/ml M-CSF in einer Konzentration von 3 x 105 Zellen/ml.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml von 3 x 105 Zellen/ml Tumorzellen in die untere Kammer der gewünschten Brunnen ein (Abbildung 1B). HINWEIS: Zellen können sofort behandelt werden.</li>
</ol>3. Behandlung von ko-kultivierten Zellen
<ol><li>Um die pro-inflammatorische Genexpression der Makrophagen zu induzieren, behandeln Sie singly oder co-cultured Makrophagen, indem Sie 100 ng/mL IFN und 50 ng/ml LPS hinzufügen.<ol>
<li>Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von 2 h und einige tumorvermittelte Unterdrückung enden durch 8 h. Co-Kultur für 24 h ergibt eine robuste und konsistente tumorabgeleitete Unterdrückung. HINWEIS: Alternativ können Makrophagen durch Zugabe von Faktoren wie Interleukin-10 (IL10) und der Wirkung des tumorseften Liganden zur Annahme eines pro-wundheilenden Phänotyps induziert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als negativer Kontrolle, Kultur Makrophagen singly und lassen unbehandelt. Behandeln Sie als Positivkontrolle singly kultivierte Makrophagen mit 100 ng/mL IFN und 50 ng/ml LPS.</li>
</ol>4. Nachgelagerte Analyse von ko-kultivierten Zellen
<ol><li>Nachdem die gewünschte Inkubationszeit verstrichen ist, isolieren Sie das Zelllysat oder konditionierte Kulturmedium je nach Testbedarf nach Belieben.</li>
	<li>Um das Zelllysat für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu isolieren, die Medien aus beiden Kammern des Brunnens zu aspirieren und einmal mit 2 ml PBS zu waschen. Tragen Sie den RNA-Lysepuffer auf die obere Kammer auf, die die Makrophagen enthält. Kratzen Sie die Membran vorsichtig, um das Zelllysat freizusetzen, und übertragen Sie es zur Weiterverarbeitung gemäß dem Protokoll des Herstellers des RNA-Isolationskits in ein Sammelrohr.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der hier vorgestellte Co-Kultur-Assay ist eine Modifikation von zuvor etablierten Assays, die die Untersuchung von tumorsekretierten Faktoren bei der Aktivierung von Immunzellen ermöglicht. Während Zell-Zell-Kontakt bekannt ist, Veränderungen in der Immunaktivität zu induzieren, ist die Fähigkeit von tumor-sezertierten Liganden, die Immunaktivierung zu modulieren, weniger gut verstanden. Wir beschreiben eine Methode, die im Gegensatz zur direkten Co-Kultur verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorabgeleitete ab...

Jüngste Studien haben sich auf die Fähigkeit von Krebszellen konzentriert, den Nachweis durch Immunzellen zu vermeiden, die lokale Immunaktivierung zu unterdrücken oder ein tolerogenes tumorpermissives Milieu in der Tumormikroumgebung zu produzieren. Es wurden zwei große Klassen von Tumor- und Immunzellinteraktionen beschrieben, die diese Effekte erleichtern: kontaktvermittelte Wechselwirkungen oder tumorsekrete Liganden. Einer der am besten untersuchten und klinisch traktierbaren Mechanismen der kontaktvermittelten Immunhemmung, die von Tumoren genutzt werden, ist die Expression von PD-L1, die mit PD-1 auf T-Zellen interagiert, um ihre Aktivierung und Funktion zu hemmen1,2. Als Reaktion auf Interferon-Gamma (IFN), das durch eine Reihe von aktivierten Immunzellen exprimiert wird, können Tumorzellen die Expression von PD-L1 erhöhen, um die Erschöpfung von PD-1-exprimierenden aktivierten T-Zellen zu induzieren, wodurch sie daran gehindert werden, Tumorzellen effektiv auszurotten3. Die Verwendung von Antikörpern, um die Wechselwirkung zwischen PD-L1 und PD-1 zu blockieren, wird derzeit zur Behandlung mehrerer Krebsarten beim Menschen verwendet4. Angesichts dieses klinischen Erfolgs und anderer, die Identifizierung und Ausrichtung von Tumor-abgeleiteten immunsuppressiven Mechanismen hat zunehmende Aufmerksamkeit erhalten.
Über die Unterdrückung der adaptiven Immunität hinaus sind Tumore auch dafür bekannt, Faktoren zu sezernieren, die die entzündungshemmenden Reaktionen angeborener Immunzellen unterdrücken. Tumor-abgeleitete oder tumorinduzierte Sekrete, einschließlich IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, und Kolonie stimulierende Faktor (CSF-1), haben gezeigt, antitumor-Antworten von natürlichen Killer (NK) Zellen, Granulozyten, und dendritischen Zellen in der Tumor-Mikroumgebung5,6,7hemmen. Tumorzellen können auch Faktoren absondern, die die Rekrutierung und Differenzierung von myeloiden Zellen in der Tumormikroumgebung verzerren, um die Unterdrückung der T-Zellaktivierung zu fördern8,9.
Eine Art von angeborenen Immunzelle, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Tumorprogression hat, ist die Makrophagen. Seit vielen Jahren wird das Vorhandensein von tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) als negative Prognose für das Überleben des Patienten10verwendet. Das Konzept, dass immunsuppressive TAMs die immunzellvermittelte Clearance von Tumoren dämpfen, wurde vor mehr als 40 Jahren eingeführt11. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass die Makrophagen-Pro-Entzündungsreaktion herunterreguliert werden kann, während ein Pro-Tumor-Phänotyp in der Tumormikroumgebung induziert werden kann. Diese immunsuppressiven Makrophagen können zu einer tolerogenen Reaktion beitragen, die die Tumorprogression und Die Resistenz gegen Chemo- und Immuntherapie12antreibt. Angesichts der Tatsache, dass Makrophagen oft eine der häufigsten Leukozyten mit dem Tumor sind, stellt die Wiederherstellung ihrer tumorspezifischen Immunaktivität ein potenzielles Ziel für Krebstherapeutikadar 13.
Während kontaktvermittelte Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Makrophagen durch direkte Kokultur modelliert werden können, kann der Einsatz durchlässiger Membranstützen aufklären, welche tumorsekretierten Faktoren immunmodulatorisch sind, ohne den potenziell verwirrenden Einfluss des Tumor-Immunzell-Zellkontakts. Mit etwas ähnlichen Methoden haben andere das Potenzial der Identifizierung von sezernierten Faktoren in Mikroglia/neuronalen Wechselwirkungen14 sowie Tumorzellen mit Mesothelzellen15gezeigt. Wir haben diese Co-Kultur-Technik auch erfolgreich eingesetzt, um die Rolle eines tumorsekretierten Proteins, Pros1, als Unterdrücker der pro-inflammatorischen Genexpression nach der Stimulation von peritonealen Makrophagen mit LPS und Interferon-gamma16zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorsekrete Faktoren die Makrophagenaktivierung beeinflussen können.

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-Synthesekit</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medien</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Millipore</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Maus M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122 Pros1</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td></td><td>ATCC ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IFN&gamma</td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable Stützen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der auswirkungen von tumorgeheimen parakrinliganden auf die makrophagenaktivierung mit co-culture mit permeablemembranen unterstützt

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Die tumorabgeleitete Parakrinsignalisierung ist eine übersehene Komponente der lokalen Immunsuppression und kann zu einer freizügigen Umgebung für anhaltendes Krebswachstum und Metastasierung führen. Parakrine Signale können Zell-Zell-Kontakt zwischen verschiedenen Zelltypen beinhalten, wie PD-L1 auf der Oberfläche von Tumoren, die direkt mit PD-1 auf der Oberfläche von T-Zellen interagieren, oder die Sekretion von Liganden durch eine Tumorzelle, um eine Immunzelle zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur-Methode, um die Auswirkungen von tumorsezerseligierten Liganden auf die Aktivierung von Immunzellen (Makrophagen) abzufragen. Dieses einfache Verfahren verwendet handelsübliche 0,4 m Polycarbonat-Membran-permeable Stützen und Standard-Gewebekulturplatten. Dabei werden Makrophagen in der oberen Kammer und Tumorzellen in der unteren Kammer kultiviert. Das Vorhandensein der 0,4-mm-Barriere ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Signalisierung ohne die verwirrende Variable des physikalischen Kontakts, da die beiden Zelltypen das gleiche Medium und die Exposition gegenüber parakrinen Liganden aufweisen. Dieser Ansatz kann mit anderen kombiniert werden, wie genetische Veränderungen der Makrophagen (z. B. Isolierung von genetischen Knock-out-Mäusen) oder Tumor (z. B. CRISPR-vermittelte Veränderungen), um die Rolle bestimmter abgesonderter Faktoren und Rezeptoren zu untersuchen. Der Ansatz eignet sich auch für molekularbiologische Standardanalysen wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot-Analyse, ohne dass eine Flusssortierung erforderlich ist, um die beiden Zellpopulationen zu trennen. Enzymgebundene Immunsorbent-Assays (ELISAs) können ebenfalls verwendet werden, um abgesonderte Liganden zu messen, um die dynamische Wechselwirkung der Zellsignalisierung im Kontext des Multiple-Zell-Typs besser zu verstehen. Die Dauer der Kokultur kann auch für das Studium zeitlich regulierter Ereignisse variiert werden. Diese Co-Kultur-Methode ist ein robustes Werkzeug, das das Studium von tumorseften Signalen im Immunkontext erleichtert.

Um die Wirkung von tumorsezerseten Liganden auf die Makrophagenpolarisation zu bestimmen, wurde das beschriebene Verfahren verwendet. Peritoneale Makrophagen, die in Abwesenheit von Tumorzellen kultiviert wurden, wurden als negative (unbehandelt = ganz links) und positive (IFN- und LPS-stimulierte =2. von links) Kontrollen verwendet (Abbildung 2A). Alternativ wurden peritoneale Makrophagen mit B16F10 Melanom-Tumorzellen (ATCC) kokultiviert (Abbildung 1A</stron...

Hier präsentieren wir eine Methode mit durchlässigen Membranstützen, um die Untersuchung der berührungslosen Parakrinsignalisierung zu erleichtern, die von Tumorzellen verwendet wird, um die Immunantwort zu unterdrücken. Das System ist für die Untersuchung der Rolle von tumorsezerseten Faktoren bei der Dämpfung der Makrophagenaktivierung geeignet.

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Diese Transwell-Co-Kultur-Methode wird verwendet, um Parakrin-Signalisierung von Tumorzellen verwendet, um die Immunantwort zu unterdrücken. Diese Methode kann verwendet werden, um neue sezernierte Liganden zu entdecken, sowie die mechanistischen Grundlagen ihrer immunsuppressiven Wirkung. Wir haben diese Methode bereits verwendet, um zu zeigen, wie tumorsekretierte Faktoren die makrophagenpro-inflammatorische Gentranskription dämpfen können.Wir glauben, dass dieses Tool weitreichende Implikationen in der Studie der tumorabgeleiteten Immunsuppression hat. Einer der Hauptvorteile dieser Technik ist, dass es verwendet werden kann, um parakrine Signalisierung zwischen Tumorzellen und Immunzellen zu studieren, ohne die potenziell verwirrende Variable des Zell-zu-Zell-Kontakts. Diese Plattform ist auch für eine Vielzahl molekularbiologischer Verfahren für nachgelagerte Analysen zugänglich.Nach der Ernte peritonealmakrophagen, platte sie direkt in die oberen Kammern einer 0,4 Mikrometer Polyestermembran einfügen Co-Kultur Sechs-Well-Platte. Dann hinzugefügt dmEM hinzugefügt, um den Brunnen so, dass die obere Kammer enthält einen Milliliter und die untere Kammer enthält 1,5 Milliliter. Drei Tage bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.Erstens, Kultur kommerziell erhältlich Tumorzellen in ihrem jeweiligen Medium, nach ATCC empfohlen Gewebekultur Methoden. Als nächstes waschen Sie die anhaftenden Tumorzellen einmal mit PBS. Fügen Sie 0,05% Trypsin in EDTA hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen lösen.Setzen Sie dann die Zellen in Medien, die FBS enthalten, erneut aus. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder einen Zellzähler, um die Gesamtzahl der Zellen und Zentrifugen bei 220 mal G für fünf Minuten zu quantifizieren. Während der Zentrifugation das Medium aus den oberen und unteren Kammern des Makrophagens ansaugen, das durchlässige Membranträgerplatten enthält, und durch frisches Medium ersetzen.Für die unteren Kammern, in denen Tumorzellen plattiert werden, füllen Sie mit einem Milliliter Medium statt 1,5 Milliliter, um genügend Volumen für die Zellzugabe zu hinterlassen. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie das Medium aus den pelletierten Tumorzellen und setzen Sie die Zellen in ergänztem DMEM mit einer Konzentration von 300.000 Zellen pro Milliliter wieder auf. Fügen Sie 0,5 Milliliter dieser Zellsuspension in die untere Kammer der gewünschten Brunnen.Um die pro-inflammatorische Genexpression von Makrophagen zu induzieren, behandeln Sie singly oder co-cultured Makrophagen, indem Sie Interferon-Gamma in einer Konzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter und LPS in einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen. Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von zwei Stunden, und einige tumorvermittelte Unterdrückung erfolgt um acht Stunden.Die Co-Kultur für 24 Stunden führt zu einer robusten und konsistenten Tumorunterdrückung. Als negativer Kontrolle, Kultur Makrophagen singly und lassen unbehandelt. Behandeln Sie als positiv zu behandelnde, singly-cultured Makrophagen mit Interferon-Gamma und LPS in den gleichen Konzentrationen, die für die Proben verwendet werden.Nachdem die gewünschte Inkubationszeit abgelaufen ist, isolieren Sie je nach Testbedarf das Zelllysat- oder Konditionskulturmedium nach Belieben. Um das Zelllysat für die quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse zu isolieren, saugen Sie das Medium aus beiden Kammern des Brunnens an und waschen Sie einmal mit zwei MilliliterPBS. Tragen Sie den RNA-Lysepuffer auf die obere Kammer auf, die die Makrophagen enthält.Danach kratzen Sie die Membran vorsichtig, um das Zelllysat freizusetzen, und übertragen Sie es zur Weiterverarbeitung gemäß dem Herstellerprotokoll des RNA-Isolationskits in ein Sammelrohr. Die hier beschriebene Co-Kultur-Methode beinhaltet die Kultur von Makrophagen und Tumorzellen ohne physischen Kontakt. Peritoneale Makrophagen, die in Abwesenheit von Tumorzellen kultiviert werden, werden als negative und positive Kontrollen verwendet.Peritoneale Makrophagen, die in Gegenwart von B16F10-Tumorzellen mitkultiviert werden, aber ohne aktivierungsstarke Reize die Expression von pro-inflammatorischen assoziierten Genen nicht erhöhen. Dies impliziert, dass tumorsekrete Liganden entweder nicht ausreichen, um die pro-inflammatorische Genexpression selbst zu induzieren, oder wenn es eine Immunaktivierung durch Tumorsekrete gibt, sind parakrine Liganden ausreichend, um sie auf ihre nativen Ebenen zu unterdrücken. Diese Co-Kultur-Methode veranschaulicht, dass, wenn Makrophagen, die durch Interferon-Gamma und LPS polarisiert werden, in Gegenwart von Tumorzellen kultiviert werden, die Unterdrückung der entzündungsassoziierten Genexpression um bis zu 60% reduziert wurde Ein vergleichbares Niveau der Makrophagen-Pro-Entzündlichen Gensuppression wird beobachtet, wenn die murine Makrophagenzelllinie J774 durch peritoneale Makrophagen ersetzt wird.Frühere Arbeiten haben Protein S als tumorsekretierten Faktor identifiziert, der die Makrophagenaktivierung hemmen kann, so dass das durchlässige Membranunterstützungs-Cokulturmodell in Verbindung mit einem LysA verwendet wird, um die Konzentration von Protein S in konditionierten Medien nach 24 Stunden zu assieren. In konditionierten Medien aus Interferongamma- und LPS-behandelten B16F10-Melanomzellen wird Protein S in einer Konzentration von etwa 475 Nanogramm pro Milliliter exprimiert. Peritoneale Makrophagen, die unter den gleichen Bedingungen behandelt wurden, exprimierte das Protein S mit etwa 61 Nanogramm pro Milliliter.Interessanterweise betrug die Konzentration von Protein S im Interferon-Gamma und im LPS-behandelten Brunnen bei einer Kokulturierung etwa 86 Nanogramm pro Milliliter. Dies deutet darauf hin, dass entweder Makrophagen tumorsekretiertes Protein S aufnehmen oder dass die Menge an Protein S, das von B16F10-Zellen abgesondert wird, in Gegenwart von Makrophagen erheblich verringert wird. Diese Ergebnisse zeigen tiefgreifende Veränderungen der Makrophagenaktivierung und parakrinen Signalisierung, wenn Makrophagen mit Tumorzellen kokultiviert werden.Die Transwell Co-Culture-Methode kann eine Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit Parakrin-Signalisierung beantworten. Western Blot Analyse könnte durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie tumor-sezernierte Proteine verschiedene Signalwege in Makrophagen verändern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Regulation der mesenchymalen Stammzellen (MSC) der Makrophagen-Phagozytose in einer Co-Kultur. Bei der Co-Kultivierung von MSC mit Makrophagen werden nicht-opsonisierte Zymosanpartikel, die an ein pH-empfindliches Fluorophor konjugiert sind, zugegeben, die von den Makrophagen phagozytiert werden. Mit zunehmender Phagozytose steigt die Fluoreszenzintensität an, was die Bestimmung der MSC-vermittelten Regulation der phagozytären Aktivität...

Ein Assay zur Untersuchung der Regulation der Makrophagen-Phagozytose durch mesenchymale Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Co-Kultur in drei Dimensionen, das nützlich ist, um multizelluläre Interaktionen und extrazelluläre Matrix-abhängige Modulation des Verhaltens von Krebszellen zu untersuchen. In diesem experimentellen Modell werden Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert, die in humane krebsassoziierte Fibroblasten eingebettet sind.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Um das bösartige Verhalten von Krebs zu verstehen, müssen genaue Modelle erstellt werden, wie Tumorzellen mit Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z.B. Makrophagen, interagieren. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur Untersuchung der Interaktion von Glioblastomzellen mit tumorassoziierten Makrophagen und Mikroglia, bei denen die Wirkung auf die Glioblastominvasion bewertet wird.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.

Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

Hier beschreiben wir eine dreidimensionale Kultur-Methode, um die Morphologie des primären Brustkrebs-Zellen, sowie deren direkte/indirekte Wechselwirkungen mit Monozyten und die Ergebnisse wie Kollagen-Abbau, Immunzelle Rekrutierung, Zelle studieren analysieren Invasion, und Förderung der Krebs-in Verbindung stehenden Entzündung.

Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

Parakrine und Juxtacrine zelluläre Interaktionen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Hier ist eine proximale Kultur-Methode zur Untersuchung Parakrine Signalisierung wo sind die lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren beibehalten und zelluläre Direktkontakt zu verhindern.

Eine proximale Kultur-Methode zu studieren, Parakrine Signale zwischen Zellen

Dieser Artikel stellt einen nützlichen In-vitro-Assay dar, um die Fähigkeit des konditionierten Mediums aus Tumorzellen zu bewerten, Makrophagen anzuziehen.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Interaktion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mit einem Tumorsphäroid in einer dreidimensionalen (3D) Kollagen-I-Matrix zu untersuchen, mit der Möglichkeit, den Einfluss löslicher und physikalischer Eigenschaften der Mikroumgebung auf die Zellinvasion zu vergleichen.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Angesichts der begrenzten Xenotransplantat-Modelle, die zur Untersuchung von Interaktionen zwischen humanen CART- und myeloischen Zellen zur Verfügung stehen, haben wir in vitro und in vivo Modelle etabliert, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen zu verstehen. Die Ergebnisse können möglicherweise verallgemeinert werden, um die Rolle von Makrophagen in der Tumormikroumgebung zu bewerten und Makrophagen-gezielte Immuntherapien zu testen.

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen myeloischen Zellen und CAR-T-Zellen in vitro und in vivo

Erfahren Sie die Transwell-Kokulturmethode zur Untersuchung parakriner Signale von Tumorzellen und deren immunsuppressiver Wirkung auf Makrophagen. Diese Technik ermöglicht die Analyse sekretierter Faktoren ohne direkten Zellkontakt.

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt (Video) | JoVE Journal

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

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