Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit mittels epigenetischer quantitativer PCR
19. Februar 2020
Hier beschreiben wir eine robuste Methode zur Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit durch epigenetische Signaturen, die mit quantitativer PCR (qPCR) nachgewiesen wurden. Die DNA-Deethylierung an einem bestimmten Ort dient als eindeutiger Identifikator für einen bestimmten Zelltyp und ermöglicht die Identifizierung von CD8+-, regulatorischen oder Th17-T-Zellen.
Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit und befasst sich mit der Begrenzung der Durchflusszytometrie, wie z. B. großer Stichprobenbedarf, hoher Benutzervariabilität und subjektiver Datenanalyse. Dieser Test enthält eine automatisierte Datenanalysevorlage, die es Benutzern ermöglicht, die Identität und Reinheit von Immunzellen objektiv zu beurteilen. Dies, zusammen mit den multiplen Assay-Kontrollen bietet eine schlüsselfertige, leicht standardisierte Methode zur Beurteilung der Identität und Reinheit von Immunzellen.
Diese Technik wird Jerry Guzman demonstrieren, ein Wissenschaftler in unserem Labor. Verwenden Sie nach der genomischen DNA-Isolierung aus der hämatopoetischen Zellprobe einen Mikroliter der genomischen DNA, um die Reinheit der Probe auf einem Spektralphotometer zu messen, indem Sie die optische Dichte bei 260, 280 und 230 Nanometern erhalten. Als nächstes verdünnen 400 bis 1200 Nanogramm genomische DNA-Probe zu einem endletzten Volumen von 142 Mikrolitern mit Elutionspuffer aus einem genomischen DNA-Isolationskit.
75 Mikroliter des Kalibrators zu 67 MikroliterN Elutionspuffer hinzufügen. Und verdünnen Sie 1200 Nanogramm der Referenzgenom-DNA auf ein Gesamtvolumen von 142 Mikrolitern mit Elutionspuffer. Dann inkubieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 56 Grad Celsius und 900 Umdrehungen pro Minute in einem thermischen Mischer.
Für die Bisulfitumwandlung 270 Mikroliter Ammoniumbisulfit und 90 Mikroliter THFA in alle Röhren geben. Und Wirbel die Rohre, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten. Drehen Sie die Proben kurz herunter, um die Flüssigkeit zu sammeln, und legen Sie die Rohre 45 Minuten lang bei 80 Grad Celsius und 900 Umdrehungen pro Minute in den Thermomischer.
Dann drehen Sie die Proben kurz wieder herunter und lassen Sie sie für drei bis fünf Minuten auf Raumtemperatur abkühlen. Zur DNA-Reinigung nach Bisulfitumwandlung die paramagnetischen Perlen der DNA-Isolierung 30 Sekunden lang wirbeln. Fügen Sie Ethanol und Isopropanol in die Waschpuffer entsprechend den auf den Flaschen aufgeführten Mengen hinzu.
Wieder Wirbel, bis die Perlen vollständig resuspendiert sind und bei 870 Mikroliter Lyse-Bindungspuffer und 105 Mikroliter der DNA-Bindung paramagnetische Perlen an jede Röhre. Wirbeln Sie die Rohre zu mischen, bevor Sie kurz die Proben nach unten drehen. Fügen Sie 570 Mikroliter 2-Propanol zu jedem Rohr und mischen durch Wirbeln.
Die Rohre sieben Minuten bei Raumtemperatur und 50 U/min pro Minute inkubieren, bevor Sie die Rohre kurz wieder herunterdrehen und fünf Minuten lang auf ein magnetisches Rack legen. Am Ende der Inkubation entfernen Sie das Supernate, ohne die Perlen zu stören. Waschen Sie die Probe mit Puffer 1 und wirbeln Sie die Rohre.
Nach einer kurzen Zentrifugation die Rohre für drei Minuten wieder in das Rack legen und das Supernate entfernen, ohne die Perlen zu stören. Die Probe zweimal mit Waschpuffer 2 waschen und die Rohre bei 65 Grad Celsius 15 Minuten trocknen. Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter Evolutionspuffer zu jeder Röhre hinzu.
Nach einer siebenminütigen Inkubation bei Raumtemperatur und 1400 Umdrehungen pro Minute drehen Sie die Rohre kurz herunter und geben sie für zwei Minuten zum Magneten zurück. Am Ende der Inkubation transferieren 55 Mikroliter des Bisulfites umgewandelte DNA, die in ein neues Rohr enthalten, ohne die Perlen zu stören. Um quantitative PCR auf den Stichproben auszuführen, weisen Sie jedem Standard den Task-Standard in der quantitativen PCR-Software zu und geben Sie die endgültigen Kopiernummern gemäß der Tabelle an.
Bereiten Sie serielle Verdünnungen der Standard-DNA vor und bereiten Sie einen quantitativen PCR-Master-Mix-Cocktail für den Zielzelltyp vor. Und ein quantitativer PCR-Master-Mix-Cocktail für GAPDH, so die Tabelle. Laden Sie drei Mikroliter der Schablonen-DNA in die entsprechenden Brunnen einer 96 gut abgerundeten Bodenplatte, gefolgt von sieben Mikrolitern Master-Mix.
Wenn alle Brunnen geladen sind, versiegeln Sie die Platte mit quantitativer PCR-Folie und drehen Sie die Platte kurz, bevor Sie sie auf das quantitative PCR-Instrument laden. Führen Sie dann die Reaktion wie in der Tabelle angegeben aus. Exportieren Sie die quantitativen PCR-Daten nach Abschluss der Ausführung als txt- oder xlsx-Datei.
Nach der Reinigung der Bisulfit umgewandelt e-DNA mit paramagnetischen Schlägen, wie gezeigt, elute 25 Mikroliter der DNA. Übertragen Sie die bisulfit konvertierte DNA in ein neues Rohr und fügen Sie zwei Mikroliter der Probe in einzelne PCR-Streifenröhren ein. Fügen Sie zwei Mikroliter Wasser zu einem Steuerelement ohne Schablone hinzu und bereiten Sie den Vorverstärkungs-Master-Mix für alle Proben entsprechend der Tabelle vor.
Fügen Sie 23 Mikroliter Master-Mix zu jeder Röhre und Kappe, Wirbel, und drehen Sie kurz nach unten die Rohre. Führen Sie dann das Vorverstärkungsprotokoll auf einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel aus. Nach Abschluss des Laufs die Röhren kurz nach unten drehen und auf Mikroliter der verstärkten DNA in neue Röhren übertragen.
Dann verdünnen Sie die Proben mit 78 Mikroliter Wasser auf eine Eins bis 40 Konzentration und führen Sie eine quantitative PCR der Proben, wie gezeigt. Hier werden repräsentative Daten aus einem CD8+T-Zelltest gezeigt, der aus der Analyse sowohl peripheren Blutes, mononukleären Zellen und T-Zellen von drei verschiedenen Spendern mit Flusszytometrie als auch Methylierungstests gewonnen wurde. Die Trends zwischen den beiden Methoden bei allen Spendern in beiden Zelltypen waren ähnlich.
Diese repräsentativen Daten aus dem Treg-Assay zeigen auch ähnliche Ergebnisse zwischen den Methoden. In allen Fällen ergab dieser Methylierungstest jedoch höhere Werte sowohl unter stimulierten als auch unter unstimulierten Bedingungen. Die Empfindlichkeit und Spezifität jedes Assays wurde durch die Werte "Leergrenze", "Erkennungsgrenze" und "Limit of Quantitation" demonstriert.
Da dieser Test eine automatisierte Datenanalysevorlage bietet, verbessert er die objektive Analyse und erhöht die Standardisierungsfunktionen. Dies ist ideal für die Zelltherapieherstellung, bei der standardisierte Methoden entscheidend für die Schaffung eines konsistenten Zelltherapieprodukts sind.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine standardisierte Methode zur Bestimmung der Identität und Reinheit von Immunzellen mithilfe epigenetischer Signaturen dar, die mittels quantitativer PCR (qPCR) nachgewiesen werden. Die Methode behebt die Einschränkungen der Durchflusszytometrie und bietet eine automatisierte Vorlage zur Datenanalyse für eine objektive Bewertung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Epigenetik
Hintergrund
- Herkömmliche Methoden wie die Durchflusszytometrie weisen Einschränkungen wie eine hohe Variabilität und einen großen Probenbedarf auf.
- Epigenetische Signaturmuster können als eindeutige Kennzeichen für spezifische Immunzelltypen dienen.
- Standardisierung in der Zellanalyse ist entscheidend für konsistente Ergebnisse in Forschung und Therapie.
- Diese Methode verbessert die Zuverlässigkeit der Charakterisierung von Immunzellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer robusten Methode zur Identifizierung und Beurteilung der Reinheit von Immunzellen.
- Bereitstellung einer Alternative zur Durchflusszytometrie, die die Benutzervariabilität minimiert.
- Verbesserung der Standardisierung von Assays in der Herstellung von Zelltherapeutika.
Verwendete Methoden
- Isolierung von genomischer DNA aus hämatopoetischen Zellproben.
- Bisulfitumwandlung zur Analyse der DNA-Methylierung.
- Quantitative PCR zur Messung epigenetischer Signaturmuster.
- Automatisierte Datenanalyse zur objektiven Bewertung der Ergebnisse.
Hauptergebnisse
- Der Methylierungsassay zeigte bei verschiedenen Zelltypen höhere Werte im Vergleich zur Durchflusszytometrie.
- Ähnliche Trends wurden in Assays für CD8+ T-Zellen und regulatorische T-Zellen beobachtet.
- Der Assay wies eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität auf.
- Die automatisierte Analyse verbesserte die Objektivität und Standardisierung der Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet eine zuverlässige Alternative für die Analyse von Immunzellen.
- Die Standardisierung verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in der Forschung.
- Der Ansatz ist vorteilhaft für Anwendungen in der Herstellung von Zelltherapien.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die genaue Bestimmung der Identität und Reinheit von Immunzellen ist entscheidend für die Entwicklung von Zelltherapien und beeinflusst sowohl die Produktkonsistenz als auch die Einhaltung regulatorischer Anforderungen. Diese auf Epigenetik basierende qPCR-Methode überwindet die Grenzen der Durchflusszytometrie, indem sie eine objektive, hochdurchsatzfähige und standardisierte Quantifizierung von Immunzellsubtypen ermöglicht. Ihre robuste, automatisierte Analyse unterstützt zuverlässige Tests während des Herstellungsprozesses und zur Freigabe des Endprodukts und erhöht so die Vorhersagesicherheit an entscheidenden Punkten des Produktionsablaufs.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die objektive Quantifizierung von Immunzellsubtypen zur funktionellen Zielvalidierung.
- Reduziert mechanistische Unschärfen durch die Nutzung zelltypspezifischer epigenetischer Marker.
- Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit bei hypothesenbasierten, immunzellbasierten Therapieansätzen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Aufbereitung validierter Immunzellpopulationen für nachgeschaltete Assays.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays durch automatisierte Datenanalyse.
- Ermöglicht eine hochdurchsatzfähige, quantitative Beurteilung der Zellidentität und -reinheit.
- Unterstützt eine zuverlässige Evaluierung der Eigenschaften von Zelltherapeutika.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung der Charakterisierung von Immunzellen mit den Anforderungen translationaler Biomarker.
- Stellt durch die Standardisierung der Zellidentitätsbewertung eine kontinuierliche Übertragung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher.
- Reduziert Risiken bei Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem robuste, quantitative Reinheitsdaten bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in die Zelltherapie-Pipeline von der frühen Entdeckung bis zur Qualitätskontrolle in der Herstellung integriert und unterstützt sowohl die Identifizierung von Leitverbindungen als auch die Freigabe des Produkts.
- Entdeckungsbiologie: Liefert quantitative, zelltypspezifische Daten zur Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen.
- Screening: Stellt standardisierte, reproduzierbare Ergebnisse bereit, die für Hochdurchsatz-Workflows geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt quantitative Reinheits- und Identitätskennzahlen für den Vergleich über verschiedene Bedingungen hinweg.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern und die Validierung präklinischer Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare, standardisierte Plattform für die Analyse von Immunzellen über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert biologische Risiken bei der Entwicklung von Zelltherapien.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Durchsatz bei der Charakterisierung von Immunzellen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste, objektive Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidaten für Zelltherapien.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung genomischer DNA, der Bisulfitumwandlung und der qPCR-Analyse.
- Benötigt Zugang zu Spektrophotometrie, Thermomischern, magnetischen Gestellen und qPCR-Geräten.
- Erfordert die Standardisierung von Assay-Setup und Datenauswertungsvorlagen über Teamgrenzen hinweg.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Immunzellsubtypen oder Probenquellen erforderlich.
- Die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays werden durch etablierte Grenzwerte für Blindwert, Nachweis und Quantifizierung definiert.
