Name: Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die Sammlung gefrorener Hirnregionen von CD-1-Mäusen für hochwertige Protein- und RNA-Extraktion. Diese Methode bewahrt Moleküle während der Präparation und ermöglicht präzise molekulare Analysen.

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Diese Arbeit wurde von der NIH, DA043982 und DA046196 unterstützt.

Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in einer ethischen und humanen Weise behandelt, wie sie von den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und der National Institutes of Health (NIH) der Indiana University dargelegt wurden.
HINWEIS: Alle Werkzeuge und Oberflächen sollten mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen werden, um Nukleasen zu entfernen18, bevor Sie mit den Arbeiten beginnen.
1. Speichern von Gehirnen
<ol><li>Entfernen Sie schnell die Gehirne von eingeschläferten erwachsenen CD1-Wildtypmäusen mit einem Gewicht von ca. 30 g mit einem konventionellen Ansatz13 und Blitzeinfrieren für 60 Sekunden entweder in flüssigem Stickstoff oder ist opentane mit Trockeneis vorgekühlt.</li>
	<li>Gefrorene Gehirne bei -80 °C in Aluminiumfolie oder konischen Rohren lagern, bis sie verwendet werden.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Hirnmatrix
<ol><li>24 Stunden vor der Gewebezerse eine saubere Gehirnmatrix (siehe Materialtabelle)auf einen Stapel aufgetauter Gefrierpackungen. Sandwich die Seiten der Matrix zwischen zwei Gefrierpackungen, die sicherstellen, dass ca. 0,5 cm zwischen der Unterseite der Rasierschlitze und der Oberseite der Gelpackungen(Abbildung 1A). Legen Sie Aluminiumfolie auf die Enden, um bei der Kühlung zu helfen. HINWEIS: Wenn Sie eine Gehirnmatrix kaufen, kaufen Sie eine, die groß genug ist, um das gesamte Volumen des Gehirns einzuschließen, um seziert zu werden.</li>
	<li>Legen Sie die Box mit der Hirnmatrix und Gefrierpackungen in einen -20 °C-Gefrierschrank mit dem oberen Ajar über Nacht.</li>
</ol>3. Aufstellen einer gefrorenen Glasplatte
HINWEIS: Der Zweck dieses Setups ist es, eine gefrorene Oberfläche vorzubereiten, auf der Gehirnabschnitte seziert werden können.
<ol><li>Eis in eine isolierte Box bis ca. 5 cm von oben legen. Legen Sie dann eine 2,5 cm Schicht Trockeneis auf das Eis und Decken mit schwarzen Kunststoffplatten, um die Probe zu visualisieren (Abbildung 1B, Abbildung 1C).</li>
	<li>Legen Sie eine Glasplatte (sollte nur in die Öffnung der Box passen) auf die Oberseite des Kunststoffs und legen Sie Trockeneis auf der Platte in den entfernten Ecken(Abbildung 1C).</li>
	<li>Nehmen Sie die eingefrorene Gehirnmatrix aus dem Gefrierschrank und legen Sie das Gehirn ein, um Cortex-Seite nach oben geschnitten zu werden. Lassen Sie es auf die Temperatur in der Box für 10 min ausdemieren. Halten Sie den Deckel auf der Box während dieser Zeit.</li>
	<li>Passen Sie die Position des Gehirns in der Matrix mit kalten Zangen so an, dass sich die sagittale Sinus und die Quersinus mit den senkrechten Nuten des Blocks anstellen (Abbildung 1D). Dadurch wird sichergestellt, dass symmetrische Abschnitte für eine einfachere Zerlegung gewährleistet werden. Berühren Sie Spitzen der Zange, um Eis kurz zu trocknen, um zu kühlen, bevor Sie das Gehirn anpassen.</li>
	<li>Sobald das Gehirn in Position ist, legen Sie eine gekühlte Rasierklinge in der Nähe ihrer Mitte und drücken Sie die Klinge etwa 1 mm in das Gewebe. Fügen Sie gekühlte Klingen zu den rostralen und kaudalen Enden hinzu, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2A und Abbildung 2B).</li>
	<li>Beginnend mit dem rostralen Ende, fügen Sie Klingen nacheinander, legen Sie sie in die Schlitze und drücken Sie sie sanft nach unten in das Gewebe etwa 1 mm (Abbildung 2B). Fügen Sie die Klingen in 1 mm Intervallen in Richtung des kaudalen Endes hinzu.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass sich das Gehirn während dieser Zeit nicht verschiebt. Line-up-Blades horizontal und vertikal(Abbildung 2B). Um Schnitte in 0,5 mm Breite zu schneiden, können Mikrotomklingen mit niedrigem Profil (siehe Materialtabelle)verwendet werden. Platzieren Sie diese zwischen den größeren Rasierklingen (Abbildung 2C).</li>
	<li>Sobald die Klingen an Ort und Stelle sind, drücken Sie mit Denfingern, Handfläche oder einer anderen flachen Oberfläche auf die Gruppe (Abbildung 2C, Abbildung 2D). Schaukeln Sie die Gruppe der Klingen langsam von Seite zu Seite, um sie durch das Gewebe zu bewegen. HINWEIS: Dies kann einige Zeit in Anspruch nehmen (1–2 min) und erfordert Geduld. Es sollte eine Resistenz gegen die Klingen, die sich durch das Gewebe bewegen, bestehen. Einfacher Einstieg bedeutet, dass das Gehirn auftaut und der Block mit Trockeneis gekühlt werden sollte.</li>
	<li>Wenn alle Klingen den Boden der Schlitze erreicht haben, greifen Sie jede Seite der Gruppe von Klingen und arbeiten Frei von der Matrix, indem Sie hin und her schaukeln. HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, sich an den scharfen Kanten der Klingen zu schneiden.</li>
	<li>Sobald die Gruppe frei ist, legen Sie den Stapel, rostralseite nach oben, auf die Glasplatte (Abbildung 2E). Legen Sie Trockeneis neben und/oder auf den Stapel, um die Proben weiter einzufrieren, um die Trennung zu erleichtern.</li>
	<li>Legen Sie den Stapel mit scharfen Kanten nach unten auf die Glasplatte und trennen Sie die Klingen, indem Sie den Stapel zwischen Daumen und Fingern verschieben. Die Klingen sollten sich mit befestigten Abschnitten voneinander trennen.</li>
	<li>Aufderlegen Abschnitte auf der Glasplatte von rostral bis kaudal (Abbildung 2F).</li>
	<li>Trennen Sie Gewebe von den Klingen, indem Sie die Klingen zwischen den Fingern biegen oder durch Trennen mit einem zweiten kalten Rasiermesser(Abbildungen 2G,2H,2I).</li>
</ol>4. Abschnitte sezieren
<ol><li>Öffnen Sie den Allen Mouse Brain Atlas oder eine andere Referenz und finden Sie Sehenswürdigkeiten, die notwendig sind, um Interessengebiete zu identifizieren. Einige offensichtliche Sehenswürdigkeiten sind die vordere Kommissure, das Corpus callosum, die seitlichen Ventrikel und der Hippocampus (Abbildung 3).</li>
	<li>Drehen Sie den Abschnitt, der mit gekühlten Zangen geschnitten werden soll, und stellen Sie sicher, dass die Region, die gesammelt werden soll, während des gesamten Abschnitts konsistent ist. Konsultieren Sie während der Ernte häufig den Referenzatlas, um sicherzustellen, dass der richtige ROI erzielt wird. HINWEIS: Ein Lupen- oder Sezierendes Mikroskop ist dabei oft hilfreich. Eine gute Beleuchtung ist ebenfalls unerlässlich. Led-Lampen mit niedriger Wattzahl oder eine kühle Lampe (siehe Materialtabelle)können hierfür verwendet werden.</li>
	<li>Mit einem sauberen Skalpell oder Schlag, in den Abschnitt schneiden (Abbildung 4). Prechill jedes Werkzeug vor dem Schneiden, indem Sie es kurz zu Trockeneis zu berühren. Drücken Sie die Klinge sanft, aber fest in das Gewebe und schaukeln Sie sie hin und her, um den Schnitt zu machen. Drücken Sie nicht zu hart oder das Gewebe wird brechen. HINWEIS: Werkzeuge werden sich im Laufe der Zeit erwärmen. Leicht erwärmte Klingen können bei der Herstellung sauberer Schnitte hilfreich sein und das Frakturieren begrenzen, aber seien Sie vorsichtig, um das Auftauen von Gewebe zu vermeiden. Regelmäßig Werkzeuge auf Trockeneis kühlen.</li>
	<li>Sobald ein ROI geerntet ist, legen Sie ihn in beschriftete, vorgekühlte 1,5 ml Rohre. Geerntetes Gewebe bei -80 °C lagern, bis es benötigt wird.</li>
	<li>Auf diese Weise gesammeltes gefrorenes Gewebe durch Zugabe von kaltem RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS und Proteininhibitor-Cocktail (siehe Materialtabelle)) zur Proteinextraktion oder ein Guanidinium-haltiges Lösungsmittel (siehe Tabelle der Materialien)zur RNA-Extraktion in die gefrorene Probe und sofort homogenisieren deiner Glas-Dounce oder eines mechanischen Homogenisators (siehe Tabelle). Auf diese Weise sind Protease- und Nuklease-Inhibitoren vorhanden, da sich die Probe erwärmt, um Protein- und Nukleinsäuren vor Dementi zu schützen.</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
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<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
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<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
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<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Diese Arbeit beschreibt eine Technik, um kleine, spezifische Regionen des Gehirns zu isolieren und gleichzeitig den Abbau von Nukleinsäure und Protein zu begrenzen. Schäden am Hirngewebe passieren schnell, sobald ein Organismus stirbt. Dies ist teilweise auf eine schnelle Anhäufung von extrazellulärem Glutamat und die daraus resultierende Exzitotoxizität zurückzuführen, die21auftritt. Messenger RNA ist besonders anfällig für Degradation22,23</su...

Diese Arbeit veranschaulicht die Zerlegung von gefrorenen Hirnregionen zur Extraktion von hochwertiger Nukleinsäure oder Protein unter Verwendung eines Verweises, wie z. B. des Allen Mouse Brain Atlas1, als Leitfaden. Bei dieser Technik werden Gehirne blitzgefroren und bei -80 °C für spätere Schnitte und Sezieren gelagert, während sie in einem gefrorenen Zustand gehalten werden. Dieser Prozess ermöglicht es dem Forscher, eine große Anzahl von Gehirnen in einer Sitzung zu ernten und sie später für eine genaue Sammlung mehrerer Hirnregionen zu sezieren.
Die genaue Erfassung von Hirnregionen von Interesse (ROIs) ist oft erforderlich, wenn Fragen im Zusammenhang mit Gen- und Proteinexpression beantwortet werden. Während Pharmakologie, Elektrophysiologie und Optogenetik an Wildtypen oder genetisch veränderten Nagetieren verwendet werden können, um molekulare Veränderungen aufzuklären, die den beobachteten Verhaltensweisen2,3,4zugrunde liegen, wird die Messung induzierter Veränderungen in Transkriptomen und Proteomen häufig verwendet, um diese Befunde zu unterstützen. Techniken wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), Western Blotting, RNAseq5, MAPSeq6 und HPLC7 sind robust und relativ kostengünstig, so dass viele Labore induzierte molekulare Veränderungen innerhalb kleinerHirnregionen2,4,5,6untersuchen können.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, Nukleinsäure oder Protein aus Hirnregionen8,9,10,11,12zu extrahieren und zu reinigen. Viele Labore ernten Hirnregionen, indem sie gehirnzum Zeitpunkt der Ernte9,,13auf Eis kühlen und schneiden. Während dieser Ansatz zu hochwertiger Nukleinsäure und Protein führen kann, ist er etwas zeitlich begrenzt, da bei diesen Temperaturen ein Abbau innerhalb der Mikroumgebung des Gewebes stattfinden kann. Dies kann insbesondere dann der Fall sein, wenn versucht wird, eine große Anzahl von Tieren oder ROIs in einer Sitzung zu sezieren. Das Einfrieren von Proben hilft dabei, labile Zielmoleküle zu erhalten und bietet dem Forscher Zeit, um Die Sehenswürdigkeiten auf beiden Seiten jedes Abschnitts sorgfältig zu vergleichen, um relativ reine Proben zu sammeln. Laser-Capture ist eine weitere Möglichkeit, Gewebe für RNA- oder Proteinanalyse aus Hirnbereichen zu sammeln10. Dieses Verfahren ist der mechanischen Zerlegung überlegen, da sehr kleine und unregelmäßig geformte ROIs identifiziert und isoliert werden können. Die Lasererfassung wird jedoch durch den Einsatz teurer Geräte und Reagenzien eingeschränkt, ist zeitaufwändig und kann auch anfälliger für Probendegradation sein.
Micropunch-Sektion auf gefrorenen Geweben ist nicht neu. Frühe Arbeiten von Miklos Palkovits und anderen beschreiben die Grundtechniken im Detail14,15. Diese Präsentation folgt weitgehend der ursprünglichen Arbeit, mit einigen Verbesserungen, um die Effizienz zu erleichtern und die Kosten für die benötigte Ausrüstung zu verringern. Zum Beispiel werden Gehirnabschnitte in einem gefrorenen Hirnblock und nicht auf einem Kryostat hergestellt. Dadurch entstehen dickere Abschnitte, wodurch die Anzahl der Abschnitte reduziert wird, die zum Sammeln von ROI-Proben benötigt werden. Diese Methode seziert auch Proben auf einer gefrorenen Glasplatte, die auf Trockeneis in einer isolierten Box sitzt. Dadurch entsteht eine Untergefrierstufe an der Bank, auf der gearbeitet werden kann. Abschnitte, die auf diese Weise seziert werden, sind leicht manipulierbar, so dass der Forscher beide Seiten jedes Abschnitts mit einer Referenz vergleichen kann, um die Kontamination aus Regionen außerhalb des gewünschten ROI zu begrenzen.
Vorteile dieses Protokolls sind, dass 1) das Gehirn während des gesamten Prozesses in einem gefrorenen Zustand gehalten wird, was hilft, Protein und Nukleinsäure zu erhalten und dem Forscher Zeit gibt, ROIs sorgfältig zu ernten, und 2) die erforderlichen Reagenzien sind kostengünstig und finden sich in den meisten molekularbiologischen Labors. Dabei werden ganze Gehirne in einer Hirnmatrix auf 0,5–1,0 mm geschnitten und auf eine gefrorene Glasplatte gelegt, die kontinuierlich mit Trockeneis gekühlt wird. Landmarken, die im Allen Brain Atlas1 oder anderen Hirnatlanten16,17 gefunden werden, werden verwendet, um Interessengebiete zu identifizieren, die dann entweder mit einem kalten Schlag oder Skalpell seziert werden. Da das Gewebe nie aufgetaut wird, bieten auf diese Weise geerntete Regionen hochwertige RNA und Proteine für nachgelagerte Analysen.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Koronalhirnmatrize für Mäuse</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>Schneideblock</td></tr><tr><td>0,5 mm Koronalhirnmatrize für Ratten</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>Schneideblock</td></tr><tr><td>1,0 mm Biopsie-Stanze mit Kolben</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml</td><td>Dot Scientific</td><td>229443</td><td>Zur Aufbewahrung von gefrorenen ROIs</td></tr><tr><td>1,5 mm Biopsie-Stanze mit Kolben</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>69031-02</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mm Biopsie-Stanze mit Kolben</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>4-12% NuPage-Gel</td><td>Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>Proteingradienten-Gel</td></tr><tr><td>Bioanalyzer-System</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>RNA-Analysesystem</td></tr><tr><td>Dounce Gewebeschleifer</td><td>Millipore Sigma</td><td> D8938</td><td>Homogenisator für Glasgewebe</td></tr><tr><td>Trockeneisfaser-Lite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>Modell 180</td><td>Coole</td></tr><tr><td>Lampe Glasplatten</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td>Proteasehemmer Cocktail</td></tr><tr><td>Klingen mit niedrigem Profil</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Aktin-Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>JLA20</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Verwendet in der anfänglichen RNA-Reinheitsanalyse</td></tr><tr><td>Nr. 15 chirurgische</td><td>Klinge Surgical Design Inc</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking-Puffer</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>Western Blocking Reagenz</td></tr><tr><td>Omni Tissue Master 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>Gewebehomogenisator</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-KCC2-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>94725S</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>RNA Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>Wird verwendet, um RNA aus kleinen Gewebeproben</td></tr><tr><td>zu extrahieren RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Excelta Corp.</td><td></td><td></td>16050103</tr><tr><td>Standard Rasierklingen</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Wird zur Extraktion von RNA aus Gewebe</td></tr></tbody></table> verwendet

sammlung von gefrorenen nagetier-hirnregionen für downstream-analysen

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Im Verlauf unseres Verständnisses der Neurobiologie werden molekulare Analysen häufig an kleinen Hirnbereichen wie dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) oder Nucleus accumbens durchgeführt. Die Herausforderung bei dieser Arbeit besteht darin, den richtigen Bereich zu sezieren und gleichzeitig die zu untersuchende Mikroumgebung zu erhalten. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache, kostengünstige Methode, bei der Ressourcen verwendet werden, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind. Diese Methode bewahrt Nukleinsäure und Proteine, indem das Gewebe während des gesamten Prozesses eingefroren bleibt. Gehirne werden mit einer Hirnmatrix in 0,5-1,0 mm-Abschnitte geschnitten und auf einer gefrorenen Glasplatte angeordnet. Landmarken innerhalb jedes Abschnitts werden mit einer Referenz verglichen, z. B. der Allen Mouse Brain Atlas, und Regionen werden mit einem kalten Skalpell oder Biopsie-Punch seziert. Gewebe wird dann bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert. Durch diesen Prozess wurden Ratten- und Maus-mPFC, Nucleus accumbens, dorsaler und ventraler Hippocampus und andere Regionen erfolgreich mit qRT-PCR und Western Assays analysiert. Diese Methode ist auf Hirnregionen beschränkt, die durch klare Landmarken identifiziert werden können.

Um diese Methode zu validieren, wurde der mediale präfrontale Kortex von erwachsenen CD1-Wildtyp-Männchenmäusen gesammelt und RNA und Protein extrahiert und charakterisiert. RNA wurde durch kapillare Elektrophorese analysiert. Degradierte RNA zeigt einen Verlust an Intensität der 28S und 18S ribosomalen Bänder und zeigt auch Abbauprodukte als Abstrich zwischen 25 und 200 Nukleotiden(Abbildung 5A, Probe 1). Hochwertige RNA zeigt ausgeprägte ribosomale Bänder mit wenig bis gar keinem Signal im...

Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.

Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten. Da Hirnregionen durch Sezieren von der Ernte eingefroren werden, bleiben Zielmoleküle erhalten und der Forscher hat Zeit, Interessengebiete sorgfältig zu sezieren und zu speichern. Die Identifizierung von Interessengebieten kann zunächst eine Herausforderung sein.Die Verwendung gemeinsamer Hirn-Landmarken, wenn sie entstehen und sich durch die Abschnitte in Bezug auf die gewünschten Regionen zurückziehen, wird die Identifizierung deutlich machen. Nach dem Entfernen von Gehirnen von eingeschläferten erwachsenen CD-1 Wildtyp Mäuse, Blitz einfrieren das Gewebe für 60 Sekunden entweder in flüssigem Stickstoff oder Isopentan. Mit Trockeneis vorkühlen und bei minus 80 Grad Celsius aufbewahren.24 Stunden vor der Zerkleinerung des Gewebes, legen Sie eine saubere Gehirnmatrix auf einen Stapel von aufgetauten Gefrierpackungen. Und die Seiten der Matrix zwischen zwei Gefrierpackungen einstecken, um sicherzustellen, dass etwa einen halben Zentimeter zwischen dem Boden der Rasierschlitze und der Oberseite der Packungen.

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Micro-Dissektion Rattenhirn in verschiedenen Regionen ist äußerst wichtig für die Untersuchung von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen. Dieses Video zeigt Mikrodissektion von vier großen Hirnregionen sind Riechkolben, frontalen Cortex, Striatum und Hippocampus in frischen Rattenhirngewebe. Nützliche Tipps für die schnelle Beseitigung von jeweiligen Regionen zu RNA-und Protein-Abbau des Gewebes zu vermeiden gegeben sind.

Micro-Dissektion Rattenhirns RNA oder Protein Extraction von bestimmten Hirnregion

Die Profilierung der RNA-Expression in diskreten Regionen des Mausgehirns erfordert eine präzise und reproduzierbare Strategie zur Gewinnung von Gewebeproben. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das sowohl die koronare Schnittführung des Gehirns als auch die mikrodissektionsbasierte Gewebeentnahme mithilfe eines Gewebecorers nutzt. Die Ausbeute und Qualität der gesamten RNA aus den resultierenden Proben bestätigt die Eignung der dargestellten Methode.

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Wir beschreiben ein Rattenmodell der Posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD), die die anhaltenden Veränderungen im neuroendokrinen Funktion und die verzögerte langfristige, übertriebene Angstreaktion, die charakteristisch für PTBS-Patienten zeigt. Das Tiermodell und hier beschriebenen Methoden sind nützlich zum Korrelieren Biomarkern in Gehirnkernen, die mechanistische sind, aber nicht bei Patienten gemessen werden, wobei Biomarkern in peripheren weißen Blutzellen, welches kann.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Dieses Video zeigt ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Vorbereitung von gefrorenen Hirngewebeschnitten von Mäusen für nachgelagerte Analysen.

Aufbereitung eines Mausgehirns für die nachgelagerte Analyse

Wir beschreiben die Verwendung von Laser Capture Microdissection Proben unterschiedliche Zellpopulationen aus verschiedenen Gehirnregionen für gen- und MicroRNA Analyse zu erhalten. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der unterschiedlichen Auswirkungen von traumatischen Hirnverletzungen in bestimmten Regionen des Gehirns Ratte.

Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzufrieren und Abschnitt Gehirngewebe von mehreren Tieren als eine zeitsparende Alternative zur Bearbeitung einzelner Gehirne. Dies senkt die Färbung Variabilität bei Immunohistochemistry und reduziert Zeit Kryoschneiden und Imaging.

Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuchen.

Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse

Wir präsentieren ein praktisches, schrittweises, schnelles Protokoll für die Entfernung und Dissektion diskreter Regionen aus frischem Hirngewebe von Mäusen. Die Gewinnung von Hirnregionen für molekulare Analysen ist in vielen neurowissenschaftlichen Laboren zur Routine geworden. Diese Gehirnregionen werden sofort eingefroren, um qualitativ hochwertige transkriptomische Daten für die Analyse auf Systemebene zu erhalten.

Mikrodissektion des Mausgehirns in funktionell und anatomisch unterschiedliche Regionen

Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Lernen Sie die Sammlung gefrorener Hirnregionen von CD-1-Mäusen für hochwertige Protein- und RNA-Extraktion. Diese Methode bewahrt Moleküle während der Präparation und ermöglicht präzise molekulare Analysen.

Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

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