Name: Design eines biokompatiblen trachealen Stents bei Mäusen mit Laryngotrachealstenose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die transorale Platzierung biokompatibler PLLA-PCL-Stents bei Mäusen mit Laryngotrachealstenose. Diese Methode ermöglicht präklinische Untersuchungen lokaler Arzneistofffreisetzung zur Narbenreduktion.

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National Institute on Deafness and Other Communication Disorders of the National Institutes of Health under award numbers 1K23DC014082 and 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Diese Studie wurde auch von der Triological Society und dem American College of Surgeons (Alexander Hillel), der American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) und einem T32 NIDCD-Ausbildungsstipendium (Kevin Motz) finanziell unterstützt.

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<li>Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stent+implantation+into+the+tracheo-bronchial+system+in+rabbits%3A+histopathologic+sequelae+in+bare+metal+vs.+drug-eluting+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecularand+Cellular+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents.</a> Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10(2015).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die wichtigsten Schritte für den erfolgreichen Aufbau und die Verwendung eines drogenverdünnenden Stents in vivo sind 1) Bestimmung des optimalen PLLA-PCL-Verhältnisses für die wünschenswerte Wirkstoffelutionsrate, 2) Bestimmung der geeigneten Konzentration des zu eluierenden Arzneimittels, 3) Formen der Stents um den Angiokatheter für den In-vivo-Einsatz und 4) transoral das Stent in die Mäuse nach LTS-Induktion zu liefern, ohne tödliche Atemwegsverstopfung zu verursachen.
Zwar gibt es mehrer...

Laryngotrachealstenose (LTS) ist eine pathologische Verengung der Luftröhre am häufigsten aufgrund einer iatrogenen Postintubationsverletzung. Die Kombination von bakterieller Besiedlung, Fremdkörperreaktion auf eine Tracheostomie oder Endotrachealröhre und patientenspezifische Faktoren führen zu einer abnormen Entzündungsreaktion. Diese maladaptive Immunantwort führt zur Ablagerung von Kollagen in der Luftröhre, was zu einer luminalen Verengung der Luftröhre und anschließender Stenose1,2führt. Da die aktuelle Behandlung für diese Krankheit in erster Linie chirurgisch ist, wurde die Entwicklung eines alternativen medizinisch basierten Behandlungsparadigmas untersucht, das auf die abnormen entzündlichen und profibrotischen Bahnen abzielt, die zu einer übermäßigen Kollagenablagerung führen. Rapamycin, das den mTOR-Signalkomplex hemmt, hat gezeigt, dass es immunsuppressive Effekte sowie eine robuste Antifibroblasten-Wirkung hat. Wenn Rapamycin jedoch systemisch verabreicht wird, können häufige Nebenwirkungen (z. B. Hyperlipidämie, Anämie, Thrombozytopenie) ausgesprochen werden3. Der Zweck unserer Methodik ist es, ein Fahrzeug für die lokale Medikamentenabgabe zu entwickeln, das für den Einsatz in der Atemwege praktikabel ist, das diese systemischen Effekte mindern würde. Unsere Bewertungen konzentrieren sich auf die Untersuchung der lokalen Immunantwort auf das Wirkstoffabgabekonstrukt sowie seiner Fähigkeit, die Fibroblastenfunktion zu hemmen und die lokale Immunmikroumgebung zu verändern. Zu den krankheitsspezifischen Ergebnissen gehören In-vivo-Tests, die Marker der Fibrose bewerten.
Biologisch abbaubare, medikamentöse Stents wurden in Tiermodellen von Krankheiten in mehreren Organsystemen, einschließlich derAtemwegsbahn 4, verwendet. Für das Management von Atemwegsstenose oder Kollaps haben frühere Untersuchungen drogenbeschichtetes Silikon und Nickel-basierte Stentsverwendet 5. Ein PLLA-PCL-Konstrukt wurde für diese spezielle Methode aufgrund seines Wirkstoffelutionsprofils und seiner mechanischen Festigkeit unter physiologischen Bedingungen über einen Zeitraum von 3 Wochen gewählt, was in früherenveröffentlichtenStudien 6 nachgewiesen wurde. PLLA-PCL ist auch ein biokompatibles und biologisch abbaubares Material, das bereits von der FDA4zugelassen ist. Biokompatible Stents, die Cisplatin und MMC eluieren, wurden in großen Tiermodellen wie Kaninchen und Hunden untersucht. In diesen Tiermodellen wurden Stents jedoch nicht in ein Tiermodell der Krankheit aufgenommen und transzervikal implantiert. Diese Studie bietet eine einzigartige Methode zur Beurteilung eines biokompatiblen, arzneimittelverdünnenden Stents, der transoral in ein Mausmodell von Atemwegsverletzungen und Kehlkopfhautstenose gelegt wird. Ein biokompatibler Stent, der ein immunmodulatorisches Medikament lokal eluiert und für die Studie in einem murinen Modell miniaturisiert werden kann, ist für die translationale präklinische Forschung wertvoll. Frühere Versuche der Stentnutzung mit anderen Materialkonstrukten erzeugten robuste Fremdkörperreaktionen, die die zugrunde liegende Entzündung, die LTS7unterscheidet, verschlimmerten. Diese Methode ist unserer Kenntnis nach die erste ihrer Art, die die immunmodulatorischen und antifibrotischen Wirkungen eines stentbasierten Arzneimittelabgabesystems in einem murinen Modell von LTS untersucht. Das murine Modell selbst bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung der Wirkung eines immunmodulatorischen Medikaments auf die Luftröhre. Es können genetisch veränderte Mäuse und experimentelle Kohorten gesunder und kranker Mäuse untersucht werden, was zu experimenteller Reproduzierbarkeit führen und die Wirtschaftlichkeit verbessern kann. Darüber hinaus imitiert die Lieferung des Stents transoral in die Mausluftröhre die klinische Abgabe eines solchen Stents beim Menschen, was den translationalen Vorteil dieser Methode weiter unterstreicht. Schließlich ermöglicht die relative Leichtigkeit, mit der der PLLA-PCL-Stent mit dem Medikament hergestellt werden kann, Modifikationen, um alternative medikamentöse Therapien zu liefern, die darauf abzielen, die Narbenbildung in der Luftröhre zu reduzieren.

<table><tbody><tr><td><stark>1. Für Stent</td>22-Gauge-Angiokatheter <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jelco</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Auch bei anderen Anbietern erhältlich.</td></tr><tr><td>PDLGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>739955-5G</td><td></td></tr><tr><td>PLLA-PCL (70 : 30)</td><td>Evonik Industries AG</td><td>65053</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>LC Laboratorien</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>2. Tierchirurgie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drahtbürste</td><td>Mill-Rose Company</td><td>320101</td><td></td></tr><tr><td>3. Für immunhistochemische Färbungen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antigen-Reterival-Puffer</td><td>Abcam</td><td>ab93678</td><td>Auch von anderen Anbietern erhältlich; saurer pH-Wert erforderlich</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td><td>Auch von anderen Anbietern erhältlich.</td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen-488 Antikörper</td><td>Lif Technologie</td><td>a11008</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Ratten-633 Antikörper</td><td>Lif Technologie</td><td>a21094</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophil plus Objektträger</td><td>BSB7028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>100-10023</td><td>Auch von anderen Anbietern erhältlich.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-CD3-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab5690</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-AntiF4/80-Antikörper</td><td>Biolengend</td><td>123101</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta-Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4. Für quantative PCR</starke></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Glasperlen</td><td>OMNI International</td><td>19-645</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homoginizer</td><td>OMNI International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genspezifische Vorwärts-/Rückwärtsprimer</td><td>Genomic Resources Core Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green Mastermix</td><td>Life Technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>80404</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Echtzeit-PCR-System</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

design eines biokompatiblen trachealen stents bei mäusen mit laryngotrachealstenose

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

Laryngotrachealstenose (LTS) ist eine pathologische Verengung der Subglottis und Luftröhre, die zu extrathorakaler Obstruktion und signifikanter Kurzatmigkeit führt. LTS resultiert aus Schleimhautverletzungen eines Fremdkörpers in der Luftröhre, was zu Gewebeschäden und einer lokalen Entzündungsreaktion führt, die schief geht, was zur Ablagerung von pathologischem Narbengewebe führt. Die Behandlung von LTS ist chirurgisch aufgrund des Mangels an wirksamen medizinischen Therapien. Der Zweck dieser Methode ist es, einen biokompatiblen Stent zu konstruieren, der miniaturisiert werden kann, um in Mäuse mit LTS zu platzieren. Wir haben gezeigt, dass ein PLLA-PCL-Konstrukt (70% Poly-L-Laktid und 30% Polycaprolacton) eine optimale biomechanische Festigkeit aufweist, biokompatibel, praktikabel für einen In-vivo-Platzierungsstent und in der Lage ist, Medikamente zu elutieren. Diese Methode bietet ein Arzneimittelabgabesystem zur Prüfung verschiedener immunmodulatorischen Wirkstoffe, um Entzündungen lokal zu hemmen und die Atemwegsfibrose zu reduzieren. Die Herstellung der Stents dauert 28 x 30 h und kann leicht reproduziert werden, so dass Experimente mit großen Kohorten möglich sind. Hier haben wir das Medikament Rapamycin in den Stent integriert, um seine Wirksamkeit bei der Verringerung der Fibrose und Kollagenablagerung zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass PLLA-PCL-Zelte eine zuverlässige Rapamycin-Freisetzung zeigten, unter physiologischen Bedingungen mechanisch stabil waren und biokompatibel waren, was zu einer geringen Entzündungsreaktion in der Luftröhre führte. Darüber hinaus reduzierte die rapamycin-eluierende PLLA-PCL-Stents die Narbenbildung in der Luftröhre in vivo.

Das biologisch abbaubare PLLA-PCL-Stentkonstrukt, das mit Rapamycin beladen war, das in dieser Studie verwendet wurde, war in der Lage, Rapamycin in konsistenter und vorhersehbarer Weise unter physiologischen Bedingungen zu elutieren (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt den PLLA-PCL-Stent, der um einen 22 G Angiokatheter gegossen wurde, um ihn in einem murinen Modell von LTS zu verwenden. Um festzustellen, ob die Auswirkungen der Rapamycin-Elution in der Luftröhre w...

Laryngotrachealstenose resultiert aus pathologischer Narbenablagerung, die die Luftröhre kritisch verengt und keine wirksamen medizinischen Therapien hat. Mit einem PLLA-PCL (70% Poly-L-Laktid und 30% Polycaprolacton) Stent als lokales Arzneimittelabgabesystem, können mögliche Therapien zur Verringerung der Narbenproliferation in der Luftröhre untersucht werden.

Design eines biokompatiblen trachealen Stents bei Mäusen mit Laryngotrachealstenose

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, drogeneluge Stents in einem Kleintiermodell der Kehlkopfrachealstenose zu untersuchen, die es uns ermöglicht, genetisch veränderte Tiere kostengünstig zu nutzen. Die transorale Platzierung des medikamentösen Atemwegsstents erspart den Tieren einen offenen Schnitt in die Luftröhre, was ein klinisch relevanteres Modell der Kehlkopfhautstenose darstellt. Diese Technik erleichtert die präklinische Untersuchung lokaler Wirkstoffabgabestrategien zur Behandlung von Kehlkopfracherose.Diese Technik bietet eine praktikable und effektive Plattform für die translationale Untersuchung von drogenverdünnenden Atemwegsstents in einem Kleintiermodell, die für zukünftige Untersuchungen in größeren Tiermodellen sowie für die klinische Anwendung angewendet werden können. insbesondere die transorale Intubation, die Induktion von Luftröhreverletzungen und den Stufen der Atemwegstentplatzierung. Die visuelle Demonstration dieser technisch anspruchsvollen Operation ist entscheidend, da viele der feinen Details nicht vollständig in Worten beschrieben werden können.Um eine 1%rapamycin enthaltende Polymerlösung herzustellen, fügen Sie sechs Milligramm Rapamycin zu 600 Milligramm 70-30 PLLA-PCL in eine Glasdurchstechflasche. Unter einer Dunstabzugshaube sechs Milliliter Dichlormethan in das Rapamycin geben, das durchfläschig ergänzt wird, und durchdies durchdies andere Durchstechflasche steuern und 120 Mikroliter Glycerin zu jeder Durchstechflasche hinzufügen. Dann die Fläschchen verkappen und die PLLA-PCL-Lösung sechs bis zwölf Stunden bei Raumtemperatur homogenisieren lassen.Um einen murinen Atemwegstent zu erzeugen, mit sterilen Materialien und Technik, wenden Sie einen Milliliter Rapamycin ergänzt PLLA-PCL Lösung auf die venöse Kanüle eines 22 Gauge fluorierten Ethylen Propylen-basierten Angiokatheters bei der Verlangsamung der Drehung des Katheters. Wenn die gesamte Lösung aufgetragen wurde, stützen Sie den geformten Angiokatheter mit der Spitze des Angiokatheters nach unten und dem Griff des Katheters am Rand einer glasigen Petrischale in einer Vakuumhaube. Nach 24 Stunden unter Vakuum bei Raumtemperatur den Katheter vorsichtig vom getrockneten Stentkonstrukt verdrehen und schieben und den Stent umlaufend auf eventuelle Defekte, die während des Gießprozesses entstanden sein könnten, überprüfen.Um die Visualisierung zu unterstützen, ist es hilfreich, eine dünne schwarze Linie über die Länge des Stents zu zeichnen. Schneiden Sie jedes Ende der gegossenen Stents mit einer feinen geraden Schere, so dass die Kanten axial sind, und schneiden Sie jeden Stent mit der Schere in drei Millimeter axiale Segmente. Dann jeden drei Millimeter Stent auf einen neuen 22 Gauge Venenkatheter laden.Für Laryngotrachealstenose-Induktion, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, legen Sie die erste Maus auf eine chirurgische Plattform in der Supine-Position und Schleifen ein kleines Stück Faden an der Oberseite der Plattform um die zentralen Schneidezähne befestigt. Sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband am Tisch und machen Sie einen 1,5 Zentimeter großen vertikalen Schnitt im Hals der Maus. Teilen Sie den darüber liegenden Thymus und lateralisieren Sie die beiden resultierenden Lappen, um die Luftröhre zu visualisieren.Teilen Sie die darüber liegenden Sternohyoid- und Sternothyreodrüsenmuskeln an der überlegenen Befestigung bilateral und passieren Sie einen 22 Gauge Angiokatheter transoral durch den Kehlkopf in die Luftröhre. Mit kleinen Zangen, Druck auf den vorderen Kehlkopf der Maus ausüben, um bei der korrekten Platzierung des Katheters zu helfen. Ein richtig platzierter Angiokatheter kann durch seine weiße Farbe durch die Luftröhre visualisiert werden.Um die Verletzung zu induzieren, passieren Sie eine Bleomycin-beschichtete Drahtbürste durch den eingelegten Angiokatheter und ziehen Sie den Katheter langsam zurück, so dass nur die Drahtbürste innerhalb der Luftröhre verbleibt. Mit feinen Zangen den Gegendruck auf die Luftröhre auftragen, um das Luftröhrenlumen mit der Bürste mechanisch zu stören, bevor der Katheter über die Bürste wieder in die Luftröhre eingesetzt wird. Entfernen Sie die Drahtbürste und wenden Sie den Bleomycin erneut an, bevor Sie den Pinsel ein- und viermal wieder einsetzen, wie soeben gezeigt.Nach der letzten Bleomycin-Anwendung den Katheter aus der Luftröhre entfernen. Für die transorale Platzierung einer PLLA-PCL stellen Sie sicher, dass eine dünne schwarze vertikale Linie in jeden Stent integriert wurde und intubieren Sie die Maus transoral mit dem vorinstallierten Angiokatheter. Der Stent sollte innerhalb der Luftröhre durch den transzervikalen Schnitt visualisiert werden.Wenn der Stent an Ort und Stelle ist, verwenden Sie feine Zangen, um die Luftröhre fest zu erfassen, aber sanft durch den Schnitt zu greifen, um den Stent an Ort und Stelle zu halten und den Katheter zu entfernen. Es ist wichtig, den Stent so sorgfältig wie möglich zu platzieren. Zu viel Druck auf die Luftröhre führt zum Zusammenbruch des Stents, was zu Atemwegsverstopfungen und Tod für das Tier führt.Schließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber oder resorbierbaren 4-0 Chromnähten, die hier verwendet werden, und lassen Sie die Maus sich mit Überwachung erholen, bevor sie das Tier in seinen Hauskäfig zurückgibt. Platzieren Sie die Maus des Interesses am entsprechenden experimentellen Endpunkt in der Supine-Position auf der chirurgischen Plattform und verwenden Sie eine fein gekrümmte Irisschere, um den Schnitt wieder zu öffnen. Setzen Sie die Luftröhre wie gezeigt aus und teilen Sie die distale Luftröhre mit der Schere unter die Höhe des Stents.Als nächstes teilen Sie die proximale Luftröhre unterhalb des Kehlkopfes und oberhalb des Stents und trennen Sie die geteilte Luftröhre von der Speiseröhre nachträvoll. Dann entfernen Sie den Stent aus der Luftröhre und fixieren Sie die Luftröhre in 10%formalin für 24 Stunden. Das biologisch abbaubare rapamycin geladene PLLA-PCL-Stentkonstrukt, das in dieser Studie verwendet wird, ist in der Lage, Rapamycin in konsistenter und vorhersehbarer Weise unter physiologischen Bedingungen zu elutieren.In diesem Bild kann der miniaturisierte biokompatible Stent an Ort und Stellen innerhalb der Luftröhre beobachtet werden, wie der schwarze Marker auf dem Stent zeigt, der durch die transluzente Mausluftröhre visualisiert wird. Nach 21 Tagen kann der schwarze Farbstoffmarker verwendet werden, um die Aufrechterhaltung der Stentposition innerhalb der Luftröhre zu bestätigen. Biokompatibilitätstests mit immunfluoreszierender Färbung für Marker akuter und chronischer Entzündungen zeigen, dass das PLLA-PCL-Stentkonstrukt nicht immunreaktiv ist, wie durch die minimale Anzahl von Immunzellen bestimmt wird, die nach der Platzierung in Abwesenheit von Verletzungen vorhanden sind.Die feinfühlige und atraumatische Manipulation der Atemwege ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Übermäßige Kraft, mehrere Intubationen und Stentkollaps können zum Tod von Tieren führen. Nach der Behandlung mit Rapamycin-elutierendem Stent kann die Beurteilung des Überlebens, die Genexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR, Immunoassay einschließlich Durchflusszytometrie, ELISA und Immunhistochemie durchgeführt werden.Da es eine erfolgreiche Plattform für die Arzneimittelelution in einem Mausmodell bietet, ebnet diese Technik den Weg für zukünftige Untersuchungen lokal angewendeter Therapeutika bei Laryngotrachealstenose. Dichlormethan ist eine korrosive Flüssigkeit. Achten Sie darauf, immer eine Dunstabzugshaube, persönliche Schutzausrüstung und nicht korrosive Materialien zu verwenden

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Dieses Video zeigt und vergleicht zwei experimentellen Modellen zur Entwicklung von obliterative Atemwegserkrankung (OAD) bei Mäusen, die heterotopen und orthotopen Transplantation Tracheal-Modell zu studieren.

Heterotope und orthotopen Tracheal Transplantation in Mäuse als Modelle benutzt, um die Entwicklung von obliterans Airway Disease Study

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