Elektrowetting-basierte Digital Microfluidics Plattform für automatisierte enzymgebundene Immunsorbent Assay

Durch die Automatisierung der Aktivierung einzelner Tröpfchen können komplexe Sequenzen eines Laborgerätebetriebs in einen Chip gebracht werden. Unsere digitale mikrofluidische Plattform befasst sich mit der schnellen spezifischen Entdeckung von Viruserregern im Feld. Diese Methode basiert auf dem quantitativen Nachweis spezifischer Antigene mit EWOD-basierter digitaler Mikrofluidik in Kombination mit magnetischer Immunpräzipitation.

In diesem Beitrag wird das Verfahren anhand von Proben bewertet, die verschiedene Konzentrationen von Bakterien, Sporen, Viren und Proteinen enthalten. Dieser Prozess ist vollautomatisiert, sequenziell, skalierbar und vielseitig. Die Reihenfolge und das Tröpfchenvolumen können an die Anforderungen eines bestimmten Protokolls angepasst werden.

Die digitale Mikrofluidik-Plattform, die die Antikörper-basierte Sensorik vollständig ausblenden kann, könnte zu einer potenziellen Anwendung aufbauen, die auf aptamer Biosensing basiert, bei der die magnetischen Perlen spezifische Aptamer zur Erfassung und Detektion von Nukleotidsequenzen tragen. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, ist es wichtig, die Art des Tensids zu berücksichtigen und zu berücksichtigen, wie es mit Ihrer Wahl der Biochemie und der hydrophoben Polymerbeschichtung interagiert. Beginnen Sie, indem Sie den Magneten aus der digitalen Mikrofluidik oder DMF-Plattform entfernen und auf der Bank platzieren.

Legen Sie eine saubere Betätigungsplatte auf die rotierende Bühne mit dem Nachoben zeigenden Chrom, wobei die Platte mit der oberen linken Ecke der Einbaustufe ausgerichtet wird. Klemmen Sie die Betätigungsplatte von oben mit der Platte mit den 47 Kontaktstiften, die die Platte an Ort und Stelle befestigen und die Ausrichtung mit den Kontaktstiften erleichtern. Dann den 0,5-Millimeter-Shim und den Zwei-Millimeter-PMMA-Abscheider auf die rotierende Stufe aufschreiben, um einen kontrollierten Spalt zwischen betätigungs- und Abdeckplatten zu schaffen.

Um die Tröpfchen auf die vorgeschlagenen Ladepads zu laden, werden vier 2,5-Mikroliter-Tröpfchen aus dem Laufpuffer mit einem Tröpfchen pro Pad auf die B-, A-, R- und E-Belegpads geladen. Dann aliquot 2,5 Mikroliter Luminol Wasserstoffperoxid-Lösung auf dem E bezeichnet Pad. Als nächstes, aliquot 2,5 Mikroliter Neutravidin konjugiert zu HRP biotinylierten sekundären Antikörper und Mikroperlen auf die F, G, und ich bezeichnet Pads jeweils.

Schließlich aliquot 2,5 Mikroliter der unbekannten Probe auf dem C bezeichnet pad. Legen Sie die Abdeckplatte auf die Oberfläche des Rigs neben dem runden Ausnehmbereich und schieben Sie sie seitlich in die Aussparung und auf die Betätigungsplatte. Setzen Sie den Permanentmagneten auf die Abdeckplatte und sichern Sie ihn, indem Sie die beiden Riegel schieben, drehen Sie dann die Bühne um 180 Grad und prüfen Sie sie visuell, um sicherzustellen, dass die geladenen Tröpfchen noch an Ort und Stelle sind.

Überprüfen Sie, ob die Ladeposition für jedes Tröpfchen mit der programmierten Betätigungssequenz in der Software übereinstimmt. Positionieren Sie die abgeschirmte Fotodetektordose in den Schlitz der rotierenden Stufe und schließen Sie das Kabel an. Legen Sie den Deckel über die DMF-Plattform und starten Sie die Programmsequenz über die Softwareschnittstelle.

Die Tröpfchenposition wird über kapazitive Erfassung aufgezeichnet und kann dann auf der Benutzeroberfläche beobachtet werden. Die Programmsequenz fordert Meldungen auf, die an der Schnittstelle angezeigt werden, um den Bediener darüber zu informieren, dass das Luminol-Tröpfchen bereit ist, die extrahierten Magnetperlen zu sammeln, oder dass das Detektionströpfchen bereit ist, an die Erkennungsstelle verschoben zu werden. In beiden Fällen ist eine Bestätigung des Betreibers erforderlich, um fortzufahren.

Die Lichtintensität, die durch die chemilumineszierende Reaktion erzeugt wird, wird vom Photodetektor gelesen und in Echtzeit aufgezeichnet. Um im visuellen Modus zur Optimierung von Protokollen zu arbeiten, starten Sie die Programmsequenz über die Softwareschnittstelle. Die automatisierte Tröpfchenbetätigung kann auf dem Chip für jeden der kritischen Assay-Schritte visualisiert werden, wie magnetische Extraktion der Perlen, Perlen-Resuspension und Mischen.

Wenn Sie dazu aufgefordert werden, montieren Sie die abgeschirmte Fotodetektordose in den Schlitz der rotierenden Stufe. Schließen Sie das Kabel des Photodetektors siebbar an, indem Sie die Stifte in die Buchse einlegen. Legen Sie den Deckel über die DMF-Plattform und setzen Sie den Test fort.

Tröpfchen werden mittels kapazitiver Sensorik überwacht und können auf der Benutzeroberfläche beobachtet werden. Um das Gerät zu reinigen, öffnen Sie den DMF-Plattformdeckel und drehen Sie die Bühne um 180 Grad. Entpacken Sie das Magnetgehäuse und entfernen Sie den Magneten aus der rotierenden Stufe.

Entfernen Sie den Siliziumwafer mit einer Pinzette aus dem Schlupf und spülen Sie ihn mit destilliertem Wasser ab. Dann trocknen Sie es mit Druckluft und legen Sie es in eine Petrischale, wo der Wafer gelagert und wiederverwendet werden kann. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den flüssigen Abfall aus dem Pad zu entfernen, ohne die Oberfläche zu berühren, und reinigen Sie die Oberfläche, indem Sie die Flüssigkeit mit saugfähigem Papier von der Betätigungsplatte ableiten.

Um den Aufprall auf die Betätigungsspannung zu untersuchen, wurde ein Tröpfchen aus dem Puffer mit verschiedenen Betätigungsspannungen angetrieben und seine Bewegung aufgezeichnet. Es wurde eine Korrelation zwischen Vrms und der durchschnittlichen Geschwindigkeit nachgewiesen und nach einem bestimmten Vrms-Wert ein Geschwindigkeitsplateau beobachtet. Die Langlebigkeit der Betätigungsplatte wurde bei Verwendung hoher Werte für Vrms verringert.

Für den Betrieb der Extraktionslaboreinheit wurde das Tröpfchen mit den Schwebeperlen zur Trennstelle in der Mitte der Mischzone getrieben. Dann wurde der Magnet automatisch aktiviert, um sich dem Chip zu nähern und die Perlen zu fokussieren. Als nächstes wurde das Tröpfchen in Richtung Abfallpolster bewegt, so dass die Perlen.

Die Extraktions- und Mischlaborgeräte am EWOD-Chip ermöglichten eine miniaturisierte schnelle und reproduzierbare Probenverarbeitung mit konsekutivem Nachweis der Krankheitserreger in 6 bis 10 Minuten. Inkubationszeiten und Konjugatkonzentrationen wurden variiert, um die optimalen Bedingungen für den Assay zu finden. Es wurde festgestellt, dass die Inkubationszeit von 160 Sekunden und die Konjugatkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter das beste Signal-Rausch-Verhältnis erreichten.

Variationen im Protokoll können eingeführt werden, um die gewünschte Automatisierungsniveaus zu erreichen. Der achtstufige ELISA wurde verwendet, um verschiedene Antigene wie Bacillus atrophaeus sporen und das MS2 Bakteriophage zu erkennen. In der Zwischenzeit wurde das 10-Stufige Protokoll verwendet, um E.coli zu quantifizieren.

Es ist wichtig, dass die angelegten Spannungen, die Konzentrationen von Analyten und Reagenzien für die Aktivierung der Tröpfchen und eine erfolgreiche magnetische Trennung auf dem Chip optimal sind. Um eine genaue Messung zu erreichen, sollte eine Perlenbindungskapazität berücksichtigt werden und es könnten serielle Verdünnungen der Analyten erforderlich sein. Durch den Austausch der Art des Antikörpers konnte man verschiedene Krankheitserreger als den im Ergebnisbereich gemeldeten erkennen.

Das Verfahren könnte beispielsweise auch für die Biomarker-Erkennung oder point-of-Care-Diagnostik angewendet werden. Zusätzlich zu den bereits vorgestellten Anwendungen wurde das System unter Berücksichtigung des Vor-Ort-Nachweises von Luftregern entwickelt. DMF ist eine ideale Plattform für diese Anwendung, da das Tröpfchenvolumen mit der Ausgabe anderer Sampler übereinstimmt, die wir kürzlich entwickelt haben.