Visualisierung und Quantifizierung hochdimensionaler Zytometriedaten mit Cytofast und den Upstream Clustering Methods FlowSOM und Cytosplore

Die durch die Massenzytometrie erzeugten Daten sind komplex und müssen effizient und einfach visualisiert werden. Cytofast ist eine Methode, die immunologische Muster innerhalb der Immunzellpopulation hervorhebt und Zellteilmengen bestimmt, die mit klinischen Behandlungen oder experimentellen Gruppen verbunden sind. Cytofast kann nach jeder Kristallisationsmethode wie FlowSOM oder Cytosplore angewendet werden.

Es ermöglicht Ihnen, eine Zelluntergruppe zu entdecken, die mit einer klinischen Behandlung oder einer experimentellen Gruppe verbunden sind. Mit dieser Methode können Sie den immunologischen Überblick über die Daten auf einen Blick quantitativ sehen. Erstellen Sie zunächst Cluster mit Cytosplore oder FlowSOM.

Wenn Sie Cytosplore verwenden, laden Sie die FCS-Dateien hoch, indem Sie auf Dateien klicken und FCS-Dateien öffnen. Wählen Sie dann einen Cofaktor für die hyperbolische ArcSinh-Transformation aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden, und klicken Sie auf Eindeutiges Beispiel-Tag als Kanal hinzufügen. Wählen Sie HSNE ausführen, um eine HSNE-Ebene von drei auszuführen, und warten Sie, bis die Karte generiert wird.

Überprüfen Sie auf der ersten HSNE-Ebene die Zellen, die für CD161 positiv sind, indem Sie die CD161-positiven Zellen auswählen und mit der rechten Maustaste in die Auswahl zoomen. Wiederholen Sie auf der zweiten Ebene das Verfahren, um die dritte Ebene mit nur CD161-positiven Ereignissen zu erreichen. Nachdem die letzte TSNE-Karte generiert wurde, speichern Sie die von Cytosplore definierten Cluster, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Karte klicken und Speichercluster auswählen.

Wählen Sie das Verzeichnis der Ausgabedateien, wie von Cytosplore aufgefordert, und notieren Sie diesen Speicherort, da er später verwendet wird, um FSC-Dateien in R zu laden. Verwenden Sie einen einfachen Zeichennamen nur beim Umbenennen der Ausgabedateien, was die Identifizierung und weitere Handhabung erleichtert und speichern auswählen wird. Laden Sie die Dateien in R mit der angegebenen Funktion readcytosploreFCS. Um die Daten zu bereinigen, entfernen Sie einige Parameter wie Zeit und Hintergrund, indem Sie die Position der Spalte im Zusammenhang mit ihren unnötigen Parametern überprüfen und sie aus der Matrix entfernen.

Ordnen Sie als Nächstes die Markierungen neu an, sodass Linienmarkierungen zuerst angezeigt werden, gefolgt von funktionalen Markern. Verknüpfen Sie die Metadatendatei mit den generierten Daten von Cytosplore, indem Sie die Tabellenkalkulations-Metadatei hochladen, die klinische Informationen enthält. Um das Clustering von FlowSOM durchzuführen, laden Sie die Rohdaten, die zuvor auf CD161-positiven Ereignissen in R abgegrenzt wurden, mit dem Lesevorgang.

flowSet-Funktion. Wählen Sie die relevanten biologischen Marker aus, indem Sie die richtigen Spalten auswählen und die Daten auf ArcSinh5-Weise transformieren. Wenden Sie einen Kofaktor von fünf an, indem Sie cofacter=5 in der Funktion auswählen.

Clustern Sie die Daten mithilfe der FlowSOM-Funktion und vergleichen Sie FlwoSOM und Cytosplore, indem Sie die Daten in 10 Teilmengen gruppieren, die mit der zuvor von Cytosplore ausgegebenen Ausgabe identisch sind. Weisen Sie dann jede Zelle ihrer identifizierten Teilmenge und Beispiel-ID zu. Laden Sie die Metadatendatei in R, die die Gruppenzuweisung enthält, und verknüpfen Sie sie mit den FCS-Dateien mithilfe des Codes aus dem Textmanuskript. Erstellen Sie eine CF-Liste basierend auf dem von FlowSOM abgerufenen Datenrahmen.

Ordnen Sie dann die Marker so an, dass sie ähnlich wie die Ausgabe aus der Cytosplore-Analyse angezeigt werden. Generieren Sie vor dem Erstellen der Heatmaps die Zähltabelle pro Beispiel mithilfe der Funktion cellCount. Da einige Cluster weniger Zellen enthalten als andere, skalieren Sie die Daten pro Cluster, indem Sie scale=true innerhalb der Funktion angeben, was es leicht macht, die Streuung zwischen Denproben zu erkennen.

Visualisieren Sie die Daten mit einer Heatmap und visualisieren Sie dann mit Boxplots, indem Sie die Zellenanzahl generieren, aber nicht die Daten skalieren, um die Häufigkeit jedes Clusters abrufe. Visualisieren Sie schließlich die Ausdrucksintensität der CD45-, CD11c- und CD54-Marker durch die Notierungsmarkierungsnamen und deren Aufnahme in die MSI-Plotfunktion. Cytofast führt mehrere mögliche Ausgänge aus, einschließlich der Heatmap aller in der Analyse identifizierten Cluster und basierend auf Marker-Ausdruck.

Das Dendrogramm oben stellt die hierarchische Ähnlichkeit zwischen den identifizierten Clustern dar. Im oberen Bereich wird eine weitere Heatmap mit der relativen Menge der entsprechenden Teilmengen in jeder Stichprobe angezeigt. In der Zwischenzeit zeigt das Dendrogramm auf der rechten Seite die Ähnlichkeit zwischen Proben, die auf Submengenfrequenzen basieren, die zeigen, dass der Phänotyp natürlicher Killerzellen drei Tage nach der Injektion durch PD-L1-Behandlung geformt wird.

Die kombinierten Heatmaps können für FlowSOM, gefolgt von Cytofast und cytosplore gefolgt von Cytofast, bezogen werden. Cytofast kann auch verwendet werden, um die Daten quantitativ darzustellen und die Ergebnisse in Box-Plots anzuzeigen. Ein weiteres Feature, das im Cytofast-Paket enthalten ist, ist die MSI-Plotfunktion, die das mittlere Signalintensitätsdiagramm jedes Markers pro Gruppe anzeigt.

Diese Funktion ermöglicht die Erkennung globaler Veränderungen, wie z. B. erhöhungen der Expression von CD54 oder CD11c in natürlichen Killerzellen der PD-L1-behandelten Gruppe. Diese Technik ist eine schnelle Möglichkeit, Daten zu visualisieren und zu quantifizieren und kann verwendet werden, um neuartige zelluläre Reaktionen nach der Therapie zu entdecken. Nach dieser Methode kann das globale Testpaket in R verwendet werden, um eine Gruppe von Kovariaten auf DieZuordnung mit Antwortvariablen zu testen.

Dies zeigt die Korrelation zwischen den einzelnen Teilmengen und dem klinischen Ergebnis.