Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Die meisten Forschungen mit Liposomen verlassen sich auf kühne Techniken, die intrinsisch davon ausgehen, dass alle Liposomen identisch sind. Durch die Untersuchung einzelner Liposomen können signifikante Inhomogenitäten beobachtet werden. Die hier vorgestellte einzige Liposomentechnik ermöglicht es uns, Hunderte von Liposomen gleichzeitig zu untersuchen und Inhomogenitäten in ihrer Größe und Zusammensetzung zu erkennen.

Die Methode kann leicht angepasst werden, um andere Systeme auf einer einzigen Liposomenebene wie Proteinmembran-Wechselwirkungen zu untersuchen. Alles, was Sie brauchen, ist die Verbindung, die Sie studieren, um fluoreszierend gekennzeichnet zu werden. Mit diesem Video stellen wir Forschern das Werkzeug zur Verfügung, wie sie einzelne Liposomenstudien durchführen können.

Wir hoffen, dass klar ist, dass der Test leicht geändert werden kann, um eine Reihe anderer wissenschaftlicher Themen zu studieren. Zunächst die vorbereiteten Lipidvorräte 138 Mikroliter POPC und 120 Mikroliter Cholesterin in eine frische Glasdurchstechflasche mischen. Dann fügen Sie 500 Mikroliter von je zwei fluoreszierend markierten Lipiden und 50 Mikroliter DSPE-PEG-Biotin hinzu.

Lösen Sie den Deckel der Glasdurchstechflasche und fangen Sie die Durchstechflasche in flüssigem Stickstoff für ein bis zwei Minuten einfrieren. Lyophilisieren Sie die gefrorene Lipidmischung über Nacht in einem Gefriertrockner. Am Morgen einen Milliliter 200 Millimolar D-Sorbitol Puffer zu den trockenen Lipiden hinzufügen.

Erhitzen Sie das Gemisch auf 45 Grad Celsius und setzen Sie es mindestens eine Stunde lang dem magnetischen Rühren aus. Dann frieren Sie die Lipidsuspension ein, indem Sie die Durchstechflasche in flüssigen Stickstoff tauchen und warten, bis die Suspension vollständig eingefroren ist. Als nächstes tauchen Sie die gefrorene Suspension in einem Heizbad bei 55 Grad Celsius, bis die Mischung vollständig aufgetaut ist.

Setzen Sie die Mischung insgesamt 11 Gefrier-Tau-Zyklen aus. Danach extrudieren Sie die Liposomensuspension mit einem Mini-Extrusionskit einmal durch einen 800 Nanometer Polycarbonatfilter. Mischen Sie 1, 200 Mikroliter BSA und 120 Mikroliter BSA-Biotin.

Fügen Sie 300 Mikroliter der Mischung in einem Acht-Well-Dia zu jedem Brunnen und inkubieren Sie die Folie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Kippen Sie den Schlitten leicht und vom Rand jedes Brunnens das Medium ansaugen. Fügen Sie sofort 300 Mikroliter HEPES Puffer in jeden Brunnen zum Waschen.

Waschen Sie jeden Gut insgesamt acht Mal. 250 Mikroliter Streptavidin hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Wiederholen Sie die acht Wässer wie zuvor beschrieben.

Platzieren Sie das Dia auf dem Mikroskop und passen Sie den Mikroskop-Joystick so an, dass er sich auf die Oberfläche der Kammer konzentriert. Dies kann ganz einfach über das erhöhte Laserreflexionssignal von der Glaspufferschnittstelle als Führung erfolgen. In einem Mikrozentrifugenrohr 10 Mikroliter des verdünnten Liposomenbestands mit 20 mikromolarem Gesamtfett hinzufügen.

100 Mikroliter Puffer aus der Kammer in das Mikrozentrifugenrohr geben, richtig mischen und die 110 Mikroliter wieder in die Kammer übertragen. Stellen Sie die Kammer unter das Mikroskop und verwenden Sie eine rudimentale Mikroskopeinstellung, die in der Lage ist, Signale von den Liposomenfluorophoren zu erkennen, um zu beobachten, wie die Liposomen auf der Oberfläche immobilisiert werden. Richten Sie das Mikroskop wie im Manuskript beschrieben ein.

Um sowohl die DoPE ATTO488 als auch die DOPE ATTO655 Fluorophore in den Liposomen abzubilden, bilde mehrere Kanäle ab. Stellen Sie sicher, dass jeder Kanal sequenziell abgebildet ist, um eine Quererregung zu vermeiden. Nehmen Sie beispielsweise zuerst ein Bild, indem Sie es mit 488 Nanometern spannend machen und die Emission bei 495 bis 590 Nanometern ablesen.

Danach ändern Sie die Einstellungen und nehmen Sie ein anderes Bild, indem Sie mit 633 Nanometern spannend werden, aber die Emission nur bei 660 bis 710 Nanometern ablesen. Analysieren. Wählen Sie im Bildmenü Farbe aus und verwenden Sie die Mergekanalfunktion, um eine Kombination der beiden Kanäle zu erstellen. Beobachten Sie, ob die liposomen, die in zwei verschiedenen Kanälen abgebildet sind, eine gute Kolokalisierung aufweisen oder ob eine sichtbare Drift aufgetreten ist.

Um Partikel zu erkennen, öffnen Sie das Plugin-Menü, wählen Sie ComDet und klicken Sie auf Partikel erkennen. Überprüfen Sie in ComDet, ob die Einstellungen korrekt sind, und drücken Sie OK. Nach dem Ausführen der Analyse werden zwei Popupfenster mit Ergebnissen und Zusammenfassung angezeigt. Die Ergebnistabelle enthält das Intensitätsverhältnis zwischen den beiden Kanälen.

Exportieren Sie die Ergebnisse der Datentabelle, die die Daten der Kolokalisierung enthalten. Passen Sie das Intensitätsverhältnis Histogramm mit einer Gaußschen Funktion an und extrahieren Sie den Mittelwert und die Standardabweichung. Der Mittelwert und die Standardabweichung können verwendet werden, um den Grad der Inhomogenität zu berechnen.

Bereiten Sie eine Liposomenformulierung vor, die mehrmals durch einen 50-Nanometer-Filter extrudiert wurde. Kalibrieren Sie die Größe der Liposomen, indem Sie die Fluoreszenzintensität mit Größendaten von DLS vergleichen. Mit den gleichen experimentellen Mikroskopeinstellungen wie bisher, bilden Sie die Kalibrierungsliposomen.

Zeichnen Sie ein Quadratischewurzel-Intensitätshistogramm der Fluoreszenzintensität der Kalibrierliposomen. Passen Sie das Histogramm mit einer Log-Normalverteilung an und extrahieren Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Kalibrierliposomen als geometrischen Mittelwert. Um die Beziehung zwischen der Quadratwurzelintensität und der Liposomengröße zu bestimmen, berechnen Sie den Korrekturfaktor, indem Sie den durchschnittlichen Liposomendurchmesser, der aus den dynamischen Lichtstreuungsmessungen gewonnen wird, mit dem geometrischen Mittelwert der Quadratwurzelintensität dividieren.

Berechnen Sie die Quadratischewurzelintensitätswerte für die Liposomen im Experiment zur kompositorischen Inhomogenität und wandeln Sie diese beiden Durchmesser um, indem Sie sie mit dem Korrekturfaktor multiplizieren. Plotten Sie den Intensitätsverhältniswert als Funktion des Durchmessers für die kompositorischen Inhomogenitätsliposomen und erreichen So die Inhomogenität als Funktion der Liposomengröße für eine Population von Liposomen, die sich von etwa 50 Nanometern bis 800 Nanometern erstreckt. In diesem Protokoll wurde die erfolgreiche Oberflächenimmobilisierung von Liposomen sofort bei Zugabe der Liposomenlösung in die Kammer sichtbar, die durch die beugungsbegrenzten Intensitätsflecken angezeigt wird.

Es wird empfohlen, genügend Liposomen zu immobilisieren, um eine Dichte von 300 bis 400 Liposomen pro Rahmen zu erreichen. Eine niedrigere Dichte macht die Datenanalyse zeitaufwändiger, während eine höhere Dichte es schwierig macht, einzelne Liposomen zu unterscheiden. Wenn das gesamte Sichtfeld nicht richtig im Fokus steht, kann die Probenplatte geneigt sein.

Auch, wenn die Liposomen groß und verschwommen erscheinen, deutet dies darauf hin, dass der Puffer in der Kammer verdampft und die Oberfläche ausgetrocknet sein könnte. Die Histogramme des Intensitätsverhältnisses zeigen in der Regel eine Gaußsche Verteilung um einen mittleren Verhältniswert. Wenn starke Abweichungen von einer Gaußschen Verteilung beobachtet werden, deutet dies auf ein Erkennungsempfindlichkeitsproblem hin, das darauf hindeutet, dass eine Teilmenge von Liposomen, die ein schwächeres Signal zeigen, ausgeschlossen wurde.

Nach Anpassung des Intensitätsverhältnisses Histogramms mit einer Gaußschen Funktion wurde ein Inhomogenitätsgrad von 0,23 zu 32% der Bevölkerung übersetzt, die sich um mehr als 23% vom mittleren Molverhältnis des Ensembles unterscheidet. Die Quantifizierung der experimentellen Unsicherheit ergab 0,1. Der Assay wird nie besser als die Materialien, die Sie verwenden, so hochwertige unilaminare Liposomen sind wichtig.

Also, wenn Sie diese vorbereiten, schneiden Sie keine Ecken wie das Auslassen von Frost-Tau-Zyklen. Schlechte Bilder führen zu einer hohen experimentellen Unsicherheit und lassen Sie die Inhomogenität überschätzen, also nehmen Sie sich die Zeit, gute Infokussbilder zu erhalten. Was der Assay im Grunde tut, ist die Oberflächendichte des fluoreszierenden Etiketts zu untersuchen.

Wenn dieses fluoreszierende Etikett auf einem perkolierten Lipid ist, dann kann dieser Test verwendet werden, um Liposomen für die Medikamentenabgabe zu testen. Das Setup wurde angewendet, um zu untersuchen, wie Peptide an Membranen binden und die Krümmung spüren. Dies hat Forschern einzigartige Einblicke in die molekularen Hinweise gegeben, die steuern, wie Peptide innerhalb von Zellen sortiert werden.