Auswertung der zerebralen Blutfluss-Autoregulation in der Ratte mit Laser-Doppler-Flowmetrie

Dieses Protokoll eignet sich ideal zur Bewertung der Fähigkeit der zerebralen Mikrozirkulation, den eigenen Blutfluss während der Blutdruckänderungen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu regulieren. LDF bietet eine relativ nicht-invasive Methode zur kontinuierlichen Überwachung des zerebralen Blutflusses unter einer Vielzahl von Bedingungen, die mit anderen Methoden nicht möglich ist. Die Laser-Doppler-Flowmetrie kann zur nicht-invasiven Blutflussauswertung eingesetzt werden.

Zum Beispiel, um die Auswirkungen einer hohen Salzdiät auf die eingeschränkte Durchblutungsregulation bei gesunden jungen Frauen zu bewerten. LDF ermöglicht die einfache Überwachung des Blutflusses in vielen verschiedenen Gefäßbetten von Mensch und Tier und kann in einer Vielzahl von Studien verwendet werden. Das Verfahren mit Adrienne Allen demonstriert Megan Stumpf, meine Forschungstechnologin und Laborleiterin.

Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, legen Sie die Ratte auf eine zirkulierende Wasserdecke, die bei 37 Grad Celsius gehalten wird, und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex eingeste Versuchsratte. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Tiere auf und rasieren Sie die Oberseite des Schädels, ventralen Halsbereich und Femoral Dreiecke. Entfernen Sie alle verlorenen Haare von der exponierten Haut.

Und desinfizieren Sie die Haut mit Reiben Alkohol. Bewegen Sie die Ratte auf ein Heizkissen mit einer zirkulierenden Warmwasserpumpe. Und verwenden Sie medizinisches Klebeband, um die Ratte vorübergehend in der Supine-Position zu sichern.

Füllen Sie zwei PE 50 Kanülen mit einer Einheit pro ml Heparin in isotonischer Natriumchloridlösung. Und das offene Ende der Katheter mit einer chirurgischen Schere abschrägen, um das Einführen in die Arterien zu erleichtern. Nachdem Sie die Oberschenkelarterien unter einem Sezierendes Mikroskop sorgfältig vom umgebenden Gewebe getrennt haben, legen Sie das distale Ende des isolierten Femoralarteriensegments auf und legen Sie zwei zusätzliche Nähte um die mittleren und proximalen Enden der Arterie, ohne die Knoten zu straffen.

Legen Sie einen V-förmigen Draht aus einer Büroklammer unter der Arterie ein, um das Gefäß zu verschließen, bis die Kanüle gesichert ist. Dann verwenden Sie Vannas Schere, um einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie in der Nähe der distalen Ligation zu machen. Setzen Sie das abgeschrägte Ende der Kanüle in den Schnitt ein und bringen Sie die Kanüle in die Oberschenkelarterie.

Entfernen Sie die Büroklammer. Ziehen Sie den Knoten in der mittleren Ligatur über der Kanüle, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern. Lösen Sie die Spannung auf der Hebeligatur, dann ziehen Sie die proximale Ligatur und schließen Sie den Schnitt.

Unmittelbar nachdem die Kanülen an Ort und Stelle sind, stellen Sie das Tier in eine sternale Position. Und sichern Sie den Kopf in einem stereotaxic Gerät, das darauf achtet, die Katheter nicht zu lösen. Machen Sie einen elliptischen Schnitt in der Haut, der den Schädel bedeckt.

Und verwenden Sie einen Wattestäbchen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Schädel sauber und trocken ist. Legen Sie ein kleines, gerolltes, längliches Stück Tissuepapier um den Schnitt auf der Kopfhaut, um Blutungen zu stoppen, und verwenden Sie unter dem Sezieren des Mikroskops einen entsprechend großen Bohrer mit einem 2,15 mm Bohrer, um einen 0,5 bis 1 cm großen Knochenbereich im parietalen Bereich über dem linken oder rechten somatosensorischen Kortex zu verdünnen, je nach Größe der Ratte. Dünnen Sie den Knochen langsam und vorsichtig, um ein Eindringen in den Schädel zu vermeiden.

Während dieses Schritts sollte die saline Lösung großzügig angewendet werden, um eine Überhitzung des Bereichs zu verhindern. Wenn der Bereich ein rosa Aussehen hat und/oder Blutgefäße visualisiert werden können, bedecken Sie den ausgedünnten Knochen mit Mineralöl. Und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Laserdopplersonde über der exponierten zerebralen Mikrozirkulation zu positionieren, so dass die Spitze der Sonde nur die Spitze des Mineralölpools berührt.

Bei der ersten Sondenplatzierung ist es am besten, mit einem Signal von ca. 150 Einheiten zu beginnen, um sicherzustellen, dass die Sonde über der Mikrozirkulation positioniert ist. Wenn die Laser-Doppler-Flowmetriesonde an Ort und Stelle ist, lassen Sie das Tier für eine 30- bis 45-minütige Equilibritionszeit ruhen, bevor Sie 1,5 ml Blut über einen Zeitraum von 30 Sekunden aus der entsprechenden Femoralarterienkanüle abziehen. Um das Katheterpatent zu behalten, gießen Sie 100 Einheiten pro ml Heparin in isotonischer Saline nach jeder Blutentnahme in die Kanüle ein.

Lassen Sie die Ratte für zwei Minuten erholen und messen Sie dann LDF und Blutdruck alle 30 Sekunden für zwei Minuten. Wiederholen Sie nach den Blutdruck- und LDF-Messungen alle zwei Minuten den Blutvolumenentzug, bis das Tier einen mittleren arteriellen Druck von ca. 20mmHg erreicht. In diesen repräsentativen Experimenten wurde der mittlere zerebrale Laserblutfluss von 10 Sprague-Dawley-Ratten, die mit Standardlabor-Chow gefüttert wurden, innerhalb von 20 % des Vorblutungswertes nach den ersten drei Blutvolumenentnahmen beibehalten, bis der mittlere arterielle Druck die untere Grenze der Autoregulation erreichte.

Nachfolgende Blutvolumenentnahmen bei Drücken unterhalb der unteren Grenze der Autoregulation führten zu einer fortschreitenden Verringerung des zerebralen Laserdurchflusses, der zeigte, dass die zerebrale Zirkulation nicht mehr in der Lage war, ein ausreichendes Gehalt an Vasodilatation zu erzeugen, um den zerebralen Blutfluss konstant bei den niedrigeren Profusionsdrücken zu halten. Bei Drücken an oder über der unteren Grenze der Autoregulation gab es keine signifikante Korrelation zwischen dem zerebralen Laserblutfluss und dem arteriellen Druck, was darauf hindeutet, dass der zerebrale Laserdurchfluss unabhängig vom arteriellen Druck im Plateaubereich der autoregulierenden Kurve war. Unterhalb der unteren Grenze der Autoregulation hatte die laserzerebrale Blutfluss arterielle Druckbeziehung eine negative Neigung.

Und der laserzerebrale Blutfluss war signifikant mit dem arteriellen Druck korreliert. Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, den Schädel sehr sorgfältig auszudünnen und sicherzustellen, dass die LDF-Sonde fest über dem gleichen Gewebebereich verankert bleibt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Reaktivität der Mikrozirkulation verschiedener Wirkstoffe nach retrograder Infusion über die Halsschlagader zu testen oder funktionelle Hyperämie und neurovaskuläre Kopplung in der zerebralen Zirkulation zu bewerten.

Diese Technik hat die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Medikamente und Anästhetika auf die zerebrale Durchblutung und die Veränderungen der zerebralen Autoregulation in Krankheitsmodellen wie Bluthochdruck ermöglicht.