Name: Auswertung der zerebralen Blutfluss-Autoregulation in der Ratte mit Laser-Doppler-Flowmetrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die zerebrale Blutfluss-Autoregulation bei Ratten mit Laser-Doppler-Flowmetrie bewerten. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des zerebralen Blutflusses unter verschiedenen Bedingungen.

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Die Autoren bedanken sich aufrichtig bei Kaleigh Kozak, Megan Stumpf und Jack Bullis für ihre hervorragende Unterstützung bei der Fertigstellung dieser Studie und der Vorbereitung des Manuskripts. Grant-Unterstützung: NIH #R01-HL128242, #R21-OD018309 und #R21-OD024781.

Das Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigte alle in diesem Papier beschriebenen Protokolle, und alle Verfahren entsprechen dem National Institutes of Health (NIH) Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) Vorschriften.
1. Versuchstiere und Aufnahmevorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie 8-12 Wochen alte männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g. Für diese Experimente füttern Ratten eine Standarddiät bestehend aus 0,4% NaCl, 200 g/kg Casein, 3 g/kg DL-Methionin, 497,77 g/kg Saccharose, 150 g/kg Maisstärke, 50 g/kg Maisöl, 50 g/kg Zellulose, 2 g/kg Cholinbitartrat, 35 g/kg Mineralmischung und 10 g/kg Vitaminmischung.</li>
	<li>Zeichnen Sie arterielle Blutdruck- und LDF-Messungen mit Datenerfassungssoftware oder einer vergleichbaren Aufzeichnungsmethode auf.</li>
	<li>Befestigen Sie den arteriellen Druckwandler an einem Kanal des Aufnahmesystems und die LDF-Sonde an den anderen Kanal des Aufnahmesystems.</li>
	<li>Kalibrieren Sie vor der Messung die Laser-Doppler-Sonde, um einen Motilitätsstandard zu setzen und sicherzustellen, dass das Laser-Doppler-Durchflussmesser eine konstante Leistung liefert.</li>
	<li>Bereiten Sie zusätzliche Ausrüstung für die vorbereitende Operation und für das Experiment vor: ein Sezieren des Mikroskops, ein Nagetier-Beatmungsgerät, ein Endgezeiten-CO2-Monitor, ein stereotaxic-Instrument zur Befestigung des Kopfes der Ratte in Position und ein Mikromanipulator, um die LDF-Sonde über der pialen Mikrozirkulation zu lokalisieren und in einer stabilen Position zu halten.</li>
</ol>2. Chirurgische Präparation
<ol><li>Wiegen Sie die Ratte und beanten das Tier in einer Induktionskammer mit 3,5% Isofluran und 30%O2 Ergänzung.</li>
	<li>Entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer und ersetzen Sie eine Anästhetikummaske, die 1,5–3% Isofluran liefert, durch eine 30%O2-Ergänzung.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte auf eine zirkulierende Wasserdecke, die bei 37 °C gehalten wird, und überprüfen Sie die Reflexe mit einer Zehenzange, um sicherzustellen, dass es einen Entzugsreflex gibt. Tragen Sie sterile ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um Hornhautaustrocknung zu verhindern.</li>
	<li>Rasieren Sie die Spitze des Schädels, ventralen Halsbereich, und Femoral Dreiecke. Entfernen Sie lose Haare aus diesen Bereichen und reinigen Sie mit Reiben Alkohol.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in eine Supine-Position auf einem Heizkissen mit einer zirkulierenden Warmwasserpumpe, um die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C zu halten und sie vorübergehend mit medizinischem Klebeband am Pad zu befestigen.</li>
	<li>Installieren Sie eine Luftröhrenkanüle (PE240 Polyethylenrohre) durch einen ventralen Schnitt im Hals, wie an anderer Stelle beschrieben26.</li>
	<li>Befestigen Sie die Luftröhrenkanüle an einem Endgezeiten-CO2-Monitor und dem Beatmungsgerät, das 2,5–3,0 % Isofluran (je nach Größe des Tieres) und eine 30% O2-Inhalationsergänzung liefert. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz, die Inspiratorzeit und das Minutenbeatmungsvolumen eingestellt und überwacht werden, um während des gesamten Experiments ein abgelaufenes Gezeiten-CO2 von ca. 35 mmHg zu gewährleisten. HINWEIS: Dies wird in der Regel mit einer Atemfrequenz von ca. 48–60 Atemzügen/min, einem Gezeitenvolumen von 1,70–2,30 ml und einer Inspirationszeit von 0,50–0,60 s für eine 250–300 g Ratte erreicht.</li>
	<li>Füllen Sie zwei PE50-Polyethylenkanülen mit 1 U/ml Heparin in isotonischer NaCl-Lösung, um Gerinnung zu verhindern und die Durchgängigkeit der Katheter aufrechtzuerhalten. Nach dem Befüllen das offene Ende jeder Kanüle mit einer chirurgischen Schere abschrägen, um das Einführen in die Arterie zu erleichtern.</li>
	<li>Kanülieren Sie die rechte und linke Femoralarterien, wie an anderer Stelle beschrieben27, um eine kontinuierliche Überwachung des arteriellen Drucks in einem Katheter und Blutentnahme aus dem anderen Katheter zu ermöglichen.<ol>
<li>Nachdem Sie die Arterien unter einem Sezierendes Mikroskop sorgfältig vom umgebenden Gewebe getrennt haben, legen Sie das distale Ende der Arterie auf und legen Sie zwei zusätzliche Nähte um die mittleren und proximalen Enden der Arterie, ohne die Knoten zu straffen.</li>
		<li>Verwenden Sie die proximale Naht als Hebeligatur, um Blutungen aus der Arterie nach dem Einschnitt zur Kanüleneinfügung zu verhindern (Schritt 2.11).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie einen V-förmigen Draht aus einer Büroklammer unter der Arterie ein, um das Gefäß zu verschließen, bis die Kanüle gesichert ist.</li>
	<li>Unter einem Sezieren Mikroskop machen einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie in der Nähe der distalen Ligation mit Vannas Schere. Setzen Sie das abgeschrägte Ende der Kanüle in den Schnitt ein und bringen Sie es in die Oberschenkelarterie. Ziehen Sie den Knoten an der mittleren Ligatur an, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern, damit sie nicht durch arteriellen Druck entfernt wird, wenn die Hebeligatur oder Büroklammer entfernt wird.</li>
	<li>Nachdem die mittlere Ligatur angezogen wurde, lassen Sie die Spannung auf der Hebeligatur los und/oder entfernen Sie die Büroklammer, und ziehen Sie die proximale Ligatur an.</li>
	<li>Schließen Sie den Schnitt mit feinen Nähten (3:0 Seide) oder einem chirurgischen Grundnahrungsmittel. Alternativ legen Sie eine feuchte Gaze über die Einschnittstelle, abhängig von der Größe des Einschnitts.</li>
</ol>3. Schädelverdünnung für LDF-Messungen
<ol><li>Unmittelbar nachdem die Kanülen an Ort und Stelle sind, stellen Sie das Tier in eine Sternposition und sichern Sie den Kopf in einem stereotaxic Gerät, wobei Sie darauf achten, die Katheter oder Trachealröhren nicht zu lösen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen elliptischen Schnitt in der Haut zu machen, der den Schädel bedeckt. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Schädel sauber und trocken ist. Legen Sie ein kleines längs esliertes und gerolltes Stück Tissuepapier um den Schnitt auf der Kopfhaut, um Blutungen zu stoppen.</li>
	<li>Verwenden Sie unter dem Sezierendes Mikroskop ein Dremel-Werkzeug oder einen Zahnbohrer mit einem 2,15 mm Bohrer, um eine kleine Knochenfläche (je nach Größe der Ratte ca. 0,5–1 cm) im parietalen Bereich über dem linken oder rechten somatosensorischen Kortex zu verdünnen. VORSICHT: Dünnen Sie den Knochen langsam und vorsichtig, um ein Eindringen in den Schädel zu vermeiden. Während dieses Schritts sollte eine saline Lösung großzügig angewendet werden, um eine Überhitzung des Gebiets zu verhindern.</li>
	<li>Sobald der Schädel ausgedünnt wurde und der Bereich ein rosa Aussehen hat und/oder Blutgefäße visualisiert werden, decken Sie den Bereich mit Mineralöl ab und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Laser-Dopplersonde über der exponierten zerebralen Mikrozirkulation zu positionieren, so dass die Spitze der Sonde nur die Spitze des Mineralölpools berührt (Abbildung 1). HINWEIS: Es ist wichtig, LDF-Messungen in einem Bereich durchzuführen, in dem es keine äußeren Vibrationen gibt, die die Laser-Doppler-Messungen stören würden, und dass die Sonde während des gesamten Experiments sicher über demselben Zielbereich fixiert ist.</li>
</ol>4. Beurteilung der zerebralen vaskulären Autoregulation
<ol><li>Sobald die LDF-Sonde in Position ist, lassen Sie eine 30–45 min Ausgeglichenheit vor Beginn des Experiments zu. Messen Sie nach der Ausgleichsperiode den mittleren arteriellen Druck (MAP) und den zerebralen Laserblutfluss (LCBF) alle 30 s für 2 min und durchschnittlich die Werte, um die Ausgangswerte für den Blutdruck vor der Blutung und LCBF zu erhalten.</li>
	<li>Um die zerebrale vaskuläre Autoregulation als Reaktion auf arterielle Druckreduktion zu bewerten, messen Sie die LCBF und MAP nach aufeinanderfolgenden Entnahmen von 1,5 ml Blut aus der Femoralarterie11. Um das Katheterpatent zu halten, stellen Sie sicher, dass nach jeder Blutentnahme ein Volumen von Heparinlösung (100 U/ml in isotonischer Saline) in etwa gleich dem Kathetervolumen infundiert wird. ANMERKUNG: Bei der Infundierung der Heparin-Lösung zur Aufrechterhaltung der Katheterdurchgängigkeit ist es wichtig, das Volumen der Heparin-Lösung so nah wie möglich an das Volumen des Katheters anzugleichen, um zu verhindern, dass das Tier zu viel Heparin erhält, was zu unerwünschten Blutungen.</li>
	<li>Nach jedem Blutvolumenentzug kann die Ratte 2 min ausdemieren, danach werden MAP und LCBF alle 30 s für 2 min aufgezeichnet. Wiederholen Sie die Blutvolumenentnahmen, bis das Tier einen MAP von ca. 20 mmHg erreicht.</li>
	<li>Bestimmen Sie den effektiven Autoregulierungsbereich, indem Sie den Blutdruckbereich vom prähemorrhage MAP bis zur LLA (Schritte 4.5 und 5.3, unten) ermitteln.</li>
	<li>Bestimmen Sie die LLA, indem Sie den niedrigsten Druck ermitteln, bei dem LCBF nach der Entnahme des Blutvolumens immer noch innerhalb von 20 % des Kontrollwerts vor Blutungen zurückkehrt, wie zuvor beschrieben11,28 oder indem Sie den Schnittpunkt der Regressionslinien identifizieren, der während der Plateauphase der Autoregulation und unterhalb der LLA ermittelt wurde, wo LCBF mit jeder aufeinanderfolgenden Blutentnahme abnimmt (Schritt 5.3, unten). HINWEIS: Die Kriterien für die Definition des LLA- und Autoregulierungsplateaus können zwischen Laboratorien (z. B. Takada et al.28 vs. Jones et al.29) sowie Verfahren zur Senkung des arteriellen Blutdrucks (z. B. Entnahme eines bestimmten Blutvolumens vs. kontrollierter Blutungen, um bestimmte arterielle Druckwerte zu erreichen)variieren 11.</li>
	<li>Am Ende des Experiments, euthanisieren Sie das Tier durch die Schaffung eines bilateralen Pneumothorax unter einer chirurgischen Ebene der Anästhesie, wie von der IACUC genehmigt.</li>
	<li>LDF-Werte, die nach der Einschläferne des Tieres im Gewebe erhalten werden, liefern den Null-Basis-Fließwert für den Versuchsaufbau.</li>
</ol>5. Statistische Analyse
<ol><li>Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um die Korrelation zwischen den LDF-Werten und dem entsprechenden arteriellen Druck zu bewerten. Verwenden Sie die Basis-LDF-Werte, die nach der Einschläferne des Tieres ermittelt wurden, um sicherzustellen, dass kein unspezifisches LDF-Signal vorhanden ist, das die gemessenen Durchflussraten beeinflusst.</li>
	<li>Berechnen Sie die LLA anhand des Schnittpunkts zwischen den Regressionslinien oberhalb und unterhalb des Autoregulierungsplateaus. Um die LLA mit dieser Methode zu berechnen, kombinieren Sie die beiden Regressionsgleichungen und lösen Sie die resultierende Gleichung für arteriellen Druck.</li>
	<li>Wenn Sie verschiedene experimentelle Gruppen vergleichen, verwenden Sie die lineare Regressionsanalyse, um die Neigungen des LDF vs. arteriellen Druckverhältnisses oberhalb und unterhalb der LLA für jedes Tier zu berechnen und sie als Mittelwert für die Tiere in dieser experimentellen Gruppe zusammenzufassen.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Auswertung von Gewebe-Blutflussreaktionen mit Laser Doppler-Flowmetrie (LDF). Wie oben erwähnt, ist das LDF-Signal proportional zur Anzahl und Geschwindigkeit der sich bewegenden Teilchen, in diesem Fall RBC, in der Mikrozirkulation. LDF-Messungen in verschiedenen Organen korrelieren gut mit dem Vollorgan-Blutfluss, der mit etablierten Methoden wie elektromagnetischen Durchflussmessern und radioaktiven Mikrosphären30 bewertet wird, und stimmen im Allgemeinen mit Studien überein, d...

Autoregulatorische Mechanismen in der zerebralen Zirkulation spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion im Gehirn. Die Autoregulation des zerebralen Blutflusses wird durch mehrere Faktoren beeinflusst, einschließlich Herzfrequenz, Blutgeschwindigkeit, Perfusionsdruck, Durchmesser der Hirnwiderstandsarterien und der Mikrozirkulationsresistenz, die alle eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der gesamten zerebralen Blutflusskonstante im Gehirn über den physiologischen Bereich des systemischen Blutdrucks spielen. Wenn der arterielle Druck zunimmt, verengen diese Mechanismen Arteriolen und Widerstandsarterien, um gefährliche Erhöhungen des intrakraniellen Drucks zu verhindern. Wenn der arterielle Blutdruck abnimmt, werden die Arteriolen durch lokale Kontrollmechanismen zur Aufrechterhaltung der Gewebeperfusion und o2-Abgabe dedukumen. Verschiedene pathologische Erkrankungen wie Hyperkapnie, traumatische oder globale hypoxische Hirnverletzungen und diabetische Mikroangiopathie1,2,3,4,5,6 können die Fähigkeit des Gehirns stören, seinen Blutfluss autoregulieren. Zum Beispiel verschiebt chronische Hypertonie den effektiven Autoregulierungsbereich in Richtung höherer Drücke7,8,9, und eine hohe Salzdiät (HS) stört nicht nur die normale Endothel-abhängige Dilatation in der zerebralen Mikrozirkulation10, sondern beeinträchtigt auch die Fähigkeit der autoregulatorischen Mechanismen in der zerebralen Zirkulation, die Gewebedurchblutung zu erweitern und aufrechtzuerhalten, wenn der arterielle Druck reduziert wird11. Die zerebrale Autoregulation ist auch bei Salzempfindlichen Ratten in Dahl beeinträchtigt, wenn sie mit einer HS-Diät gefüttert werden12.
Bei der Verringerung des arteriellen Drucks gibt die Dilatation der Hirnwiderstandsarterien und Arteriolen zunächst den zerebralen Blutfluss zurück, um die Werte trotz des reduzierten Durchblutungsdrucks zu kontrollieren. Da der arterielle Druck weiter reduziert wird, bleibt der zerebrale Blutfluss im unteren Druck konstant (Plateauphase der autoregulierenden Reaktion), bis die Gefäße nicht mehr erweitern können, um den Blutfluss im unteren Druck aufrechtzuerhalten. Der niedrigste Druck, bei dem ein Organ den normalen Blutfluss aufrechterhalten kann, wird als untere Grenze der Autoregulation (LLA) bezeichnet. Bei Drücken unterhalb der LLA nimmt der zerebrale Blutfluss signifikant ab von ruhewerten und nimmt linear mit jeder Verringerung des arteriellen Perfusionsdrucks13,14ab. Eine Aufwärtsverschiebung in der LLA, wie bei Bluthochdruck7,8,9beobachtet, kann das Risiko und die Schwere der ischämischen Verletzung unter Bedingungen erhöhen, in denen der arterielle Perfusionsdruck reduziert wird (z. B. Myokardinfarkt, ischämischer Schlaganfall oder Kreislaufschock).
LDF hat sich als äußerst wertvoller Ansatz zur Bewertung des Blutflusses in der Mikrozirkulation unter einer Vielzahl von Umständen erwiesen, einschließlich der Autoregulation des Blutflusses im Zerebralparesekreislauf11,14,15. Zusätzlich zur Bewertung autoregulierender Reaktionen kann LDF verwendet werden, um den kortikalen Blutfluss bei der Untersuchung metabolischer, myogener, endothelialer, humoraler oder neuronaler Mechanismen zu überwachen, die den zerebralen Blutfluss und die Auswirkungen verschiedener experimenteller Eingriffe und pathologischer Bedingungen auf den zerebralen Blutfluss10,16,17,18,19,20,21regulieren.
LDF misst die Verschiebung des reflektierten Laserlichts als Reaktion auf die Anzahl und Geschwindigkeit sich bewegender Teilchen - in diesem Fall rote Blutkörperchen (RBC). Für Studien zur zerebralen vaskulären Autoregulation wird der arterielle Blutdruck entweder durch die Infusion eines alpha-adrenergen Agonisten verändert, um den arteriellen Druck zu erhöhen (weil die zerebrale Zirkulation selbst unempfindlich gegenüber alpha-adrenergen Vasokonstriktoragonisten ist)12,15 oder durch kontrollierte Blutvolumenentnahme zur Verringerung des arteriellen Drucks11,14. In der vorliegenden Studie wird LDF verwendet, um die Auswirkungen von abgestuften Senkungen des Blutdrucks auf die zerebrale Autoregulation bei einer gesunden Ratte zu demonstrieren. Obwohl offene und geschlossene Schädelmethoden in der Literatur22,23,24,25beschrieben wurden, zeigt das vorliegende Papier eine geschlossene Schädelpräparation, die es ermöglicht, den zerebralen Blutfluss zu bewerten, ohne in den Schädel einzudringen oder eine Kammer oder ein Hirnfenster zu installieren.

<table><tbody><tr><td>3-0 geflochtene Naht aus schwarzer Seide</td><td>Midwest Vet</td><td>193.73000.2</td><td></td></tr><tr><td>Arterieller Druckwandler</td><td>Merit Medical</td><td>041516504A</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierte Datenerfassungssysteme (WINDAQ & BIOPAC-System)</td><td>DATAQ Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blutdruckanzeigeeinheit</td><td>Stoelting</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>Umwälzpumpe für warmes Wasser</td><td>Gaymar Industries</td><td>T-Pumpe</td><td></td></tr><tr><td>Endtidales CO2-Messgerät</td><td>Stoelting</td><td>Capstar-100</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Midwest Vet</td><td>191.46720.3</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Doppler-Durchflussmesser</td><td>Perimed</td><td>PeriFlux 5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Doppler-Nachfüllmotilitätsstandard</td><td>Perimed</td><td>PF1001</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch (PE240) (für Luftröhrenkanüle)</td><td>VWR</td><td>63018-828</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch (PE50) (für Femurkatheter)</td><td>VWR</td><td>63019-048</td><td></td></tr><tr><td>Nagetierbeatmungsgerät</td><td>Cwe/ Stoelting</td><td>SAR-830/P</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Midwest Vet</td><td>193.74504.3</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Outbreeded Rats</td><td>Variable</td><td>N/A</td><td>Ratten wurden bei verschiedenen Firmen</td></tr><tr><td>bestellt Standard Rat Chow</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113755</tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument</td><td>Cwe/Stoelting</td><td>Clasic Lab Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

auswertung der zerebralen blutfluss-autoregulation in der ratte mit laser-doppler-flowmetrie

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Bei der Untersuchung der mechanismen des Körpers zur Regulierung des zerebralen Blutflusses kann eine relative Messung des mikrozirkulierenden Blutflusses mit Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) erreicht werden. Dieses Papier zeigt eine geschlossene Schädelpräparation, die es ermöglicht, den zerebralen Blutfluss zu beurteilen, ohne in den Schädel einzudringen oder eine Kammer oder ein Zerebralpeinzusungsfenster zu installieren. Zur Bewertung der autoregulatorischen Mechanismen kann ein Modell der kontrollierten Blutdrucksenkung durch abgestufte Blutungen verwendet werden, während gleichzeitig LDF eingesetzt wird. Dies ermöglicht die Echtzeit-Tracking der relativen Veränderungen des Blutflusses als Reaktion auf die Verringerung des arteriellen Blutdrucks durch die Entnahme des zirkulierenden Blutvolumens erzeugt. Dieses Paradigma ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung der autoregulation des zerebralen Blutflusses bei der Senkung des arteriellen Blutdrucks und ist mit geringfügigen Änderungen im Protokoll auch als experimentelles Modell des hämorrhagischen Schocks wertvoll. Zusätzlich zur Bewertung autoregulierender Reaktionen kann LDF verwendet werden, um den kortikalen Blutfluss zu überwachen, wenn metabolische, myogene, endotheliale, humorale oder neuronale Mechanismen untersucht werden, die den zerebralen Blutfluss und die Auswirkungen verschiedener experimenteller Interventionen und pathologische Bedingungen bei der zerebralen Durchblutung.

Abbildung 2 fasst die Ergebnisse von Experimenten zusammen, die an 10 männlichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt wurden, die standardlaborierte Chow gefüttert wurden. In diesen Experimenten wurde der mittlere LCBF nach den ersten drei Blutvolumenentnahmen innerhalb von 20 % des Prämorhage-Wertes gehalten, bis der mittlere arterielle Druck die LLA erreichte. Nachfolgende Blutvolumenentnahmen bei Drücken unterhalb der LLA führten zu einer progressiven Reduktion von LCBF, was zeigte, dass di...

Dieser Artikel zeigt die Verwendung von Laser-Doppler-Flowmetrie, um die Fähigkeit der zerebralen Zirkulation zu bewerten, ihren Blutfluss während der Senkung des arteriellen Blutdrucks autoregulieren.

Auswertung der zerebralen Blutfluss-Autoregulation in der Ratte mit Laser-Doppler-Flowmetrie

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Dieses Protokoll eignet sich ideal zur Bewertung der Fähigkeit der zerebralen Mikrozirkulation, den eigenen Blutfluss während der Blutdruckänderungen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu regulieren. LDF bietet eine relativ nicht-invasive Methode zur kontinuierlichen Überwachung des zerebralen Blutflusses unter einer Vielzahl von Bedingungen, die mit anderen Methoden nicht möglich ist. Die Laser-Doppler-Flowmetrie kann zur nicht-invasiven Blutflussauswertung eingesetzt werden.Zum Beispiel, um die Auswirkungen einer hohen Salzdiät auf die eingeschränkte Durchblutungsregulation bei gesunden jungen Frauen zu bewerten. LDF ermöglicht die einfache Überwachung des Blutflusses in vielen verschiedenen Gefäßbetten von Mensch und Tier und kann in einer Vielzahl von Studien verwendet werden. Das Verfahren mit Adrienne Allen demonstriert Megan Stumpf, meine Forschungstechnologin und Laborleiterin.Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, legen Sie die Ratte auf eine zirkulierende Wasserdecke, die bei 37 Grad Celsius gehalten wird, und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex eingeste Versuchsratte. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Tiere auf und rasieren Sie die Oberseite des Schädels, ventralen Halsbereich und Femoral Dreiecke. Entfernen Sie alle verlorenen Haare von der exponierten Haut.Und desinfizieren Sie die Haut mit Reiben Alkohol. Bewegen Sie die Ratte auf ein Heizkissen mit einer zirkulierenden Warmwasserpumpe. Und verwenden Sie medizinisches Klebeband, um die Ratte vorübergehend in der Supine-Position zu sichern.Füllen Sie zwei PE 50 Kanülen mit einer Einheit pro ml Heparin in isotonischer Natriumchloridlösung. Und das offene Ende der Katheter mit einer chirurgischen Schere abschrägen, um das Einführen in die Arterien zu erleichtern. Nachdem Sie die Oberschenkelarterien unter einem Sezierendes Mikroskop sorgfältig vom umgebenden Gewebe getrennt haben, legen Sie das distale Ende des isolierten Femoralarteriensegments auf und legen Sie zwei zusätzliche Nähte um die mittleren und proximalen Enden der Arterie, ohne die Knoten zu straffen.Legen Sie einen V-förmigen Draht aus einer Büroklammer unter der Arterie ein, um das Gefäß zu verschließen, bis die Kanüle gesichert ist. Dann verwenden Sie Vannas Schere, um einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie in der Nähe der distalen Ligation zu machen. Setzen Sie das abgeschrägte Ende der Kanüle in den Schnitt ein und bringen Sie die Kanüle in die Oberschenkelarterie.Entfernen Sie die Büroklammer. Ziehen Sie den Knoten in der mittleren Ligatur über der Kanüle, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern. Lösen Sie die Spannung auf der Hebeligatur, dann ziehen Sie die proximale Ligatur und schließen Sie den Schnitt.Unmittelbar nachdem die Kanülen an Ort und Stelle sind, stellen Sie das Tier in eine sternale Position. Und sichern Sie den Kopf in einem stereotaxic Gerät, das darauf achtet, die Katheter nicht zu lösen. Machen Sie einen elliptischen Schnitt in der Haut, der den Schädel bedeckt.Und verwenden Sie einen Wattestäbchen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Schädel sauber und trocken ist. Legen Sie ein kleines, gerolltes, längliches Stück Tissuepapier um den Schnitt auf der Kopfhaut, um Blutungen zu stoppen, und verwenden Sie unter dem Sezieren des Mikroskops einen entsprechend großen Bohrer mit einem 2,15 mm Bohrer, um einen 0,5 bis 1 cm großen Knochenbereich im parietalen Bereich über dem linken oder rechten somatosensorischen Kortex zu verdünnen, je nach Größe der Ratte. Dünnen Sie den Knochen langsam und vorsichtig, um ein Eindringen in den Schädel zu vermeiden.Während dieses Schritts sollte die saline Lösung großzügig angewendet werden, um eine Überhitzung des Bereichs zu verhindern. Wenn der Bereich ein rosa Aussehen hat und/oder Blutgefäße visualisiert werden können, bedecken Sie den ausgedünnten Knochen mit Mineralöl. Und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Laserdopplersonde über der exponierten zerebralen Mikrozirkulation zu positionieren, so dass die Spitze der Sonde nur die Spitze des Mineralölpools berührt.Bei der ersten Sondenplatzierung ist es am besten, mit einem Signal von ca. 150 Einheiten zu beginnen, um sicherzustellen, dass die Sonde über der Mikrozirkulation positioniert ist. Wenn die Laser-Doppler-Flowmetriesonde an Ort und Stelle ist, lassen Sie das Tier für eine 30- bis 45-minütige Equilibritionszeit ruhen, bevor Sie 1,5 ml Blut über einen Zeitraum von 30 Sekunden aus der entsprechenden Femoralarterienkanüle abziehen. Um das Katheterpatent zu behalten, gießen Sie 100 Einheiten pro ml Heparin in isotonischer Saline nach jeder Blutentnahme in die Kanüle ein.Lassen Sie die Ratte für zwei Minuten erholen und messen Sie dann LDF und Blutdruck alle 30 Sekunden für zwei Minuten. Wiederholen Sie nach den Blutdruck- und LDF-Messungen alle zwei Minuten den Blutvolumenentzug, bis das Tier einen mittleren arteriellen Druck von ca. 20mmHg erreicht. In diesen repräsentativen Experimenten wurde der mittlere zerebrale Laserblutfluss von 10 Sprague-Dawley-Ratten, die mit Standardlabor-Chow gefüttert wurden, innerhalb von 20 % des Vorblutungswertes nach den ersten drei Blutvolumenentnahmen beibehalten, bis der mittlere arterielle Druck die untere Grenze der Autoregulation erreichte.Nachfolgende Blutvolumenentnahmen bei Drücken unterhalb der unteren Grenze der Autoregulation führten zu einer fortschreitenden Verringerung des zerebralen Laserdurchflusses, der zeigte, dass die zerebrale Zirkulation nicht mehr in der Lage war, ein ausreichendes Gehalt an Vasodilatation zu erzeugen, um den zerebralen Blutfluss konstant bei den niedrigeren Profusionsdrücken zu halten. Bei Drücken an oder über der unteren Grenze der Autoregulation gab es keine signifikante Korrelation zwischen dem zerebralen Laserblutfluss und dem arteriellen Druck, was darauf hindeutet, dass der zerebrale Laserdurchfluss unabhängig vom arteriellen Druck im Plateaubereich der autoregulierenden Kurve war. Unterhalb der unteren Grenze der Autoregulation hatte die laserzerebrale Blutfluss arterielle Druckbeziehung eine negative Neigung.Und der laserzerebrale Blutfluss war signifikant mit dem arteriellen Druck korreliert. Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, den Schädel sehr sorgfältig auszudünnen und sicherzustellen, dass die LDF-Sonde fest über dem gleichen Gewebebereich verankert bleibt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Reaktivität der Mikrozirkulation verschiedener Wirkstoffe nach retrograder Infusion über die Halsschlagader zu testen oder funktionelle Hyperämie und neurovaskuläre Kopplung in der zerebralen Zirkulation zu bewerten.Diese Technik hat die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Medikamente und Anästhetika auf die zerebrale Durchblutung und die Veränderungen der zerebralen Autoregulation in Krankheitsmodellen wie Bluthochdruck ermöglicht.

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Um die Regulierung des zerebralen Blutflusses in vivo zu untersuchen, sind traditionelle pharmakologische Methoden invasiv und schädigen oft den Schädel, die Dura und die Leptomeninge. In dieser Arbeit haben wir eine minimal-invasive Technik entwickelt, die die Nanoinjektor-gesteuerte intrazisternale Magna (ICM) Injektion mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung kombiniert, um die Integrität des Schädels und der Leptomeninge zu erhalten.

Gepaarter Cisterna Magna Nanoinjektions- und Laser-Speckle-Kontrastbildgebungs-Assay zur Untersuchung der Regulierung des zerebralen Blutflusses in vivo

Die intraluminale Mitte Zerebralarterie (MCAO) Modell ist die häufigste verwendete Modell unter experimentellen Schlaganfall-Modellen. Hier zeigen wir Ihnen das gesamte Modell im Detail mit der Führung des Laser-Doppler-Flussmessung und seine repräsentative Ergebnisse.

Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse

Mikroblasen-vermittelte fokussiertem Ultraschall Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine vielversprechende Technik zur nicht-invasiven gezielten Verabreichung von Medikamenten im...

MRI-geführten Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe der transkraniellen fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Erfahren Sie, wie Sie die zerebrale Blutfluss-Autoregulation bei Ratten mit Laser-Doppler-Flowmetrie bewerten. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des zerebralen Blutflusses unter verschiedenen Bedingungen.

Auswertung der zerebralen Blutfluss-Autoregulation in der Ratte mit Laser-Doppler-Flowmetrie

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