Name: Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Neutrophilen-Schwärmen in vitro mit Biopartikel-Mikroarrays. Diese Methode ermöglicht quantitative Bildgebung und den Zugang zu freigesetzten Zytokinen und Lipidmediatoren.

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Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering und des Comprehensive Cancer Center an der Ohio State University unterstützt. Die in diesem Bericht vorgestellten Daten stammen aus Bildern, die mit Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) verarbeitet wurden, die auf der Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University, verfügbar sind. Diese Einrichtung wird zum Teil durch das Stipendium P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD, unterstützt.

Die Autoren würdigen die gesunden Freiwilligen, die freundlicherweise ihr Blut gespendet haben. Blutproben wurden nach informierter freiwilliger Zustimmung gemäß dem Protokoll des Institutional Review Board (IRB) #2018H0268 vom Biomedical Sciences Committee der Ohio State University überprüft.
1. Mikrofertigung von Biopartikel-Mikroarray
<ol><li>Erzeugen Sie mit Standard-Photolithographie-Verfahren den Master-Siliziumwafer.<ol>
<li>Generieren Sie einen Nachweis des gewünschten Designs mit einer CAD-Software (Computer-Aided Design), und senden Sie ihn dann an einen Fotomaskenhersteller, um eine Chrom-Fotomaske herzustellen. Hier wird 4 mm x 4 mm rechteckige Arrays mit einem Durchmesser von 30 mm in Kreisen mit einem Abstand von 150 m in der Mitte verwendet. Dieses Design kann für verschiedene Anwendungen nach Belieben geändert werden.</li>
		<li>Verfeinern Sie eine 40 m dicke Schicht eines negativen Photoresists auf einen Siliziumwafer. Wafer bei 65 °C für 5 min und 95 °C für 10 min backen.</li>
		<li>Stellen Sie den Wafer durch eine Chrom-Fotomaske mit 150–160 mJ/cm2 (Abbildung 1A) UV-Licht aus .</li>
		<li>Waffeln bei 65 °C für 5 min und 95 °C für 10 min backen. Wafer im Photoresist-Entwickler für 10 min untertauchen und mit Isopropylalkohol abspülen. In diesem Stadium sollte das Muster auf dem Wafer sichtbar sein (Abbildung 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Ein 10:1-Verhältnis von Polydimethylsiloxan-Prepolymer und dessen Härtungsmittel (d.h. 20 g Prepolymer und 2 g Aushärtungsmittel) gründlich mischen und das ungehärtete Polydimethylsiloxan -Gemisch (PDMS) über den Masterwafer in eine Petrischale gießen (Abbildung 1C).</li>
	<li>Vakuum behandeln Sie das ungehärtete PDMS-Gemisch, bis keine Luftblasen über dem Master-Wafer vorhanden sind. Bei 65 °C über Nacht aushärten.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Skalpell, um das Äußere des gemusterten Teils des Wafers zu schneiden, und entfernen Sie langsam die ausgehärtete PDMS-Platte. Legen Sie die PDMS-Platte auf ein sauberes Schneidebrett mit der gemusterten Seite nach oben (Abbildung 1D).</li>
	<li>Stempel aus der PDMS-Platte mit einem 8 mm Biopsie-Stempel ausstechen (Abbildung 1E). Für eine Glasrutsche werden acht Stempel benötigt.</li>
	<li>Legen Sie jeden Stempel mit dem Gesicht nach unten auf das Klebeband, um Schmutz zu entfernen.</li>
	<li>Bereiten Sie im Voraus eine 1,6 mg/ml-Lösung von CP in Wasser vor.<ol>
<li>Fügen Sie die richtige Menge des CP-Pulvers zu Wasser hinzu (z. B. 0,8 g bis 500 ml).</li>
		<li>Mischen Sie auf einer Rührplatte bei Raumtemperatur über Nacht, oder bis der gesamte Feststoff in das Wasser gelöst ist. Die CP-Lösung kann 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
		<li>Auf Wunsch die CP-Lösung fluoreszierend machen, indem Sie Poly-L-Lysin hinzufügen, das mit Fluoresceinisothiocyanat (PLL-FITC) gekennzeichnet ist.<ol>
<li>Aliquot ca. 10 ml der CP-Lösung. Fügen Sie dem Aliquoted-Volumen eine kleine Menge PLL-FITC (0,05 mg) hinzu. Die Menge kann geändert werden, um die Helligkeit der Fluoreszenz wie gewünscht anzupassen.</li>
			<li>Vortex die CP-Lösung mit FITC für 20 s beschriftet, oder bis die Lösung eine einheitliche, blassgelbe Farbe ist. Vor Licht schützen und bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Mit den Stempeln nach oben, Grund jeder Stempel mit 100 l von 1,6 mg/ml Lösung von CP, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen der CP-Lösung und dem Stempel bilden (Abbildung 1F).</li>
	<li>Invertdiee der Stempel auf eine Schicht der CP-Lösung (Abbildung 1G).</li>
	<li>Entfernen Sie die Stempel aus der CP-Lösung nach 1 h.</li>
	<li>Dab jeder nasse Stempel nach unten auf eine saubere Glasrutsche 6–8x, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.</li>
	<li>Vakuum behandeln Sie die Briefmarken für 1-2 min.</li>
	<li>Befestigen Sie einen acht Bohrer mit einem Durchmesser von 9 mm auf der Oberseite eines sauberen Glasschlittens als Leitfaden für die Stempelplatzierung. Mit diesem Abstandser kann jeder Glasschlitten acht Mikroarrays haben.</li>
	<li>Platzieren Sie einen Stempel mit dem Gesicht nach unten auf der Glasrutsche in der Mitte jeder Bohrung des Bildraums (d. h. verwenden Sie insgesamt acht Stempel).</li>
	<li>Legen Sie ein ausgewogenes Gewicht von 5,6 x 0,1 g auf jeden Stempel und lassen Sie 10 min zum Stanzen zu (Abbildung 1H). Ein ausgewogenes Gewicht ist erforderlich, um sicherzustellen, dass der Stempel gleichmäßig auf die Glasrutsche gedrückt wird und eine gleichmäßige Übertragung des CP auf die Glasrutsche gefördert wird.</li>
	<li>Entfernen Sie die Gewichte und Stempel von der Glasrutsche (Abbildung 1I). Lassen Sie die CP-Schicht bei Raumtemperatur für 24 h trocknen, bevor Sie die Biopartikel hinzufügen, wie in Schritt 1.17 beschrieben. Wenn der CP mit FITC markiert ist, kann die Wirksamkeit der Stanzung an dieser Stelle mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 488 nm überprüft werden, bevor sie mit Schritt 1.17 fortfährt (Abbildung 1M).</li>
	<li>Schneiden Sie eine leere PDMS-Platte auf die Größe des bildgebenden Abstandsraums und verwenden Sie den 8 mm Biopsie-Punch, um Brunnen im PDMS zu erstellen, die sich an den Bohrungen eines bildgebenden Abstandsraums ausrichten. Mit dem Bildabstand(Abbildung 1J) kleben Sie die PDMS-Platte am Glasschlitten an .</li>
	<li>Eine Lösung aus Biopartikeln (z.B. E. coli oder Zymosan) auftauen und in Wasser zur Injektion (WFI) auf 500 g/ml verdünnen. HINWEIS: Die Biopartikel müssen nicht opsonisiert werden. Neutrophile Oberflächenrezeptoren erkennen Moleküle auf diesen Biopartikeln direkt19,20,21.</li>
	<li>Fügen Sie jedem PDMS-Brunnen auf dem Glasschlitten 100 l Biopartikellösung hinzu (Abbildung 1K).</li>
	<li>Schaukeln Sie die Glasrutsche für 30 min.</li>
	<li>Spülen Sie die Brunnen gründlich mit Wasser. Das Biopartikel-Mikroarray kann bis zu 3 Monate in einer staubfreien Umgebung bei 4 °C gelagert werden. An dieser Stelle sollte das Muster mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 594 nm überprüft werden, bevor mit Schritt 2.1 (Abbildung 1N) fortfährt.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie mindestens 2 ml frisches Blut in K2-EDTA-Röhrchen vom gewünschten Spender. Die erwartete Ausbeute von Neutrophilen beträgt 1–2 x 106 Zellen/1 ml Vollblut. Der bildgebende Assay benötigt etwa 1,5 x 105 Neutrophile, und die Analyse des Überstandes erfordert 1 x 106 Neutrophile. Verwenden Sie das Blut innerhalb von 4 h.</li>
	<li>Trennen Sie rote Blutkörperchen (RBCs) durch Zugabe eines Erythrozyten-Aggregationsmittels im Verhältnis 1:5 zum Vollblut. Warten Sie 45 min auf eine transluzente Schicht (Buffy Coat), um sich von der Schicht der RBCs zu trennen.</li>
	<li>Entfernen Sie das buffy Mantel und waschen Sie mit Phosphat gepufferte Saline (PBS) mit 1 ml Buffy-Mantel: 9 ml PBS.</li>
	<li>Zentrifuge für 5 min bei 190 x g und 20 °C.</li>
	<li>Den Überstand ansaugen und das Pellet bei 5 x 107 Zellen/ml wieder aufhängen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein negatives immunmagnetisches Selektionskit, um Neutrophile zu isolieren.<ol>
<li>Fügen Sie 50 l Antikörpercocktail/1 ml Zellsuspension hinzu. Warten Sie 10 min.</li>
		<li>Fügen Sie 100 l magnetische Perlen/1 ml Zellsuspension hinzu. Warten Sie 10 min.</li>
		<li>Fügen Sie eine Zellsuspension zu einem rund-untere Rohr hinzu und legen Sie sie in einen zylindrischen Magneten. Warten Sie 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überstand in ein Zentrifugenrohr gießen. Addieren Sie bis zu 10 ml PBS. Zentrifuge für 5 min bei 190 x g und 20 °C.</li>
	<li>Aspirat Überstand. Resuspend weißes Pellet in IMDM mit 0,4% humanem Serumalbumin.</li>
	<li>Fleckenkerne mit 20 g/ml Hoechst 33342 für 10 min bei 37 °C.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml IMDM mit 0,4% humanem Serumalbumin hinzu, um zu spülen. Zentrifuge für 5 min bei 190 x g und 20 °C.</li>
	<li>Resuspend Zellen bei 7,5 x 105 Zellen/ml in IMDM mit 0,4% menschlichem Serumalbumin.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l der Zellsuspension in einen PDMS-Brunnen ein, das ein Biopartikel-Mikroarray enthält. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension über dem PDMS-Brunnen konvex ist und keine Blasen enthält.</li>
	<li>Dichtung mit einem Abdeckschlupf von 12 mm Durchmesser. Bedecken Sie die Öffnung des PDMS-Brunnens mit einem Abdeckschlupf von 12 mm Durchmesser. Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf den Deckelschlupf, damit die überschüssige Zellsuspension an den Rand des Brunnens entweicht. Verwenden Sie ein Gewebe, um die überschüssige Zellsuspension zu entfernen.</li>
</ol>3. Ausführen der Assay- und Bildanalyse
<ol><li>Laden Sie das Mikropartikelarray mit Zellen auf der Live-Zell-Bildgebungsstation mit einem Mikroskop, das mit einem Käfig-Inkubator ausgestattet ist, der auf 37 °C, 5 %CO2und 90 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.</li>
	<li>Verwenden Sie Zeitraffer-Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopie, um Bilder mit 10-facher Vergrößerung alle 10 s bei 405 nm, 594 nm und hellfeldaufstellen zu lassen. In einem typischen Experiment werden Bilder bis zu 2 h gesammelt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine automatisierte Zellverfolgungssoftware, um die Migration einzelner Neutrophilen in den Biopartikelcluster zu verfolgen.<ol>
<li>Verwenden Sie den Autoregressionsmodus einer Spot-Erkennungs-Zellverfolgungssoftware. Stellen Sie den Spotradius auf 5 m (die ungefähre Größe eines neutrophilen Kerns) ein. Legen Sie die minimale Spurlänge auf 120 s und eine maximale Spaltgröße von einem Frame fest.</li>
		<li>Extrahieren Sie aus den von der Zellverfolgungssoftware generierten Daten die Dateien, die die Position und Geschwindigkeit der Neutrophilen enthalten. Diese Dateien können mit einer Graphik-Software verwendet werden, um Neutrophilen-Migrationsspuren zu generieren (Abbildung 2C) und eine Heatmap von Geschwindigkeit vs. Zeit (Abbildung 2D), bzw. .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie die 405 nm fluoreszierenden Bilder, um die Schwarmgröße im Laufe der Zeit auf einer Bildanalysesoftware Ihrer Wahl zu verfolgen.<ol>
<li>Definieren Sie Regionen von Interesse (ROIs) um jeden Biopartikelhaufen, in dem Neutrophile schwärmen. Halten Sie den ROI in der gleichen Größe, um jeden Biopartikelcluster zu analysieren.</li>
		<li>Analysieren Sie die mittlere fluoreszierende Intensität der 405 nm-Bilder innerhalb jedes ROI im Laufe der Zeit.</li>
		<li>Generieren Sie eine Kalibrierkurve von mittlerer Fluoreszenzintensität bis zur Schwarmgröße, indem Sie manuelle Messungen in verschiedenen Schwarmgrößen von 0 bis2 bis zur maximalen Schwarmgröße durchführen. Verwenden Sie diese Kalibrierung, um die Schwarmgröße im Zeitverlauf zu berechnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Supernatant-Sammlung und Proteinnachweis
<ol><li>Inkubieren Sie die Neutrophilen in den Brunnen, die das Biopartikel-Mikroarray bei 37 °C und 5%CO2 für 3 h enthalten. Nehmen Sie Proben zu den gewünschten Zeitpunkten. In der Regel werden die Proben bei 0, 0,5, 1 und 3 h entnommen. Um die Nachweisgrenze des Protein-Array-Assays zu überwinden, wurde für jeden Zeitpunkt das gesamte Überstandvolumen eines einzelnen Brunnens (200 l) verwendet. Jeder Zeitpunkt wurde in dreifacher Ausfertigung analysiert.</li>
	<li>Überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, ob sich Schwärme auf dem Mikroarray bilden.</li>
	<li>Den Überstand mit einer 200-L-Pipette ansaugen und in ein 0,45-mm-Zentrifugenfilterrohr eintragen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 190 x g und 20 °C für 5 min und sammeln Sie das filtrierte Volumen.</li>
	<li>Proben bei -80 °C bis zur Bearbeitungszeit lagern.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Microarray-Kit, das eine Reihe menschlicher Proteine erkennt, um Proben zu verarbeiten.<ol>
<li>Fügen Sie 200 l jeder Probe in ein separates Dialyserohr, das mit dem Kit geliefert wird, hinzu.</li>
		<li>Die Dialyseröhrchen in ein Becherglas mit mindestens 500 ml PBS (pH = 8,0) legen. Auf einer Rührplatte mindestens 3 h bei 4 °C vorsichtig umrühren. Ändern Sie die PBS im Becher, und wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
		<li>Jede Probe in ein sauberes Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 9.000 x g für 5 min geben, um eventuelle Ausscheidungen zu entfernen. Übertragen Sie jeden Überstand auf ein sauberes Rohr.</li>
		<li>Biotinylat ieren Sie jede Probe, indem Sie 36 l 1x Etikettierungsreagenz aus dem Kit pro 1 mg Gesamtprotein in der dialysierten Probe zu 180 l Dialyseprobe hinzufügen. Bei 20 °C für 30 min inkubieren. Alle 5 min sanft mischen.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Probenrohr 3 L Stop-Lösung mit dem Kit hinzu. Jede Probe in ein frisches Dialyserohr geben und die Schritte 4.6.2–4.6.3 wiederholen. In diesem Stadium kann die Probe bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden, bis Sie bereit sind, fortzufahren.</li>
		<li>Die mit gelieferte Glasrutsche wird bei -20 °C gelagert. Lassen Sie es auf Raumtemperatur kommen. Legen Sie die montierte Glasrutsche für 1-2 h bei Raumtemperatur in eine laminare Durchflusshaube.</li>
		<li>Fügen Sie 400 L des mit dem Kit gelieferten Sperrpuffers in jeden Brunnen des montierten Glasschlittens ein. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Proben für 5 min bei 9.000 x g, um Ausscheidungen oder Partikel zu entfernen. 5x mit Sperrpuffer verdünnen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Blockierungspuffer aus jedem Brunnen. Fügen Sie 400 l der verdünnten Proben in die entsprechenden Bohrungen ein. 2 h bei Raumtemperatur beim Schaukeln inkubieren.</li>
		<li>Dekantdien Sie die Proben von jedem Brunnen. Waschen Sie 3x mit 800 l des 1x Waschpuffers, den ich beim Schaukeln bei Raumtemperatur für jeweils 5 min mit dem Kit zur Verfügung gestellt habe.</li>
		<li>In einem sauberen Behälter die montierte Glasrutsche in 1x Waschpuffer I untertauchen. 2x bei Raumtemperatur für jeweils 5 min beim Schaukeln waschen.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Unterarray 400 L 1x Cy3-konjugiertes Streptavidin hinzu. Abdeckung mit Kunststoff-Klebestreifen. Schützen Sie sich für den Rest des Protokolls vor Licht.</li>
		<li>2 h bei Raumtemperatur beim Schaukeln inkubieren.</li>
		<li>Dekantieren Sie die Lösung und zerlegen Sie die Glasrutsche aus den Probenkammern.</li>
		<li>In dem 30 ml Zentrifugenrohr, das mit dem Kit geliefert wird, fügen Sie vorsichtig den Glasschlitten und genügend 1x Waschpuffer I hinzu, um die Glasrutsche abzudecken. Waschen Sie 3x für jeweils 10 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln.</li>
		<li>Im 30 ml Zentrifugenrohr 2x mit 1x Waschpuffer II für je 5 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln waschen.</li>
		<li>Waschen Sie die Glasrutsche mit 30 ml ddH2O für 5 min. Entfernen Sie die Glasrutsche aus dem Zentrifugenrohr und lassen Sie 20 min in einer laminaren Durchflusshaube trocknen. Der vorbereitete Glasschlitten kann bei -20 °C gelagert werden, bis es zum Scannen bereit ist.</li>
		<li>Scannen Sie das Glasschlitten mit einem Mikroarray-Scanner bei einer Fluoreszenzemission von 555 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li>
<li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li>
<li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Gout%3A+Observations+over+a+Half-Century%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li>
<li>Reátegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li>
<li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li>
<li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li>
<li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Bench%3A+Neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li>
<li>Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair%3A+going+forward+in+reverse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+Arraying+neutrophils+in+swarms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li>
<li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li>
<li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Cancer%3A+Two+Sides+of+the+Same+Coin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+Key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li>
<li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+of+Fungal+Infections%22%5BJournal%5D)">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li>
<li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li>
<li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li>
<li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+inflammation%3A+intercellular+signal+relay+and+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li>
<li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li>
<li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li>
<li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li>
<li>Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3%3A+An+open-ended+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li>
<li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Wir entwickelten eine Mikrostamping-Plattform, um einheitliche Arrays von Biopartikeln zu erzeugen, um den in vitro neutrophilen Schwärmen zu stimulieren. Die In-vitro-Natur unserer Plattform ermöglicht es uns, die Komplikationen zu umgehen, die mit In-vivo-Schwärmeexperimenten entstehen, nämlich die schlechte Fähigkeit, Mediatoren zu analysieren, die von schwärmenden Neutrophilen freigesetzt werden5. Darüber hinaus werden In-vivo-Modelle in der Regel bei Nagetieren11,...

Neutrophile, die am häufigsten vorkommende weiße Blutkörperchen im Blut1, gewinnen Aufmerksamkeit als potenzielle diagnostische und therapeutische Ziele2,3, weil sie in einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt sein können, einschließlich Gicht4, Sepsis3, Trauma5,6, Krebs 1,7,8, und verschiedene Autoimmunerkrankungen5,9. Neutrophiles Schwärmen ist ein mehrstufiger, streng regulierter Prozess mit einer Komplexität, die ihn zu einem besonders interessanten Schwerpunkt der Studie5,10,11macht. Während des Schwärmens isolieren Neutrophilen eine Entzündungsstelle aus dem umgebenden gesunden Gewebe5,10,11. Richtige Regulierung der neutrophilen Schwärmeist ist wichtig, um die Wundheilung und letztlich Entzündungsauflösung5,12zu fördern. Neutrophile Schwärmen wurde in erster Linie in vivo bei Nagetier12,13,14,15 und Zebrafisch10,11,12,15 Modelle untersucht. Die Art dieser in vivo Tiermodelle führt jedoch zu Einschränkungen5. Zum Beispiel sind die Von Neutrophilen während des Schwärmens freigesetzten Mediatoren für die Analyse5nicht leicht zugänglich. Darüber hinaus gibt es viele potenzielle Quellen für einen bestimmten Mediator in vivo, so dass ein In-vivo-Experiment einen genetischen Mangel einführen muss, um die zelluläre Produktion und/oder Interaktion zu hemmen, um die Rolle dieses Mediators in einem bestimmten Prozess zu untersuchen13. Ein In-vitro-Experiment umgeht diese Komplikation, indem es eine neutrophile Beobachtung ohne den Kontext zusätzlicher Zellen ermöglicht. Zusätzlich ist die Forschung zur Beschreibung der koordinierten Migration durch menschliche neutrophile begrenzt16. Auf einer In-vitro-Schwärmeplattform können menschliche Neutrophile direkt analysiert werden. Eine In-vitro-Schwärmeplattform könnte das Wissen aus In-vivo-Studien erweitern, indem sie Möglichkeiten bietet, die Lücken zu schließen, die die Grenzen von In-vivo-Studien hinterlassen haben.
Um der Notwendigkeit einer In-vitro-Plattform gerecht zu werden, die in vivo neutrophilen Schwärmen imitiert, haben wir eine Mikrostamping-Plattform entwickelt, die es uns ermöglicht, Biopartikel-Mikroarrays zu mustern, die das Neutrophilschwärmen in einer räumlich kontrollierten Weise stimulieren. Wir erzeugen Biopartikel-Mikroarrays auf Glasrutschen in einem zweistufigen Prozess. Zunächst verwenden wir Mikrostamping, um ein Mikroarray von kationischen Polyelektrolyten (CP)-Spots zu erzeugen. Zweitens fügen wir eine Lösung von Biopartikeln hinzu, die über eine elektrostatische Interaktion an den CP-Spots haften. Durch das erste Mustern der CP-Schicht können wir negativ geladene Biopartikel selektiv mustern, um das gewünschte neutrophile Schwarmmuster zu erzeugen. Die positiv geladene Schicht hält die negativ geladenen Biopartikel durch den kräftigen Waschschritt, der die Biopartikel aus den Bereichen auf dem Glasschlitten entfernt, die nicht über den CP verfügen. Zusätzlich ist der hier verwendete CP, ein Copolymer aus Acrylamid und quaternisiertem kationischen Monomer, biokompatibel, so dass es keine Reaktion der Neutrophilen induziert. Es hat eine sehr hohe Oberflächenladung, die die mikrongroßen Biopartikel zum Glasschlitten immobilisiert und so Neutrophilen daran hindert, die Partikel aus der gemusterten Position auf dem Glasschlitten zu entfernen. Dies führt zu Biopartikel-Clustern, die in einem Mikroarray angeordnet sind. Als wir dem Mikroarray Neutrophilen hinzufügten, bildeten sie stabile Schwärme um die Biopartikelhaufen. Durch die Verfolgung der Neutrophilenmigration fanden wir heraus, dass schwärmende Neutrophilen aktiv in richtungsumhergehende Biopartikel-Cluster. Darüber hinaus nutzten wir diese Plattform, um bestimmte Mediatoren zu analysieren, die Neutrophile während des Schwärmens freisetzen. Wir fanden 16 Mediatoren, die während des Schwärmens unterschiedlich ausgedrückt werden. Ihre Konzentrationen folgen drei allgemeinen Trends im Laufe der Zeit: Anstieg, Abnahme oder Spitze. Unsere in vitro neutrophile Schwärmeungsplattform erleichtert die Analyse des räumlich gesteuerten menschlichen Neutrophilenschwärmens sowie die Sammlung und Analyse von Mediatoren, die durch neutrophilesches Schwärmen freigesetzt werden. In einer früheren Publikation haben wir gezeigt, dass Patienten mit bestimmten Erkrankungen (Trauma, Autoimmunerkrankung und Sepsis) Neutrophile hatten, die anders funktionierten als Patienten von gesunden Spendern5. In zukünftigen Forschungsstudien könnte unsere Plattform verwendet werden, um die Neutrophilenfunktion bei einer Vielzahl von Patientenpopulationen zu analysieren. Diese Plattform kann die komplexe Koordination des Neutrophilenschwärmens quantitativ analysieren. Zusätzliche Studien können durchgeführt werden, um Einblicke in die Neutrophilenfunktion einer bestimmten Patientenpopulation oder neutrophilen Reaktionen auf einen Krankheitserreger von Interesse zu geben.

<table><tbody><tr><td>"The Big Easy" EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18001</td><td>Magnet zur Verwendung mit dem Neutrophilen-Isolationskit</td></tr><tr><td>Cell Incubator</td><td>Okolab</td><td>777057437 / 77057343</td><td>Okolab Cage Incubator zur Temperatur- und CO2-Kontrolle</td></tr><tr><td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17957</td><td>Kit für die immunomagnetische Negativselektion von humanen Neutrophilen</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA54010 / MEF55037</td><td>Inverses Forschungsmikroskop</td></tr><tr><td>Escherichia coli (K-12 Stamm) BioParticles Texas Rotes Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Biopartikelpulver, vor Zugabe zum Zetag&reg-Array in Wasser auflösen</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 8-mm-Biopsie-Stanze</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z708925</td><td>Zum Schneiden von PDMS-Stempeln</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7906</td><td>Erythrozytenaggregationsmittel zur Trennung von Buffy Coat und roten Blutkörperchen in frischem menschlichem Blut</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Nucleus Fluoreszenzfärbung</td></tr><tr><td>Human L1000 Array</td><td>Raybiotech Inc.</td><td>AAH-BLG-1000-4</td><td>Array mit hoher Dichte zum Nachweis von 1000 menschlichen Proteinen</td></tr><tr><td>Humanes Serumalbumin (HSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5843</td><td>Niedriges Endotoxin HSA, zur Herstellung von 2%igen Lösungen in IMDM für isolierte Neutrophile</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td>Zur Resuspendierung isolierter Neutrophilen</td></tr><tr><td>K2-EDTA-Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-657-32</td><td>Röhrchen für die Blutentnahme</td></tr><tr><td>Low Reflective Chrome Photomask</td><td>Front Range Photomask</td><td>N/A</td><td>Abmessungen 5" x 5" x 0,09" (L x B x T)</td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td>ASCNGX00</td><td>Fluoreszenz-Reader für proteingemusterte Mikrodomänen</td></tr><tr><td>Mikroskopie Image Analsysis Software - Imaris</td><td>Bitplane</td><td>9.3.0</td><td>Software für die automatische Zellverfolgungsanalyse</td></tr><tr><td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td>Software für die automatische Bildgebung lebender Zellen und die Berechnung der Schwarmgröße</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Fluorescein-Isothiocyanat (PLL-FITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3069-10MG</td><td>30.000 - 70.000 MW PLL, markiert mit FITC, zur fluoreszierenden Markierung von CP-Lösung</td></tr><tr><td>SecureSeal 8-Well-Imaging-Spacer Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>654008</td><td>8 Wells, selbstklebender Abstandshalter für die Bildgebung mit einem Durchmesser von 9 mm</td></tr><tr><td>Silizium Wafer</td><td>University Wafer</td><td>590</td><td>Silizium 100 mm N/P (100) 0- 100 Ohm-cm 500 &mu; m SSP-Test</td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Laurell</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td>Wird zum Spinncoaten einer 40-&micro; m Schicht aus Fotolack auf Siliziumwafer</td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td>2025</td><td>Negativer Fotolack zur Herstellung von Silizium-Master-Wafer</td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Photoresist-Entwickler. Entfernen Sie das unvernetzte SU-8 2025 vom Siliziumwafer</td></tr><tr><td>Sylgard 184 (Polydimethylsiloxan, PDMS)</td><td>Dow</td><td>1673921</td><td>2-teiliges Silikonelastomer-Kit zur Herstellung von Mikrostempeln und PDMS-Wells</td></tr><tr><td>UV-Expositionsmaskierungssystem</td><td>Klo&eacute;</td><td>UV-KUB 2</td><td>Wird verwendet, um Fotolack auf Siliziumwafern durch Chrommaske mit UV-Licht</td></tr><tr><td>zu vernetzen Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1287303</td><td>Hochwertiges Wasser zur Verdünnung von Biopartikeln</td></tr><tr><td>Zetag 8185</td><td>BASF</td><td>8185</td><td>Kationischer Polyelektrolyt (CP), Pulver, Copolymer aus Acrylamid und quaternisiertem kationischem Monomer, bildet in Wasser</td></tr> <tr><td>aufgelöst eine "Einfärbelösung" für das MikroprägenZymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Rotes Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>Biopartikel Pulver, vor Zugabe zum Zetag-Array in Wasser auflösen</td></tr></tbody></table>

biopartikel-mikroarrays für chemotaktische und molekulare analysen des menschlichen neutrophilen-schwärmens in vitro

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

NeutrophileSchwärme ist ein kooperatives Verfahren, durch das Neutrophile eine Infektionsstelle abdichten und die Gewebereorganisation fördern. Swarming wurde klassischerweise in vivo in Tiermodellen untersucht, die charakteristische Muster der Zellmigration zeigen. In-vivo-Modelle weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, darunter interzelluläre Mediatoren, die schwer zugänglich sind und analysiert werden können, sowie die Unfähigkeit, menschliche Neutrophile direkt zu analysieren. Aufgrund dieser Einschränkungen ist eine In-vitro-Plattform erforderlich, die das Schwärmen mit menschlichen Neutrophilen untersucht und einen einfachen Zugang zu den molekularen Signalen bietet, die während des Schwärmens erzeugt werden. Hier wird ein mehrstufiger Mikrostamping-Prozess verwendet, um ein Biopartikel-Mikroarray zu erzeugen, das das Schwärmen stimuliert, indem es eine In-vivo-Infektion imitiert. Das Biopartikel-Mikroarray induziert Neutrophile, um kontrolliert und stabil zu schwärmen. Auf dem Mikroarray erhöhen Neutrophile die Geschwindigkeit und bilden stabile Schwärme um Biopartikelhaufen. Zusätzlich wurde überstand, überstanden von den Neutrophilen analysiert und 16 Proteine wurden entdeckt, dass sie im Laufe des Schwärmens differenziell exprimiert wurden. Diese In-vitro-Schwärmeplattform ermöglicht die direkte Analyse der Neutrophilenmigration und Proteinfreisetzung auf reproduzierbare, räumlich kontrollierte Weise.

Wenn Neutrophilen dem Biopartikel-Mikroarray zugesetzt werden, werden Neutrophile, die die Biopartikel-Cluster kontaktieren, aktiviert und initiieren die Schwarmreaktion. Das Biopartikel-Mikroarray wurde mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie validiert, um die Neutrophilenmigration zu den Biopartikelclustern zu verfolgen (Video S1). Die Migration einzelner neutrophiler Kerne wird verfolgt, während sie in Richtung des Biopartikelclusters wandern. Wenn Neutrophile den Biopartikelhaufen erreichen, übersc...

Dieses Protokoll erzeugt Biopartikel-Mikroarrays, die räumlich gesteuerte Neutrophilenschwärme nerieren. Es bietet einfachen Zugriff auf die Mediatoren, die Neutrophile während der Migration freisetzen, und ermöglicht quantitative Bildgebungsanalysen.

Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es eine In-vitro-Analyse des neutrophilen Schwärmens ermöglicht, die viele Einschränkungen unserer gegenwärtigen Unfähigkeit zu experimentieren überwindet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen einfachen Zugang zu den sezernierten Zytokinen und Lipidmediatoren bietet, die Neutrophile während des Schwarms freisetzen, und eine quantitative Bildgebungsanalyse ermöglicht. Während wir diese Technik auf Neutrophile angewendet haben, könnte sie erweitert werden, um die Migration anderer weißer Blutkörperchen wie Monozyten und T-Zellen zu analysieren.Beginnen Sie mit der Zubereitung eines 1,6 Milligramm pro Milliliter kationisches Polyelektrothit, oder CP-Lösung, indem Sie die richtige Menge an CP-Pulver zu Wasser hinzufügen und es über Nacht auf der Rührplatte mischen oder bis alle Feststoffe gelöst sind. Auf Wunsch kann die Lösung fluoreszierend gemacht werden, indem Poly-L-Lysin mit FITC beschriftet hinzugefügt wird. Generieren Sie den Master-Siliziumwafer mit Standard-Photolithographie-Verfahren.Das hier verwendete Design ist ein vier mal vier Milliliter rechteckiges Array mit 30 Mikrometer Durchmesser gefüllten Kreisen, mit einem 150 Mikrometer Zentrum zu Mitte Abstand, aber es kann wie gewünscht für verschiedene Anwendungen geändert werden. Verschichten Sie eine 40 Mikrometer dicke Schicht mit negativem Photowiderstand auf einen Siliziumwafer. Dann backen Sie den Wafer bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.Und 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Setzen Sie den Wafer durch eine Chrom-Fotomaske mit 150 bis 160 Millijoule pro Zentimeter quadratisch UV-Licht aus. Backen Sie den Wafer wieder bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten und 95 Grad Celsius für 10 Minuten.Dann tauchen Sie es in photoresist Entwickler für 10 Minuten. Und spülen Sie es mit Isopropylalkohol. Das Muster sollte nun auf dem Wafer sichtbar sein.Als nächstes ein Verhältnis von Polydimethylsiloxan oder PDMS, Prepolymer und seinem Härtungsmittel, gründlich mischen. Und gießen Sie die ungehärtete Mischung über den Master-Wafer in eine Petrischale. Vakuum behandeln sie das ungehärtete PDMS-Gemisch, bis keine Luftblasen vorhanden sind.Dann heilen Sie es über Nacht bei 65 Grad Celsius. Verwenden Sie am nächsten Tag ein Skalpell, um das Äußere des gemusterten Teils des Wafers zu schneiden. Und entfernen Sie langsam die ausgehärtete PDMS-Platte und legen Sie sie auf ein sauberes Schneidebrett mit der gemusterten Seite nach oben.Stempeln Sie einzelne Stempel aus der PDMS-Platte mit einem acht Millimeter großen Biopsie-Punch aus und legen Sie jeden Stempel verdeckt auf das Klebeband, um Schmutz zu entfernen. Wenn diese Stempel nach oben gerichtet sind, grundiert jeder Stempel mit 100 Mikrolitern der vorgefertigten CP-Lösung, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen zwischen der Lösung und der Marke bilden. Dann die Stempel auf eine Schicht von CP-Lösung umkehren und nach einer Stunde entfernen.Dab jeder nasse Stempel nach unten auf eine saubere Glasrutsche sechs bis acht Mal, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Dann Vakuum behandeln die Briefmarken für ein bis zwei Minuten. Befestigen Sie einen acht Bohrer mit einem Durchmesser von acht Millimetern auf einem sauberen Glasschlitten als Leitfaden für die Stempelplatzierung.Platzieren Sie einen Stempel mit dem Gesicht nach unten auf der Glasrutsche in der Mitte jeder Bohrung des Bildraums. Legen Sie dann ein 5,6 Gramm ausgewogenes Gewicht auf jeden Stempel und lassen Sie 10 Minuten für das Stanzen. Entfernen Sie die Gewichte und die Stempel vom Schlitten und lassen Sie die CP-Schicht bei Raumtemperatur 24 Stunden trocknen, bevor Sie Biopartikel hinzufügen.Wenn der CP mit FITC markiert ist, überprüfen Sie die Wirksamkeit der Stanzung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Schneiden Sie eine leere PDMS-Platte auf die Größe des bildgebenden Abstandsraums und verwenden Sie den acht Millimeter großen Biopsie-Punch, um Brunnen im PDMS zu erstellen, die sich an den Brunnen des Abstandsraums ausrichten. Dann die PDMS-Platte an der Glasrutsche kleben.Eine Lösung von Biopartikeln auftauen und auf 500 Mikrogramm pro Milliliter Wasser zur Injektion verdünnen. Fügen Sie 100 Mikroliter Biopartikellösung zu jedem PDMS-Brunnen auf der Glasrutsche hinzu und schaukeln Sie die Rutsche für 30 Minuten. Spülen Sie die Brunnen gründlich mit Wasser und überprüfen Sie das Muster auf dem Dia mit einem Fluoreszenzmikroskop.Das Biopartikel-Mikroarray kann bis zu drei Monate in einer staubfreien Umgebung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie die Zellen vor, indem Sie sie bei 7,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in IMDM mit 0,4% menschlichem Serumalbumen wieder aufsetzen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Suspension in einen PDMS-Brunnen, der das Biopartikel-Mikroarray enthält, und stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension über der Oberseite des PDMS-Guts konvex ist und keine Blasen enthält.Versiegeln Sie den Brunnen mit einem Deckelschlupf von 12 Millimetern und drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, so dass die überschüssige Zellsuspension an den Rand des Brunnens entweicht, und verwenden Sie dann ein Gewebe, um den Überschuss zu entfernen. Um die Zellen abzubilden, laden Sie das Mikropartikelarray mit Zellen auf die Live-Zell-Bildgebungsstation eines Mikroskops, das mit einem Käfig-Inkubator ausgestattet ist, der auf 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 90 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Verwenden Sie Zeitraffer-, Fluoreszenz- und Lichtfeldmikroskopie, um Bilder mit 10-facher Vergrößerung alle 10 Sekunden bei 405 Nanometern, 594 Nanometern und hellem Feld aufzuzeichnen.Die Neutrophilen in den Brunnen mit Biopartikeln bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Stunden inkubieren und Proben zu den gewünschten Zeitpunkten entnehmen. Verwenden Sie ein Hellfeldmikroskop, um zu überprüfen, ob Schwärme auf dem Mikroarray gebildet werden. Sammeln Sie das gesamte Volumen des Überstandes eines einzelnen Brunnens, und laden Sie es in ein 0,45 Mikrometer Zentrifuge-Filterrohr, um sicherzustellen, dass jeder Zeitpunkt in Dreifache zu analysieren.Zentrifugieren Sie die Rohre bei 190 mal G und 20 Grad Celsius für fünf Minuten, und sammeln Sie das gefilterte Volumen. Dann lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius bis zur Bearbeitungszeit. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, arbeiten Sie mit photoresist und Entwickler in der Rauchhaube.Haben Sie ein von iRB genehmigtes Protokoll, bevor Sie Blut von menschlichen Spendern entnehmen. Denken Sie daran, dass Materialien aus menschlichem Blut stammen BSL2 sind. Wenn Neutrophilen dem Biopartikel-Mikroarray zugesetzt werden, werden Neutrophile, die die Biopartikel-Cluster kontaktieren, aktiviert und initiieren die Schwarmreaktion.Das Biopartikel-Mikroarray wurde mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie validiert, um neutrophile Migrationen zu den Biopartikelclustern zu verfolgen. Stabile Neutrophilenschwärme werden um jeden Cluster nach 30 bis 60 Minuten Exposition gebildet. Im Gegensatz dazu zeigen Neutrophilen keine kollektive Migration ohne Biopartikelcluster.Die Fluoreszenzintensität von gefärbten neutrophilen Kernen wurde verwendet, um festzustellen, dass die durchschnittliche Schwarmgröße um die Biopartikelhaufen etwa 1490 Mikrometer quadratisch betrug. In Ermangelung von Clustern blieb die Fluoreszenz einer bestimmten Interessenregion im Laufe der Zeit konstant. Spuren der Neutrophilenmigration zeigen, dass Neutrophilen auf einem Biopartikelhaufen konvergierten, wenn man vorhanden war, aber keine Konvergenz im Kontrollsystem beobachtet wurde.Die Geschwindigkeit von Schwärmen und nicht aktivierten Neutrophilen wurde gemessen, und es wurde ein statistisch signifikanter Unterschied in den Geschwindigkeitsverteilungen festgestellt. Die durchschnittliche Geschwindigkeit für schwärmende Neutrophile betrug 20,6 Mikrometer pro Minute, während die durchschnittliche Geschwindigkeit für Kontrollneutrophile zwei Mikrometer pro Minute betrug. Die Konzentrationen von 16 Proteinen, die Neutrophile während des Schwärmens freisetzen, wurden im Laufe der Zeit analysiert.10 Proteine erhöhten die Konzentration. Zwei gingen zurück. Und die restlichen vier nahmen in der ersten Stunde des Schwarms zu, gingen danach aber zurück.Stellen Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens sicher, dass alles sauber ist und Ihre Briefmarken richtig getrocknet werden, da diese für eine erfolgreiche Musterung der Bakterienpartikel unerlässlich sind. Die Entwicklung dieser Technik wird es den Forschern ermöglichen, neue Fragen auf dem Gebiet des neutrophilen Schwärmens zu erforschen, einschließlich der Frage, wie freie Mediatoren und extrazelluläre Vesikel in die neutrophile interzelluläre Kommunikation involviert sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

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