Name: Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie effektive 3D-Bioprinting-Strategien für Gelatine Methacryloyl Hydrogel zur Verbesserung der Druckbarkeit. Diese Methoden ermöglichen komplexe biomedizinische Anwendungen und Gewebetherapien.

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Diese Arbeit wurde gefördert vom National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000), der National Nature Science Foundation of China (No.U1609207, 81827804), dem Science Fund for Creative Research Groups of the National Natural Science Gründung Chinas (Nr. 51821093).

1. Zellkultivierung
<ol><li>Bereiten Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin, das zur Kultur menschlicher Brustkrebszelllinien (MDA-MB-231) und menschlicher Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) verwendet wird.</li>
	<li>Bereiten Sie DMEM mit L-Glutamin (DMEM/F-12), ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin, verwendet, um Knochenmark mesenchymale Stammzell (BMSC) Linien zu kulturen.</li>
	<li>Stellen Sie die Kultivierungsumgebung auf 37 °C und 5%CO2ein. Kultur MDA-MB-231, HUVEC und BMSC, und durchdurchdurchdies die Zellen in einem 1:2-Verhältnis, wenn 90% Zusammenfluss erreicht wird.</li>
</ol>2. Herstellung von GelMA-Mikrosphären
<ol><li>Drucken Sie die Leuchte als Abbildung 1A mit Polymilchsäure (PLA) auf einem FDM-Drucker (FDM) (FUSED Deposition Modeling). Legen Sie zwei Metallringelektroden in die Halterung.</li>
	<li>Verbinden Sie die beiden Metallringelektroden mit geschliffenen bzw. positiven Polen. Legen Sie die Metallplatte mit der Hochspannung unter der Ringelektrode verbunden und legen Sie eine Petrischale mit Siliziumöl als Tröpfchenempfänger auf die Metallplatte.</li>
	<li>Gefriergetrocknetes GelMA (5% w/v) und Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP, 0,5% w/v) in Dulbeccos phosphatgepufferter Salin (DPBS) als Bioink (10 ml) auflösen. Filtern Sie den Bioink durch einen 0,22 m Filter auf Sterilität und erhitzen Sie ihn in einem 37 °C-Wasserbad für 15 min.</li>
	<li>Lösen Sie MDA-MB-231-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen in einem 15 ml Zentrifugalrohr bei 100 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand. Mischen Sie das Zellpellet mit 1 ml zubereitetem Bioink, indem Sie es langsam pipetieren, um die Produktion von Blasen zu verhindern.</li>
	<li>1 ml Bioink (MDA-MB-231) in eine 3 ml sterile Spritze geben. Füttern Sie den Bioink mit der Kraft der Druckluft (0,5 kPa). Setzen Sie die Spritze auf die Halterung. HINWEIS: Die Druckumgebung sollte bei einer Temperatur von 30 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % streng kontrolliert werden.</li>
	<li>Schalten Sie die Hochspannungsleistung ein und stellen Sie die Spannung auf 0 x 4 kV ein. Schalten Sie gleichzeitig das 405 nm Wellenlängenlicht ein, um die GelMA-Tröpfchen in 5 ml Siliziumöl zu vernetzen.</li>
	<li>Gießen Sie den größten Teil des Siliziumöls weg, indem Sie die Petrischale dekantieren. Übertragen Sie das übrig gebliebene Siliziumöl und die GelMA-Mikrosphären mit einem Löffel in ein 15 ml Zentrifugalrohr.</li>
	<li>5 ml DPBS hinzufügen und die Mischung gleichmäßig schütteln. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 x g für 5 min und entfernen Sie die überstande Flüssigkeit.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.9 3x.</li>
	<li>Nehmen Sie die GelMA Mikrosphären mit einem Löffel heraus und kultialten Sie sie in DMEM in einer Petrischale bei 37 °C und 5% CO2 für 3 Tage.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Fix mit 2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Entsorgen Sie das PFA und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Permeabilisieren Sie mit 2 ml 0,5% nichtionischem Tensid (d. h. Triton X-100) für 5 min bei RT.</li>
	<li>Entsorgen Sie das nichtionische Tensid und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Färben Sie sie mit 2 ml Tetramethylrhodin (TRITC) Phalloidin für 30 min in Dunkelheit bei RT.</li>
	<li>Entsorgen Sie den TRITC und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Färben Sie sie mit 2 ml 4–,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 10 min in Dunkelheit bei RT.</li>
	<li>Entsorgen Sie die DAPI und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Erfassen Sie die Morphologie mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>3. Herstellung von GelMA Fasern
<ol><li>Bereiten Sie eine Koaxialdüse vor, wie in Abbildung 2Adargestellt. Befestigen Sie eine Innendüse (25 G, OD = 510 m, ID = 250 m) und die Außendüse (18 g, OD = 1200 m, ID = 900 m) mit Löten. Schließen Sie ein Glasrohr (Länge = 50 mm, Innendurchmesser = 1,2 mm) an das Ende der Koaxialdüse an.</li>
	<li>Natriumalginatpulver (Na-Alg) auflösen, das unter ultraviolettem (UV) Licht 30 min in entionisiertem Wasser bei 2% (w/v) sterilisiert wird.</li>
	<li>Bereiten Sie eine sterile Bioink-Lösung nach Schritt 2.3 vor. Erhitzen Sie die GelMA Bioink- und Na-Alg-Lösung in einem 37 °C-Wasserbad für 15 min.</li>
	<li>Lösen Sie BMSCs-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen in einem 15 ml Zentrifugalrohr bei 100 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie die überstande Flüssigkeit. Mischen Sie das Zellpellet mit 2 ml vorbereitetem GelMA-Bioink, indem Sie es langsam pipetieren, um die Produktion von Blasen zu verhindern.</li>
	<li>2 ml Bioink (BMSCs) in eine 10 ml Spritze geben. 2 ml Na-Alg-Lösung in eine andere Spritze (10 ml) geben. Füttern Sie sie mit zwei Spritzenpumpen (hier Bioink bei 50 m/min und Na-Alg-Lösung bei 350 m/min). HINWEIS: Die Druckumgebung sollte bei einer Temperatur von 30 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % streng kontrolliert werden.</li>
	<li>Schalten Sie das 405 nm Wellenlängenlicht ein, um das transparente Rohr zu bestrahlen, um die GelMA-Fasern zu vernetzen. Verwenden Sie eine Petrischale mit DPBS, um die Fasern zu erhalten.</li>
	<li>Nehmen Sie die GelMA-Fasern mit einem Löffel aus DPBS heraus und beprägen Sie sie 3 Tage lang im präparierten DMEM/F-12 in 37 °C und 5%CO2.</li>
	<li>Befolgen Sie die Schritte 2.12-2.16, um die GelMA-Fasern für die morphologische Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop vorzubereiten.</li>
</ol>4. Herstellung komplexer 3D-GelMA-Strukturen
ANMERKUNG: Abbildung 3A zeigt die Fertigungsskizze der komplexen 3D-GelMA-Strukturen.
<ol><li>Wischen Sie den DLP-Bioprinter (Abbildung 3E) mit 75% Alkohol ab und setzen Ihn der UV-Bestrahlung 30 min für Sterilität aus.</li>
	<li>Lösen Sie das gefriergetrocknete GelMA (10% w/v) und LAP (0,5% w/v) in DPBS auf. Fügen Sie Magenta-Pigment in die Lösung (3% v/v) ein, um die Druckgenauigkeit zu verbessern.</li>
	<li>Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 m Filter auf Sterilität und erhitzen Sie sie in einem 37 °C-Wasserbad für 15 min.</li>
	<li>Erstellen Sie die 3D-Modelle mit CAD-Software (Computer-Aided Design). Importieren Sie die Modelldokumente in die obere Software (EFL) des angewendeten DLP-Biodruckers.</li>
	<li>10 ml zubereiteter Bioink in den Trog des DLP-Biodruckers geben.</li>
	<li>Stellen Sie die Druckparameter in der oberen Software wie folgtein: Lichtintensität = 12 mW/cm2 , Bestrahlungsdauer = 30 s und Schnitthöhe = 100 m. Beginnen Sie mit dem Drucken.</li>
	<li>Entfernen Sie die gedruckte Struktur aus dem Bioprinter und tauchen Sie sie in DPBS in eine Petrischale ein.</li>
	<li>Lösen Sie die MDA-MB-231s-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen bei 100 x g für 5 min in einem 15 ml-Rohr, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie die überstande Flüssigkeit und mischen Sie das Zellpellet mit 2 ml DMEM.</li>
	<li>Fügen Sie 100 L Zellaufhängung auf die gedruckten Strukturen hinzu. Kultur für 3 Tage im vorbereiteten DMEM bei 37 °C und 5%CO2.</li>
	<li>Befolgen Sie die Schritte 2.12-2.16, um die komplexen 3D-Strukturen für die morphologische Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop vorzubereiten.</li>
</ol>5. Herstellung von Mikrofluidchips auf GelMA-Basis
ANMERKUNG: Abbildung 4A zeigt die Fertigungsskizze des Mikrofluidikchips auf GelMA-Basis.
<ol><li>Lösen Sie das gefriergetrocknete GelMA 10% (w/v) und LAP (0,5% w/v) in DPBS auf. Filtern Sie die GelMA-Lösung durch einen 0,22-mm-Filter auf Sterilität.</li>
	<li>Sterilisieren Sie das Gelatinepulver 30 min unter UV-Licht und fügen Sie es der gelMA-LAP-Lösung hinzu, die in Schritt 5.1 zu einer Endkonzentration von 5% (w/v) hergestellt wird. Erhitzen Sie das Gemisch in einem 37 °C Wasserbad für 15 min.</li>
	<li>Entwerfen Sie eine Gruppe von Formen (Abbildung 4B,C) mit CAD-Software und fertigen Sie sie mit Photopolymerharz auf einem DLP-Drucker.</li>
	<li>Füllen Sie die Formen vollständig mit dem vorbereiteten Bioink.</li>
	<li>Legen Sie die Formen in einen 4 °C Kühlschrank, um die Gelatine für 30 min zu vernetzen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Formen und entnichtgen sie mit einer Klinge die teilweise (physikalisch) vernetzten Hydrogelplatten aus den Formen.</li>
	<li>Kombinieren Sie die beiden entformten Hydrogelplatten und verkleben Sie sie mit Hilfe von GelMA, indem Sie bei 405 nm für 1 min bestrahlen.</li>
	<li>Lösen Sie die HUVECs-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen in einem 15 ml Zentrifugalrohr, um ein Zellpellet bei 100 x g für 5 min zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie die überstande Flüssigkeit und mischen Sie das Zellpellet mit 2 ml DMEM.</li>
	<li>Füllen Sie den Mikrokanal vollständig, indem Sie die Zellsuspension mit einer Düse und einer Spritze injizieren.</li>
	<li>Drehen Sie den Chip alle 15 min während der nächsten 3 h auf den Kopf, um eine gleichmäßige und vollständige Zellaussaat zu erreichen. Die Chips in der Petrischale 3 Tage lang im präparierten DMEM bei 37 °C und 5%CO2ankulturieren.</li>
	<li>Befolgen Sie die Schritte 2.12-2.16, um die mikrofluidischen Chips für die morphologische Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop vorzubereiten.</li>
</ol>

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<li>Sugimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+bio-blood-vessels+constructed+using+a+tissue-specific+bioink+and+3D+coaxial+cell+printing+technique%3A+a+novel+therapy+for+ischemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease.</a> Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieser Artikel beschreibt mehrere Strategien zur Herstellung von GelMA 3D-Strukturen, nämlich GelMA-Mikrosphären, GelMA-Fasern, GelMA-komplexe Strukturen und Mikrofluidchips auf GelMA-Basis. GelMA verfügt über vielversprechende Biokompatibilitäts- und Formationsfähigkeit und ist im Bereich der Biofertigung weit verbreitet. Mikrosphärenstrukturen eignen sich für kontrollierte Wirkstofffreisetzung, Gewebekultivierung und Injektion in Organismen zur weiteren Therapie21,22...

Hydrogele gelten als geeignetes Material im Bereich der Biofabrikation1,2,3,4. Unter ihnen ist Gelatine Methacryloyl (GelMA) zu einem der vielseitigsten Biomaterialien geworden, ursprünglich im Jahr 2000 von Van Den Bulcke et al.5vorgeschlagen. GelMA wird durch die direkte Reaktion von Gelatine mit Methacrylanhydrid (MA) synthetisiert. Die Gelatine, die vom Säugetierkollagen hydrolysiert wird, besteht aus Zielmotiven der Matrix-Metalloproteinase (MMP). So können von GelMA erstellte dreidimensionale (3D) Gewebemodelle in vitro idealerweise die Wechselwirkungen zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix (ECM) in vivo imitieren. Darüber hinaus verbleiben Arginin-Glycin-Aspartinsäure (RGD)-Sequenzen, die in einigen anderen Hydrogelen wie Alginaten fehlen, auf den molekularen Ketten von GelMA. Dadurch ist es möglich, die Befestigung von gekapselten Zellen innerhalb der Hydrogelnetze zu realisieren6. Darüber hinaus ist die Formationsfähigkeit von GelMA vielversprechend. Die Methacrylamid-Gruppen auf den GelMA-Molekularketten reagieren mit dem Photoinitiator unter milden Reaktionsbedingungen und bilden bei Lichtbestrahlung kovalente Bindungen. Daher können die gedruckten Strukturen schnell vernetzt werden, um die entworfenen Formen auf einfache Weise zu erhalten.
Basierend auf diesen Eigenschaften, eine Reihe von Bereichen verwenden GelMA, um verschiedene Anwendungen durchzuführen, wie Tissue-Engineering, grundlegende Zytologie-Analyse, Arzneimittel-Screening, und Biosensing. Dementsprechend wurden auch verschiedene Fertigungsstrategien7,8,9,10,11,12,13,14gezeigt. Es ist jedoch immer noch eine Herausforderung, 3D-Bioprinting auf Basis von GelMA durchzuführen, was auf seine grundlegenden Eigenschaften zurückzuführen ist. GelMA ist ein temperaturempfindliches Material. Während des Druckprozesses muss die Temperatur der Druckatmosphäre streng kontrolliert werden, um den physikalischen Zustand des Bioinks aufrechtzuerhalten. Außerdem ist die Viskosität von GelMA im Allgemeinen niedriger als bei anderen gängigen Hydrogelen (d. h. Alginat, Chitosan, Hyaluronsäure usw.). Beim Bau von 3D-Architekturen mit diesem Material15stehen jedoch andere Hindernisse auf dem Spiel.
Dieser Artikel fasst mehrere Ansätze für den von unserem Labor vorgeschlagenen 3D-Bioprinting von GelMA zusammen und beschreibt die gedruckten Proben (d. h. die Synthese von GelMA-Mikrosphären, GelMA-Fasern, GelMA-Komplexstrukturen und GelMA-basierten mikrofluidischen Chips). Jede Methode hat spezielle Funktionen und kann in unterschiedlichen Situationen mit unterschiedlichen Anforderungen übernommen werden. GelMA-Mikrosphären werden durch ein elektrogestütztes Modul erzeugt, das zusätzliche externe elektrische Kraft bildet, um die Tröpfchengröße zu verkleinern. In Bezug auf GelMA-Fasern werden sie durch eine koaxiale Bioprinting-Düse mit Hilfe von viskosem Natriumalginat extrudiert. Darüber hinaus wird der Aufbau komplexer 3D-Strukturen mit einem Digital Light Processing (DLP) Bioprinter erreicht. Schließlich wird eine zweimalige Vernetzungsstrategie vorgeschlagen, um Mikrofluidchips auf GelMA-Basis zu bauen, die GelMA-Hydrogel und traditionelle mikrofluidische Chips kombinieren. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll eine signifikante Zusammenfassung der GelMA Bioprinting-Strategien in unserem Labor verwendet und kann andere Forscher in relativen Bereichen inspirieren.

<table><tbody><tr><td>0,22 μm m Filtermembran</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-6-indolcarbamidindihydrochlorid (DAPI)</td><td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D-Bioprinter</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licht mit 405 nm Wellenlänge</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koaxiale Düse</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Fluoreszenzmikroskop</td><td>OLYMPUS FV3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter für digitale Lichtverarbeitung (DLP)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP-Drucker</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium mit L-Glutamin (DMEM/F-12)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFL Software</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gelatine Sigma-Aldrich, Shanghai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatine Methacryloyl (GelMA)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungsleistung</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lithiumphenyl-2,4, 6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumalginat (Na-Alg)</td><td>Sigma-Aldrich, Shanghai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRITC Phalloidin</td><td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokolle des 3d-bioprintings von gelatine methacryloyl hydrogel-basierten bioinks

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatine Methacryloyl (GelMA) hat sich zu einem beliebten Biomaterial auf dem Gebiet des Bioprintings. Die Ableitung dieses Materials ist Gelatine, die aus Säugetierkollagen hydrolysiert wird. So verbleiben die Arginin-Glyin-Aspartinsäure(RGD)-Sequenzen und Zielmotive der Matrix-Metalloproteinase (MMP) auf den molekülen Ketten, die zur Zellbindung und -degradierung beitragen. Darüber hinaus sind die Formationseigenschaften von GelMA vielseitig. Die Methacrylamid-Gruppen ermöglichen es, dass ein Material unter Lichtbestrahlung in Gegenwart eines Photoinitiators schnell vernetzt wird. Daher ist es sinnvoll, geeignete Methoden zur Synthese dreidimensionaler (3D) Strukturen mit diesem vielversprechenden Material zu etablieren. Die geringe Viskosität schränkt jedoch die Bedruckbarkeit von GelMA ein. Hier werden Methoden zum 3D-Bioprinting von GelMA-Hydrogelen vorgestellt, nämlich die Herstellung von GelMA-Mikrosphären, GelMA-Fasern, GelMA-Komplexstrukturen und Mikrofluidchips auf GelMA-Basis. Die daraus resultierenden Strukturen und die Biokompatibilität der Materialien sowie die Druckverfahren werden diskutiert. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll als Brücke zwischen zuvor verwendeten Biomaterialien und GelMA dienen und zur Etablierung von GelMA-basierten 3D-Architekturen für biomedizinische Anwendungen beitragen kann.

Bei der Herstellung von GelMA-Mikrosphären wurden die GelMA-Tröpfchen durch die externe elektrische Feldkraft getrennt. Wenn die Tröpfchen in das empfangende Siliziumöl fielen, blieben sie Standard-Sphäroid-Form ohne Schwänze. Dies liegt daran, dass sich die GelMA-Tröpfchen in einer wässrigen Phase befanden, während sich das Siliziumöl in einer Ölphase befand. Die Oberflächenspannung, die sich zwischen den beiden Phasen bildete, führte dazu, dass die GelMA-Tröpfchen eine Standard-Sphäroidform beibeließen. In Bezug auf di...

Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

GelMA Hydrogel-basierte Bionik wird sehr beliebt im 3D-Bioprinting. Die niedrige Viskosität schränkt jedoch ihre Bedruckbarkeit ein. Hier teilen wir Strategien für den Druck von GelMA in unserem Labor mit anderen Forschern.In diesem Video nutzen wir die besonderen Eigenschaften dieses Biomaterials voll aus und schlagen verschiedene Druckverfahren für verschiedene 3D-Strukturen vor, die zu weiteren biomedizinischen Anwendungen beitragen könnten. Um beispielsweise Organschäden zu nehmen, können Implikationen in die entsprechende Therapie durch Injektion der einbettenden oder nachverfolgten GelMA-Strukturen verwendet werden. Es wäre nicht einfach, das gefriergetrocknete GelMA in kurzer Zeit vollständig aufzulösen.Um den Auflöseprozess zu beschleunigen, könnte ein Wirbelmischer verwendet werden. Jedes Biomaterial wird besondere Eigenschaften intim von GelMA verwenden. Ich schlug vor, dass ein neuer Chemer richtig einen Spaziergang von dem machen sollte, was beim Drucken kritisch ist.Die Vorgangsdetails bestimmen den Erfolg der Druckverfahren. Deshalb wählen wir eine visuelle Demonstration, um sie mit anderen Forschern zu teilen. Um Mikrosphären herzustellen, beginnen Sie mit der Verbindung der beiden Metallringelektroden mit geschliffenen und positiven Polen.Legen Sie die Metallplatte, die mit der Hochspannung verbunden ist, unter die Ringelektrode und eine Petrischale mit Siliziumöl als Tröpfchenempfänger auf die Metallplatte. Bereiten Sie Biotinte vor, indem Sie gefriergetrocknetes GelMA auflösen und LAP und DPBS filtern sie durch 0,22 Mikrometer Filter für Sterilität und erhitzen Sie es dann in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten. Lösen Sie MDA-MB-231-Zellen mit drei Millilitern 0,25 Prozent Trypsin und 0,02 Prozent EDTA-Lösung für drei Minuten bei 37 Grad Celsius.Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr und zentrifugieren Sie sie bei 100 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und mischen Sie die Zellen mit einem Milliliter vorbereiteter Biotinte, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen und sicherstellen, dass Luftblasen vermieden werden. Einen Milliliter bioink und zellgemisch in eine drei Milliliter sterile Spritze aspirieren.Füttern Sie die Biotinte mit der Kraft der Druckluft und legen Sie die Spritze auf die Vorrichtung. Schalten Sie die Hochspannungsleistung ein und stellen Sie die Spannung auf null bis vier Kilovolt ein. Schalten Sie gleichzeitig das 405 Nanometer Wellenlängenlicht ein, um die GelMA-Tröpfchen in fünf Milliliter Siliziumöl zu vernetzen.Dekantieren Sie die Petrischale, um den größten Teil des Siliziumöls loszuwerden und verwenden Sie einen Löffel, um das restliche Öl und die Mikrosphären in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr zu übertragen. Fügen Sie fünf Milliliter DPBS hinzu und schütteln Sie die Mischung Zentrifuge das Rohr bei 100 mal G und entfernen Sie den Überstand. Übertragen Sie die Mikrosphären in eine Petrischale mit DMEM und kultivieren Sie sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.Nach drei Tagen das Medium entsorgen und die Mikrosphären mit DPBS waschen. Fixieren Sie sie mit zwei Millilitern von vier Prozent PFA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, dann entsorgen Sie die PFA und wiederholen Sie die Wäsche. Permeabilisieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern von 0,5 Prozent nicht-ionischem Tensid für fünf Minuten bei Raumtemperatur entsorgen Sie das Tensid und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS.Als nächstes färben Sie die Zellen mit TRITC-Phalloidin für 30 Minuten dann DAPI für 10 Minuten im Dunkeln entsorgen die Farbstoffe und waschen die Kugeln mit DPBS nach jeder Färbung. Stellen Sie die Mikrosphären mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop ab. Sterilisiertes Natriumalginatpulver in entionisiertem Wasser bei einem Gewichts-Volumen-Verhältnis von zwei Prozent auflösen.Bereiten Sie sterile Bio-Tintenlösung wie zuvor beschrieben vorzubereiten und dann die Biotinte und Natriumalginat in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten erhitzen. Trypsinize und Zentrifuge bMSCs nach dem zuvor beschriebenen Verfahren für MDA-MB 231 Zellen, entfernen Sie dann die überstande Flüssigkeit und suspendieren Sie das Zellpellet mit 2 Millilitern der GelMA Biotinte. Zwei Milliliter des Biotintenzellgemisches in eine 10-Milliliter-Spritze und zwei Milliliter des Natriumalginat-Gemisches in eine andere Spritze ausdünnen.Füttern Sie die Lösungen mit zwei Spritzenpumpen Biotinte mit 50 Mikrometern pro Minute und Natriumalginat bei 350 Mikrometern pro Minute. Schalten Sie das 405 Nanometer Wellenlängenlicht ein, um das transparente Rohr zu bestrahlen und die GelMA-Fasern miteinander zu vernetzen. Verwenden Sie eine Petrischale, um die Fasern zu erhalten und sie mit einem Löffel zu sammeln.Die Fasern in eine Schale mit DMEM/F12 geben und drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid kulturieren. Nach der Kultivierung folgen die Zellen den zuvor beschriebenen Anweisungen zur Beobachtung der Fasern unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Lösen Sie gefriergetrocknetes GelMA und LAP und DPBS auf und fügen Sie Magenta-Essbarpigment in die Lösung ein, um die Druckgenauigkeit zu verbessern.Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 Mikrometer Filter auf Sterilität und erhitzen Sie sie in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten. Erstellen Sie die 3D-Modelle mit CAD-Software und importieren Sie die Modelldokumente in die obere Software des angewendeten DLP-Biodruckers. Fügen Sie zehn Milliliter der vorbereiteten Biotinte in den Trog des Biodruckers.Legen Sie die Druckparameter entsprechend den Manuskriptrichtungen fest und beginnen sie dann mit dem Drucken. Wenn Sie die gedruckte Struktur vollständig aus dem Bioprinter entfernen und in DPBS in eine Petrischale eintauchen. Lösen und Pellet MDA-MB 231 Zellen wie zuvor beschrieben.Setzen Sie sie mit zwei MilliliterDMEM aus und fügen Sie die Aufhängung der gedruckten Struktur hinzu. Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für drei Tage dann bereiten die Strukturen für die Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie ein Volumengewicht von 10 Prozent auf Volumen GelMA und 0,5 Prozent Gewicht auf Volumen LAP-Lösung vor und filtern Sie es dann durch einen 0,22-Mikrometer-Filter.Sterilisieren Sie Gelatinepulver unter UV-Licht für 30 Minuten und fügen Sie es der GelMA LAP-Lösung mit einem Gewichts-Volumen-Verhältnis von fünf Prozent hinzu. Erhitzen Sie das Gemisch in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten. Füllen Sie die Formen mit der vorbereiteten Biotinte und legen Sie sie 30 Minuten lang in einen Vier-Grad-Kühlschrank.Verwenden Sie eine Klinge, um die teilweise vernetzten Hydrogelplatten aus den Formen zu entfernen. Kombinieren Sie 2D-geformte Hydrogelplatten und verkleben Sie sie mit GelMA, indem Sie sie eine Minute lang mit 405 Nanometern bestrahlen. Ablösen und Pellet-HUVECs mischen die Zellen mit zwei MilliliterDMEM und injizieren die Suspension mit Düse und Spritze in den Mikrokanal.Für die nächsten drei Stunden drehen Sie den Chip alle 15 Minuten auf den Kopf, um einheitliche und vollständige Zellenbestuhlung zu erreichen. Die Chips in einer Petrischale drei Tage in DMEM bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid kultiessen und bereiten sie dann für die morphologische Beobachtung vor. Als die GelMA Tröpfchen in das erhaltende Silikonöl fielen, behielten sie eine Standard-Sphäroidform ohne Schwänze bei.Die gekapselten Zellen, die die elektrische Hochspannungsfeldkraft erleben, hielten ihre Streufähigkeit aufrecht, was die Biokompatibilität der elektrounterstützten Fertigungsmethode überprüfte. Ein DLP-Biodrucker wurde ausgewählt, um GelMA-Strukturen mit komplexeren Formen wie Nasenohr und Multikammer herzustellen. Saat-HUVECs, die an den GelMA-Materialien befestigt sind und sich auf der Oberfläche der vernetzten GelMA-Strukturen ausbreiten, was zeigt, dass diese Anwendung Potenzial für Tissue-Engineering birgt.Eine zweimal vernetzte Strategie wurde verwendet, um Mikrofluidchips auf GelMA-Basis herzustellen. Chips mit verschiedenen Mikrokanälen wurden durch die Entwicklung verschiedener Formen auf Anfrage gebaut und HUVECs wurden in den Kanälen gesät und an der Kanalwand befestigt, die die makroskopische Gefäßform bildet. Bei der Herstellung von Mikrosphären wird eine Hochspannungsquelle aufgebracht.Die Forscher müssen den Schaltkreis vor untersuchen und die belichteten Millibars nicht berühren, die bediener schützen, oder die Zellen durch Kurzschluss vor einem Schaden herrühren. Die Ultraschall-Wasserbasis könnte eine weitere Wahl sein, um die verdiente Geschwindigkeit zu beschleunigen. Dieser Beitrag fasste die 3D-Bioprinting-Methoden von GelMA in unserem Labor auf jeden Fall zusammen.Die Forscher könnten sich auf das Video beziehen und Druckstrategien verbessern oder erweitern, um weiteren biomedizinischen Anforderungen gerecht zu werden.

protocols-3d-bioprinting-gelatin-methacryloyl-hydrogel-based

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Das Video zeigt den Prozess der Erstellung eines 3D-biogedruckten Konstrukts mit Astrozyten, die in einer Bioink-Lösung suspendiert sind. Das biogedruckte Konstrukt erleichtert nach der Vernetzung die Adhäsion und Ausbreitung der Astrozyten, wodurch neuralähnliches Gewebe gebildet wird.

Eine Methode zum 3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten

Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann.

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Wir entwickelten eine heterogene Brust-Krebs-Modell, bestehend aus verewigt Tumor und Fibroblasten-Zellen eingebettet in ein Bioprintable Alginat/Gelatine Bioink. Das Modell der in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapituliert und erleichtert die Bildung von mehrzelligen Tumor Sphäroide, Einblick in die Mechanismen fahren Tumorgenese nachgeben.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation von verkapselten Zellen zu verhindern.

Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

Hier berichten wir über eine Methode des 3D-Bioprintings muriner kortikaler Astrozyten zur Bioschmierung neuraler Gewebe, um die Funktionalität von Astrozyten im zentralen Nervensystem und die Mechanismen von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen und Behandlungen zu untersuchen.

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine 3D-Drucktechnik zur Herstellung knochenähnlicher Strukturen durch Abscheiden einer Calciumphosphat-Tinte in einem körnigen Träger auf Gelatinebasis. Gedruckte Knochenanaloga werden in Freiform abgeschieden, mit Flexibilität für die direkte Ernte des Drucks oder die Vernetzung innerhalb einer lebenden Zellmatrix für mehrphasige Konstrukte.

Keramisches omnidirektionales Bioprinting in zellbeladenen Suspensionen zur Erzeugung von Knochenanaloga

Die Scherverarbeitung während der Hydrogelbildung führt zur Herstellung von Mikrogelsuspensionen, die scherdünn sind, sich aber nach Beseitigung der Scherkräfte schnell restrukturieren. Solche Materialien wurden als Stützmatrix für das Bioprinting komplexer, zellbeladener Strukturen verwendet. Hier werden Verfahren zur Herstellung des Stützbettes und kompatibler Biotinten beschrieben.

Agarose-Flüssiggele, die durch Scherverarbeitung während der Gelierung für suspendierten 3D-Biodruck gebildet werden

Dieser Artikel beschreibt Protokolle für die Herstellung von Gelatine-Methacryloyl-Mikrogelen mit hohem Durchsatz unter Verwendung mikrofluidischer Geräte, die Umwandlung von Mikrogelen in resuspendierbares Pulver (Mikroaerogele), die chemische Anordnung von Mikrogelen zu körnigen Hydrogelgerüsten und die Entwicklung von körnigen Hydrogel-Biotinten mit erhaltener Mikroporosität für den 3D-Biodruck.

Gelatine-Methacryloyl-Hydrogel-Gerüste: Hochdurchsatz-Mikrogelherstellung, Gefriertrocknung, chemische Assemblierung und 3D-Bioprinting

In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.

3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

In dieser Studie wird ein neuartiges κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad vorgestellt, das bemerkenswerte reversible Jamming-Unjamming-Übergangseigenschaften aufweist. Diese Attribute tragen zur Konstruktion biomimetischer Gewebe und Organe im eingebetteten 3D-Bioprinting bei. Das erfolgreiche Drucken von herz-/ösophagusähnlichem Gewebe mit hoher Auflösung und Zellwachstum demonstriert hochwertige Bioprinting- und Tissue-Engineering-Anwendungen.

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Erfahren Sie effektive 3D-Bioprinting-Strategien für Gelatine Methacryloyl Hydrogel zur Verbesserung der Druckbarkeit. Diese Methoden ermöglichen komplexe biomedizinische Anwendungen und Gewebetherapien.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

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