Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

GelMA Hydrogel-basierte Bionik wird sehr beliebt im 3D-Bioprinting. Die niedrige Viskosität schränkt jedoch ihre Bedruckbarkeit ein. Hier teilen wir Strategien für den Druck von GelMA in unserem Labor mit anderen Forschern.

In diesem Video nutzen wir die besonderen Eigenschaften dieses Biomaterials voll aus und schlagen verschiedene Druckverfahren für verschiedene 3D-Strukturen vor, die zu weiteren biomedizinischen Anwendungen beitragen könnten. Um beispielsweise Organschäden zu nehmen, können Implikationen in die entsprechende Therapie durch Injektion der einbettenden oder nachverfolgten GelMA-Strukturen verwendet werden. Es wäre nicht einfach, das gefriergetrocknete GelMA in kurzer Zeit vollständig aufzulösen.

Um den Auflöseprozess zu beschleunigen, könnte ein Wirbelmischer verwendet werden. Jedes Biomaterial wird besondere Eigenschaften intim von GelMA verwenden. Ich schlug vor, dass ein neuer Chemer richtig einen Spaziergang von dem machen sollte, was beim Drucken kritisch ist.

Die Vorgangsdetails bestimmen den Erfolg der Druckverfahren. Deshalb wählen wir eine visuelle Demonstration, um sie mit anderen Forschern zu teilen. Um Mikrosphären herzustellen, beginnen Sie mit der Verbindung der beiden Metallringelektroden mit geschliffenen und positiven Polen.

Legen Sie die Metallplatte, die mit der Hochspannung verbunden ist, unter die Ringelektrode und eine Petrischale mit Siliziumöl als Tröpfchenempfänger auf die Metallplatte. Bereiten Sie Biotinte vor, indem Sie gefriergetrocknetes GelMA auflösen und LAP und DPBS filtern sie durch 0,22 Mikrometer Filter für Sterilität und erhitzen Sie es dann in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten. Lösen Sie MDA-MB-231-Zellen mit drei Millilitern 0,25 Prozent Trypsin und 0,02 Prozent EDTA-Lösung für drei Minuten bei 37 Grad Celsius.

Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr und zentrifugieren Sie sie bei 100 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und mischen Sie die Zellen mit einem Milliliter vorbereiteter Biotinte, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen und sicherstellen, dass Luftblasen vermieden werden. Einen Milliliter bioink und zellgemisch in eine drei Milliliter sterile Spritze aspirieren.

Füttern Sie die Biotinte mit der Kraft der Druckluft und legen Sie die Spritze auf die Vorrichtung. Schalten Sie die Hochspannungsleistung ein und stellen Sie die Spannung auf null bis vier Kilovolt ein. Schalten Sie gleichzeitig das 405 Nanometer Wellenlängenlicht ein, um die GelMA-Tröpfchen in fünf Milliliter Siliziumöl zu vernetzen.

Dekantieren Sie die Petrischale, um den größten Teil des Siliziumöls loszuwerden und verwenden Sie einen Löffel, um das restliche Öl und die Mikrosphären in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr zu übertragen. Fügen Sie fünf Milliliter DPBS hinzu und schütteln Sie die Mischung Zentrifuge das Rohr bei 100 mal G und entfernen Sie den Überstand. Übertragen Sie die Mikrosphären in eine Petrischale mit DMEM und kultivieren Sie sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.

Nach drei Tagen das Medium entsorgen und die Mikrosphären mit DPBS waschen. Fixieren Sie sie mit zwei Millilitern von vier Prozent PFA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, dann entsorgen Sie die PFA und wiederholen Sie die Wäsche. Permeabilisieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern von 0,5 Prozent nicht-ionischem Tensid für fünf Minuten bei Raumtemperatur entsorgen Sie das Tensid und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS.

Als nächstes färben Sie die Zellen mit TRITC-Phalloidin für 30 Minuten dann DAPI für 10 Minuten im Dunkeln entsorgen die Farbstoffe und waschen die Kugeln mit DPBS nach jeder Färbung. Stellen Sie die Mikrosphären mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop ab. Sterilisiertes Natriumalginatpulver in entionisiertem Wasser bei einem Gewichts-Volumen-Verhältnis von zwei Prozent auflösen.

Bereiten Sie sterile Bio-Tintenlösung wie zuvor beschrieben vorzubereiten und dann die Biotinte und Natriumalginat in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten erhitzen. Trypsinize und Zentrifuge bMSCs nach dem zuvor beschriebenen Verfahren für MDA-MB 231 Zellen, entfernen Sie dann die überstande Flüssigkeit und suspendieren Sie das Zellpellet mit 2 Millilitern der GelMA Biotinte. Zwei Milliliter des Biotintenzellgemisches in eine 10-Milliliter-Spritze und zwei Milliliter des Natriumalginat-Gemisches in eine andere Spritze ausdünnen.

Füttern Sie die Lösungen mit zwei Spritzenpumpen Biotinte mit 50 Mikrometern pro Minute und Natriumalginat bei 350 Mikrometern pro Minute. Schalten Sie das 405 Nanometer Wellenlängenlicht ein, um das transparente Rohr zu bestrahlen und die GelMA-Fasern miteinander zu vernetzen. Verwenden Sie eine Petrischale, um die Fasern zu erhalten und sie mit einem Löffel zu sammeln.

Die Fasern in eine Schale mit DMEM/F12 geben und drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid kulturieren. Nach der Kultivierung folgen die Zellen den zuvor beschriebenen Anweisungen zur Beobachtung der Fasern unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Lösen Sie gefriergetrocknetes GelMA und LAP und DPBS auf und fügen Sie Magenta-Essbarpigment in die Lösung ein, um die Druckgenauigkeit zu verbessern.

Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 Mikrometer Filter auf Sterilität und erhitzen Sie sie in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten. Erstellen Sie die 3D-Modelle mit CAD-Software und importieren Sie die Modelldokumente in die obere Software des angewendeten DLP-Biodruckers. Fügen Sie zehn Milliliter der vorbereiteten Biotinte in den Trog des Biodruckers.

Legen Sie die Druckparameter entsprechend den Manuskriptrichtungen fest und beginnen sie dann mit dem Drucken. Wenn Sie die gedruckte Struktur vollständig aus dem Bioprinter entfernen und in DPBS in eine Petrischale eintauchen. Lösen und Pellet MDA-MB 231 Zellen wie zuvor beschrieben.

Setzen Sie sie mit zwei MilliliterDMEM aus und fügen Sie die Aufhängung der gedruckten Struktur hinzu. Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für drei Tage dann bereiten die Strukturen für die Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie ein Volumengewicht von 10 Prozent auf Volumen GelMA und 0,5 Prozent Gewicht auf Volumen LAP-Lösung vor und filtern Sie es dann durch einen 0,22-Mikrometer-Filter.

Sterilisieren Sie Gelatinepulver unter UV-Licht für 30 Minuten und fügen Sie es der GelMA LAP-Lösung mit einem Gewichts-Volumen-Verhältnis von fünf Prozent hinzu. Erhitzen Sie das Gemisch in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 15 Minuten. Füllen Sie die Formen mit der vorbereiteten Biotinte und legen Sie sie 30 Minuten lang in einen Vier-Grad-Kühlschrank.

Verwenden Sie eine Klinge, um die teilweise vernetzten Hydrogelplatten aus den Formen zu entfernen. Kombinieren Sie 2D-geformte Hydrogelplatten und verkleben Sie sie mit GelMA, indem Sie sie eine Minute lang mit 405 Nanometern bestrahlen. Ablösen und Pellet-HUVECs mischen die Zellen mit zwei MilliliterDMEM und injizieren die Suspension mit Düse und Spritze in den Mikrokanal.

Für die nächsten drei Stunden drehen Sie den Chip alle 15 Minuten auf den Kopf, um einheitliche und vollständige Zellenbestuhlung zu erreichen. Die Chips in einer Petrischale drei Tage in DMEM bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid kultiessen und bereiten sie dann für die morphologische Beobachtung vor. Als die GelMA Tröpfchen in das erhaltende Silikonöl fielen, behielten sie eine Standard-Sphäroidform ohne Schwänze bei.

Die gekapselten Zellen, die die elektrische Hochspannungsfeldkraft erleben, hielten ihre Streufähigkeit aufrecht, was die Biokompatibilität der elektrounterstützten Fertigungsmethode überprüfte. Ein DLP-Biodrucker wurde ausgewählt, um GelMA-Strukturen mit komplexeren Formen wie Nasenohr und Multikammer herzustellen. Saat-HUVECs, die an den GelMA-Materialien befestigt sind und sich auf der Oberfläche der vernetzten GelMA-Strukturen ausbreiten, was zeigt, dass diese Anwendung Potenzial für Tissue-Engineering birgt.

Eine zweimal vernetzte Strategie wurde verwendet, um Mikrofluidchips auf GelMA-Basis herzustellen. Chips mit verschiedenen Mikrokanälen wurden durch die Entwicklung verschiedener Formen auf Anfrage gebaut und HUVECs wurden in den Kanälen gesät und an der Kanalwand befestigt, die die makroskopische Gefäßform bildet. Bei der Herstellung von Mikrosphären wird eine Hochspannungsquelle aufgebracht.

Die Forscher müssen den Schaltkreis vor untersuchen und die belichteten Millibars nicht berühren, die bediener schützen, oder die Zellen durch Kurzschluss vor einem Schaden herrühren. Die Ultraschall-Wasserbasis könnte eine weitere Wahl sein, um die verdiente Geschwindigkeit zu beschleunigen. Dieser Beitrag fasste die 3D-Bioprinting-Methoden von GelMA in unserem Labor auf jeden Fall zusammen.

Die Forscher könnten sich auf das Video beziehen und Druckstrategien verbessern oder erweitern, um weiteren biomedizinischen Anforderungen gerecht zu werden.