Generierung transgener Ratten mit einem Lentiviral Vector Ansatz

Transgene Tiere sind für die moderne biomedizinische Forschung von grundlegender Bedeutung, da sie Studien über die Genfunktion in lebenden Organismen ermöglichen. In Tierstudien wurden verschiedene Methoden genetischer Veränderungen angewandt. Hier präsentieren wir eine weithin zugängliche und effektive Technik, die lentivirale Vektoren als Werkzeug für die transgene Aufnahme in das Genom eines Rattenembryons verwendet.

Nach der verabreichung des menschlichen Choriongonadotropins paaren Sichte fünf Wochen alte Wistar-Frauenratten eins zu eins mit sexuell fruchtbaren drei bis zehn Monate alten Wistar-Männchen. Um acht bis zehn .m am nächsten Morgen die Weibchen auf das Vorhandensein eines Vaginalsteckers überprüfen und die Eileiter von den Weibchen mit einem Paarungsstecker spätestens 10 a.m ernten.

in eine Sammelschale mit vorgewärmten M2-Medium. Wenn alle Eileiter gesammelt sind, übertragen Sie das Gewebe in eine 35-Millimeter-Schale mit vorgewärmten M2-Medium, ergänzt mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Hyaluronidase aus Rinderhoden, und legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop. Verwenden Sie feine Zangen, um die Wände des Eileiters zu öffnen und drücken Sie die Ampulla, bis die Embryonen befreit sind.

Um die Freisetzung der Embryonen aus den Cumuluszellen zu erleichtern, verwenden Sie eine Glastransferpipette, die mit einem mundbetätigten Saugrohr verbunden ist, um die Embryonen sanft nach oben und unten zu pipetten. Wenn alle Embryonen freigesetzt wurden, waschen Sie die Zellen ein paar Mal in frischem M2-Medium, um die Hyaluronidase und Zellablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie die Embryonen in einzelne 50 Mikroliter Tropfen vorädierten M16-Mediums, das mit Mineralöl bedeckt ist, in einer 60-Millimeter-Schale.

Dann legen Sie die Schale in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator mit einer 5% Kohlendioxid-Atmosphäre bis zu ihrer Injektion. Für lentivirale Vektormikroinjektion unter der Zona pellucida der einzelligen Stadium Embryonen, verwenden Sie einen Pipettenabzieher, um Mikroinjektion Borosilikat Glaskapillaren mit einem Filament vorzubereiten. Führen Sie nach jedem Wechsel des Filaments oder einer neuen Glaskapillare einen Rampentest durch, um die optimalen Parameter festzulegen.

Als nächstes verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um etwa zwei Mikroliter frisch aufgetauter lentiviraler Lösung pro Mikroinjektionspipette unter eine biosicherheitslaminare Durchflusshaube zu laden. Fügen Sie einen 100-Mikroliter-Tropfen M2-Medium in die Mitte des Deckels von einer 60-Millimeter-Petrischale hinzu. Bedecken Sie das Medium mit Mineralöl und montieren Sie die Haltepipette und die virusgeladene Mikroinjektionskapillare auf einen Mikromanipulator.

Legen Sie die Mikroinjektionsschale unter ein invertiertes Mikroskop und übertragen Sie 15 bis 20 einzellige Embryos in den M2-Tropfen in der Mikroinjektionsschale. Erfassen Sie einen Embryo mit der Haltepipette und verwenden Sie die 400-fache Vergrößerung und die Glaskapillare, um die lentivirale Lösung unter der Zona pellucida in den Perivitellineraum zu injizieren, der die Kapillare unter der Zona pellucida für einen Moment hält, nachdem das Virus geliefert wurde. Wenn alle Embryonen injiziert wurden, verwenden Sie eine feine Pipette, um die injizierten Zellen an die Kulturschale zurückzugeben und die Schale bis zu ihrer Implantation an den Zellkultur-Inkubator zurückzugeben.

Um die Pflegemütter auf den Embryotransfer vorzubereiten, paaren Sie geschlechtsreife Sprague-Dawley-Weibchen mit vasectomisierten Männchen und überprüfen Sie die Weibchen am nächsten Morgen auf einen Vaginalstecker. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflexe bei den anästhesierten Weibchen mit einem lebensfähigen Stecker bestätigt haben, tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf und rasieren Sie das Fell von der Rückseite jedes Tieres. Legen Sie die erste Ratte in der anfälligen Position auf einer sauberen Oberfläche auf einem Heizkissen unter einem chirurgischen Mikroskop.

Bedecken Sie die Ratte mit einem sterilen Vorhang mit einem kleinen Loch über den unteren Rücken geschnitten und machen Sie einen etwa zwei Zentimeter großen Hautschnitt parallel zur Lendenwirbelsäule. Verwenden Sie scharfe Schere, um einen Schnitt in der Bauchwand zu machen und verwenden Sie Zangen, um ein Eierstockfettpad zu greifen. Ziehen Sie den Eierstock und das Eileiter aus der Bauchhöhle auf ein Stück 0,9% Natriumchlorid getränkte Gaze.

Laden Sie M2 Medium, drei Luftblasen und die Embryonen in eine Transferkapillare. Verwenden Sie Mikroscheren, um einen kleinen Schnitt in das Eileiter zwischen dem Infundibulum und Ampulla zu machen und legen Sie die Spitze der Transferpipette in den Schnitt. Vertreibt die Embryonen und Luftblasen vorsichtig in das Eileiter, und setzt dann die stumpfe Zange ein, um den Fortpflanzungstrakt wieder in die Bauchhöhle zu legen.

Die Bauchwand mit polyglykolsäureabsorbierbaren Nähten bedecken und den Hautschnitt mit Wundklammern schließen und das Tier in einen sauberen Käfig auf eine wärmende Platte mit Überwachung bis zur vollen Resümee legen. Um potenzielle Partner zu vasectomisieren, nachdem sie die männliche Ratte wie gezeigt auf eine Operation vorbereitet haben, verwenden Sie 70% Ethanol und ein chirurgisches Peeling, um die Haut über den Hoden zu desinfizieren. Drücken Sie vorsichtig den Bauch, um die Hoden im Skrotalsack freizulegen und die Ratte mit einem sterilen Vorhang mit einem kleinen Loch über der operationsischen Stelle zu bedecken und verwenden Sie eine Skrotalschere, um einen 0,5-Zentimeter-Schnitt in der Mitte des Sacks zu machen.

Schieben Sie den Hoden vorsichtig nach links und lokalisieren Sie die Vas enzwischen den Hoden und der Mittellinie als weißen Kanal mit einem einzigen Blutgefäß. Verwenden Sie die Zange des Uhrmachers, um die Vas deferens sanft aus dem Skrotalsack zu ziehen und das Gefäß mit Zangen zu halten, verwenden Sie eine feine Schere, um ein ein Zentimeter Fragment aus dem Kanal zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Testis, wie gerade gezeigt, und schließen Sie die Haut mit polyglykolsäure resorbierbaren Nähten.

Dann legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf einer wärmenden Platte mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. In diesem repräsentativen Experiment, bei dem einzelne Embryonen mehrfach injiziert wurden, wurden acht Ratten aus Embryonen geboren, die zwei Mal injiziert wurden, von denen drei bestätigt wurden, um das Transgen zu tragen. Eine der Gründerinnen übertrug das Transgen nicht auf Nachkommen und drei Pflegeweibchen wurden für jedes Versuchsaufbau verwendet.

Der gewählte Ansatz ermöglichte die Erzeugung stabiler transgener Rattenlinien, die das TDP-43-eGFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle der neuronalen Synapse in einem Promotor im gesamten zentralnervösen System ausdrückten. Die Lentivirus-basierte Transgenese führte zu einer einzigen Kopie des Transgens, wie die quantitative PCR zeigt. Wenn diese Methode für andere lentivirale Vektoren verwendet wurde, wurde eine überlebenslange Rate von etwa 90% beobachtet.

Der Anteil der Embryonen, die die pronuklearen Injektionen überlebten, war deutlich geringer. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass schwangere weibliche Ratten als Pflegemütter mit einer vergleichbaren Effizienz verwendet werden können. Insbesondere zeigten die numerischen Daten, die für einzelne Mikroinjektionsrunden analysiert wurden, dass die Wirksamkeit der Implantation direkt von der Anzahl der Injektionen in einen Embryo und indirekt von der Viruslast abhing.

Der Einsatz von lentiviralen Vektoren garantiert die genomische Integration und Übertragung des Transgens und ermöglicht eine hohe Überlebensrate der mikromanipulierten Embryonen, selbst wenn mehrere subdermale Injektionen durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann effektiv auf andere Arten angewendet werden und kann als Alternative für die konventionelle Transgenese betrachtet werden.