Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

Diese Methode ermöglicht es, die mikroskalige Ökologie und das Verhalten von Mikroorganismen, die dynamische chemische Gradienten navigieren, aufzuklären und ihre versteckten Kompromisse, Nährstoffkinetik und Populationsdynamik in ökologisch relevanten Mikroumgebungen aufzudecken. Durch die Kombination von mikrofluidischer Technologie mit Photolyse erzeugen wir kontrollierte chemische Impulse, bei denen lokalisiertes Chemoattractant plötzlich auf der Mikroskala verfügbar wird, um die chemotaktische Reaktion von mikrobiellen Populationen zu messen, die zuerst unbeständigen chemischen Gradienten ausgesetzt waren. Entwerfen Sie den Kanal mit CAD-Software, und drucken Sie ihn auf einen Transparenzfilm, um die Fotomaske zu erstellen.

Fertigen Sie den Meister durch weiche Lithographie in einem rein raum, nach dem Manuskript. Bereiten Sie eine PDMS-Mischung vor, indem Sie das Elastomer mit seinem Härtungsmittel im Verhältnis 10 zu eins in einem 40-Milliliter-Becher kombinieren. Mit einem Kunststoffmesser kräftig mischen, bis die Flüssigkeit homogen ist.

Sofortige Entgasen des PDMS-Gemisches in einer Vakuumkammer für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Um den Prozess zu beschleunigen, lassen Sie das Vakuum regelmäßig los, um die Blasen zu platzen, die sich an der Schnittstelle bilden. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des Masters mit einem Druckreiniger.

Dann gießen Sie die entgaste PDMS-Mischung auf den Meister und backen Sie sie zwei Stunden lang im Ofen bei 80 Grad Celsius. Schneiden Sie das PDMS mit einer Klinge um die Mikrostrukturen in einem Abstand von etwa fünf Millimetern, und schälen Sie das PDMS dann vorsichtig vom Master. Stanzlöcher als Ein- und Auslass des Mikrokanals dienen.

Versiegeln Sie den Mikrokanal mit Klebeband, um Staubansammlungen zu verhindern. Entwerfen Sie die 3D-Form mit 3D-Designsoftware, und drucken Sie den Master für die PDMS-Form mit einem hochauflösenden 3D-Drucker. Nach der Vorbereitung und Entgasung der PDMS-Mischung wie zuvor, reinigen Sie die Oberfläche des Masters durch Dabbing mit Klebeband.

Setzen Sie den Master auf eine Skala. Dann, während die zentrale Region des Masters zu vermeiden, gießen Sie 23,4 Gramm ungehärtete PDMS-Mischung, um die gewünschte Höhe von PDMS zu erhalten, indem Sie die Höhe des Masters auf 0,5 Millimeter anpassen. Entfernen Sie alle verbleibenden Blasen mit Hilfe von Druckluft.

Legen Sie den PDMS auf den Master in einem Ofen bei 45 Grad Celsius, um für mindestens 12 Stunden zu backen. Dann die gehärtete PDMS-Schicht vorsichtig abziehen und Ein- und Auslasslöcher für die Injektion der bakteriellen Suspension bohren. Aktivieren Sie sowohl die Oberfläche einer Petrischale als auch die PDMS-Form mit Sauerstoffplasma für zwei Minuten.

Verkleben Sie die PDMS-Form auf der Petrischale, indem Sie die Form vorsichtig auf die Petrischale drücken. Vermeiden Sie es, an der Stelle zu drücken, an der sich die Features befinden. Die Mitdersäsung an die PDMS 3D-Form geklebte Petrischale mindestens 12 Stunden lang in einen Ofen bei 45 Grad Celsius geben, um die chemische Bindung zu stärken.

Aktivieren Sie anschließend die nanoporöse Polycarbonatmembran in einer Sauerstoffplasmakammer für eine Minute bei Raumtemperatur. Unter einer chemischen Haube eine kommerzielle Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan in entionisiertem Wasser auf 1% Volumen mit einem Polypropylenrohr verdünnen. Übertragen Sie die verdünnte 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung in eine Petrischale und tauchen Sie die aktivierte Membran 20 Minuten lang in die 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung ein.

Dann entfernen Sie die Membran aus der 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung mit einer Pinzette und legen Sie sie auf ein sauberes Raumtuch zum Trocknen. Für die Herstellung der mikrofluidischen PDMS-Kanäle, die auf der Membran liegen und das Waschen der Bakterienarena ermöglichen, wiederholen Sie die Fertigung des mikrofluidischen Geräts für das einzelne chemische Pulsexperiment wie bisher. Um die PDMS-Waschkanäle an die funktionalisierte Membran zu binden, aktivieren Sie zunächst zwei Minuten lang sowohl den PDMS-Waschkanal als auch die Polycarbonatmembran mit einer Sauerstoffplasmakammer.

Bringen Sie unmittelbar nach der Plasmabehandlung die funktionalisierte Membran und den PDMS-Waschkanal in Kontakt, indem Sie den PDMS-Waschkanal vorsichtig auf die Membran drücken. Es ist wichtig, das PDMS und die Membran vorsichtig zusammenzudrücken, oder die Membran könnte irreversibel an die Decke des 200-Mikrometer-Mikrokanals PDMS gebunden werden. Aktivieren Sie dann sowohl die gebundene Laminat-PDMS-Waschkanal-Polycarbonatmembran als auch die zuvor mit der Petrischale verklebte 3D-PDMS-Form, indem Sie sie für zwei Minuten in eine Sauerstoffplasmakammer legen.

Sandwich endielieren Sie die Membran zwischen zwei PDMS-Schichten, und drücken Sie zusammen. Die Petrischale mindestens 12 Stunden lang mit der Sandwichstruktur in einem Ofen bei 45 Grad Celsius verklebt, um die chemische Bindung zu stärken. Um zu beginnen, halten Sie die Millifluidische Kammer unter Vakuum für 20 Minuten.

Legen Sie dann die Petrischale mit der Millifluidischen Kammer auf eine Mikroskopstufe. Mit einer Pipette füllen Sie die Kammer unterhalb der Membran mit der verdünnten bakteriellen Suspension von GFP-fluoreszierenden Vibrio ordalii in einmillimolaren 4-Methoxy-7-Nitroindolinyl-Kaltert-L-Glutamat-Lösung in künstlichem Meerwasser. Nachdem Sie den Kanal mit der bakteriellen Suspension gefüllt haben, saugen Sie die Lösung überzählig mit einem Papiertuch und versiegeln Sie Ein- und Auslass mit PDMS-Steckern, indem Sie sie vorsichtig in die Löcher drücken.

Füllen Sie eine Spritze mit einer künstlichen Meerwasserlösung aus einem Millimolaren 4-Methoxy-7-Nitroindolinyl-caged-L-Glutamat, und befestigen Sie Schläuche am Ein- und Auslass des Waschkanals über der Membran. Schließen Sie die Schläuche an ein Abfallreservoir an, und stellen Sie sicher, dass die Schläuche vollständig in das Flüssigkeitsabfallreservoir eingetaucht sind, um Druckschwankungen zu vermeiden. Stellen Sie den Durchfluss an der Spritzenpumpe auf 50 Mikroliter pro Minute ein.

Starten Sie die Spritzenpumpe, um den Durchfluss im Waschkanal über der Membran zu ermitteln. Starten Sie die Software, die den LED-Strahl und die Mikroskopstufe steuert, und erzeugen Sie benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Stellen und mit unterschiedlichen Intensitäten. Zeichnen Sie Videos mit einem 4-fachen Objektiv in regelmäßigen Zeitintervallen über einen Zeitraum von mehreren Stunden und über mehrere zusammenhängende Positionen auf, um eine große Oberfläche abzudecken.

In dieser Studie wurden die mikrofluidischen und millifluidischen Geräte verwendet, um bakterielle chemotaktische Reaktions- und Akkumulationsprofile unter dynamischen Nährstoffbedingungen zu untersuchen. Maximale Intensitätsprojektionen zeigen die bakterielle Position, die durch weiße Spuren angezeigt wird, über ein 0,5-Sekunden-Intervall unmittelbar nach der Pulsfreisetzung und 40 Sekunden nach der Pulsfreisetzung. Die bakteriellen Bahnen wurden auch 60 Sekunden nach der Pulsfreisetzung in Schwarz dargestellt.

Der schattierte Bereich stellt den chemischen Impuls dar, der durch Photolyse zur Zeit Null Sekunde in der Mitte des Sichtfeldes freigesetzt wird, die sich anschließend diffundierte. Die bakterielle Konzentration sowie die zeitliche Dynamik der radialen Driftgeschwindigkeit nach einer Pulsfreisetzung in der Mitte des Sichtfeldes werden hier dargestellt. Negative Werte der Driftgeschwindigkeit entsprechen der gerichteten chemotaktischen Bewegung in Richtung des Zentrums des Pulses.

Schwimmstatistiken werden hier für eine Bakterienpopulation ohne chemische Gradienten vorgestellt. Trajektorien stellen die zweidimensionalen Projektionen der dreidimensionalen bakteriellen Bewegung im Mikrokanal dar. Die Wahrscheinlichkeitsverteilung der gemessenen bakteriellen Schwimmgeschwindigkeit passte durch eine Gammaverteilung.

Aus den bakteriellen Bahnen wurde die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Neuorientierungen extrahiert. Das Neuorientierungsmuster, die Verteilung der Schwimmgeschwindigkeit und die Neuorientierungsstatistiken der Organismen wurden verwendet, um ein individuelles Modell zu informieren. Diese Methode wurde an den Meeresbakterien Vibrio ordalii getestet, die Chemotaxis in Richtung der Aminosäure Glutamat durchführen, aber die vorgeschlagene Methode ist im Großen und Ganzen auf verschiedene Kombinationen von Arten und Chemoattractanten sowie auf biologische Prozesse jenseits von Chemotaxis anwendbar, wie Populations- und Gemeinschaftsdynamik unter räumlich heterogenen und dynamischen Bedingungen.

Klassische Techniken in der mikrobiellen Ökologie und Mikrobiologie, wie das Wachstum in Batchkulturen oder Chemostats, haben die räumlich-zeitlichen Eigenschaften mikrobieller Lebensräume weitgehend ignoriert. Die nahezu sofortige Erzeugung chemischer Impulse an den Mikroskalen durch Photolyse zielt darauf ab, die Art von Nährstoffpulsen zu reproduzieren, auf die Meeresbakterien in freier Wildbahn aus einer Reihe von Quellen stoßen, zum Beispiel die diffusive Ausbreitung von Pflaumen hinter sinkenden organischen Partikeln oder die Nährstoffausbreitung aus lysierten Phytoplanktonzellen. Die Aminosilanlösung ist akut toxisch und sollte mit äußerster Sorgfalt behandelt werden.

Wir arbeiten ausschließlich unter der Dunstabzugshaube und tragen Schutzausrüstungen wie Labormantel, Schutzbrille und Handschuhe. Wir kümmern uns auch um den Abfall, den wir anfallen.