Name: Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Erfahren Sie ein induzierbares Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der mRNA-Stabilität in primären Alveolar-Epithelzellen mittels Pipetten-Elektroporation. Diese Methode ermöglicht transienten Transfektion mit minimaler Störung der Zellphysiologie.

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Francis Migneault wurde durch ein Stipendium des Quebec Respiratory Health Network und des Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Lungentrainingsprogramms, ein Studium der FRSQ und ein Studentenwerk der Faculté des études Supérieures et unterstützt. Postdoktoranden, Université de Montréal. Diese Arbeit wurde vom Gosselin-Lamarre-Lehrstuhl für klinische Forschung und den Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544] unterstützt.

Alle tierischen Eingriffe wurden nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und vom Institutional Animal Care Committee des Research Center of Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) genehmigt.
1. Entwurf und Generierung des Antwortplasmids, das das Gen von Interesse ausdrückt (GOI)
<ol><li>Verwenden Sie einen induzierbaren Tetracyclin-Off-Vektor, z. B. pTRE-Tight.</li>
	<li>Analysieren Sie die Reihenfolge der GOI und der Multiple-Klon-Site (MCS) des Vektors, um die Einschränkungssites im MCS zu identifizieren, die intern nicht in der unternehmenseigenen Stelle vorhanden sind.</li>
	<li>Isolieren Sie primäre Alveolar-Epithelzellen aus männlichen Sprague-Dawley-Rattenlungen, wie zuvor beschrieben19,20.</li>
	<li>Reinigen Sie die gesamte RNA aus den Alveolar-Epithelzellen durch RNA-Extraktion mit einer Standardmethode, wie phenol/chloroform-Extraktion oder der Verwendung von Siliziumdioxid-basierten RNA-Spin-Säulen.</li>
	<li>Reverse-Transcribe der mRNA in komplementäre DNA (cDNA) mit Oligo(dT) und High-Fidelity Reverse Transkriptase.</li>
	<li>Verwenden Sie Hochtreue-Taq-Polymerase und Standard-Überlappungs-PCR-Techniken, um die GOI mit zwei ausgewählten Restriktions-Enzymerkennungsstellen mit entworfenen Primern zu flankieren.<ol>
<li>Lassen Sie die Vorwärtsgrundierung eine Kozak-Konsensribosome-Bindungsstelle21 enthalten, um die Expressionskonzentration enparieren zu lassen, um die Proteinexpression parallel zur mRNA-Stabilität zu untersuchen. Eine Sequenz, die das V5-Epitop vor der goI kodiert, muss enthalten sein, um den Ausdruck der transfizierten goI von endogenen Expressionen (Tabelle 1) zu unterscheiden.</li>
		<li>Lassen Sie die umgekehrte Grundierung ein Polyadenylierungssignal nach dem Stop-Codon enthalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mutanten können durch sequenzielles Löschen erzeugt werden, um die Auswirkungen verschiedener 3' UTR-Regionen auf die Stabilität der mRNA der GOI mit Reverse Primern zu untersuchen, die eine Polyadenylierungsstelle kodieren, die das 3' Ende der GOI 3' UTR schrittweise löscht (Abbildung 6). Alternativ kann PCR-gesteuerte Mutagenese verwendet werden, um eine bestimmte Interessensregion in der 3' UTR22anzusprechen.</li>
	<li>Verdauen Sie den induzierbaren Vektor und den Einsatz mit den zuvor gewählten Restriktionsenzymen bei der entsprechenden Inkubationstemperatur für 1 h, gefolgt von der Behandlung mit Phosphatase während der Vektorreaktion für 30 min, um eine Selbstligation zu vermeiden.</li>
	<li>Trennen Sie den verdauten Vektor und fügen Sie Segmente durch Elektrophorese in einem 1-1,5% Agarose-Gel ein (Konzentration abhängig von der Größe des Einsatzes).</li>
	<li>Sammeln Sie mit einer Klinge und einem UV-Licht die DNA-Fragmente, die den gewünschten Einsatz und vektor enthalten. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Reinigen Sie die gesammelten Segmente aus dem Agarose-Gel mit einem pcR-Reinigungskit auf Kieselsäurebasis und messen Sie die Konzentration mittels Spektrophotometrie bei 260 nm.</li>
	<li>Ligate die GOI und den induzierbaren Vektor mit T4 DNA Ligase mit einem Vektor: einfügen Molar Verhältnis von 1:3, um die Wahrscheinlichkeit der Ligation zu erhöhen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (RT) für 3 h.</li>
	<li>Verwandeln Sie die Ligationsreaktion in kompetente E. coli (DH5).<ol>
<li>Fügen Sie 1-10 ng Vektor und Gen in eine Röhre mit 100 l kompetenten Zellen. Inkubieren Sie die Zellen 30 min auf Eis und dann Wärmeschockzellen bei 42 °C für 45 s. Legen Sie die Röhre für 2 min auf Eis und fügen Sie 900 l RT LB Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 37 °C mit Schütteln bei 225 Rpm.</li>
		<li>Verteilen Sie 100 l der Reaktion auf eine LB-Agarplatte mit einem geeigneten Antibiotikum (z. B. 100 g/ml Ampicillin für den pTRE-Tight-Vektor), um die transformierten Bakterien auszuwählen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C.</li>
		<li>Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer Impfschleife oder einer 20-L-Spitze aus und inkubieren Sie über Nacht in 5 ml LB-Medium, das das geeignete Antibiotikum bei 37 °C mit Schütteln enthält. Die transformierten Bakterien können in Glycerinvorräten bei -80 °C im Verhältnis 400:600 lb Medium zu Glycerin gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrahieren Sie die Plasmid-DNA mit Kieselsäure-basierten Plasmidsäulen und messen Sie die Konzentration mittels Spektrophotometrie bei 260 nm. Bestätigen Sie die Einfügung der goI durch Restriktionsanalyse und ihre Ausrichtung sowie das Fehlen von Mutationen, die möglicherweise während der RT-PCR durch Sequenzierung eingeführt werden.</li>
</ol>2. Transfektion des Antwortplasmids, das das Gen von Interesse (GOI) in primäre Alveolar-Epithelzellen ausdrückt
<ol><li>Isolieren Sie Typ II Alveolare Epithelzellen aus rattenlunge.</li>
	<li>Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/cm2 in 100 mm Petrischalen mit komplettem minimalen essentiellen Medium (komplettes MEM). Komplettes MEM ist MEM, ergänzt durch 10% FBS, 0,08 mg/L Tobramycin, Septra (3 g/mL Trimethoprim und 17 g/ml Sulfamethoxazol), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) und 2 mM L-Glutamin. Die Zellen für 24 h bei 37 °C in 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator skulturen.</li>
	<li>Am nächsten Tag 500 l komplettes MEM ohne Antibiotikum in jeden Brunnen einer neuen 12-Brunnenplatte legen und die Platte 30 min bei 37 °C vorwärmen. Während dieses Schritts ist es wichtig, fetales Rinderserum frei von kontaminierenden Tetracyclinen oder mit einem zu niedrigen Niveau zu verwenden, um die Induzierbarkeit zu stören.</li>
	<li>Bereiten Sie 1,5 ml-Röhrchen vor, die das Plasmid mit dem induzierbaren GOI (GOI-Plasmid) und dem regulatorischen Vektor (z. B. pTet-Off) enthalten, indem Sie 1 g GOI-Plasmid und 1 g regulatorischen Vektor pro Bohrwert bei RT hinzufügen. Für Coexpression-Experimente mit RNA-bindenden Proteinen (RBP) wird dem DNA-Mix 1 g eines konstitutiven Vektors (z.B. pcDNA3), der das RPB von Interesse ausdrückt, zugesetzt (Abbildung 7).</li>
	<li>Das Medium ansaugen und die Zellen vorsichtig mit PBS (ohne Kalzium und Magnesium) vorwärmiert bei 37 °C abspülen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml 0,05% Trypsin vorgewärmt bei 37 °C hinzu und inkubieren Sie die Zellen, bis die Zellen abgetrennt sind (2-4 min). Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 10 ml komplettes MEM ohne Antibiotikum hinzufügen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 ml Rohr, waschen Sie die Petrischale mit 4 ml Medium, um so viele verbleibende Zellen wie möglich zu sammeln, und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen und entsorgen und das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zählen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet im Resuspensionspuffer in einer Konzentration von 4 x 107 Zellen/ml wieder aufsetzen. Fügen Sie die Zellen aus dem 1,5 ml Rohr in Schritt 2.4 bei einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Brunnen vorbereitet und mischen Sie sie sanft durch Pipettieren nach oben und unten.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr in die Elektroporationsvorrichtung und füllen Sie es mit 3,5 ml Elektrolysepuffer.</li>
	<li>Legen Sie eine vergoldete Elektrodenspitze durch vollständiges Drücken des Kolbens in eine Pipette ein. Mischen Sie den Inhalt des 1,5 ml Rohres vorsichtig und saugen Sie die Zellen vorsichtig mit der Pipette an. Achten Sie darauf, dass Luftblasen nicht in die Spitze gelangen, da dies während der Elektroporation zu lichten Lichtbögen führt und zu einer verminderten Transfektionseffizienz führt.</li>
	<li>Legen Sie die Pipette in die Elektroporationsstation ein, bis ein Klickgeräusch vorliegt.</li>
	<li>Wählen Sie das entsprechende Elektroporationsprotokoll für alveolare Epithelzellen, das einer Pulsspannung von 1.450 V und 2 Impulsen mit einer Breite von 20 ms entspricht, und drücken Sie auf dem Touchscreen Start.</li>
	<li>Unmittelbar nach der Transfektion die Pipette entfernen und die Zellen in einen zuvor mit komplettem MEM gefüllten Brunnen ohne Antibiotikum übertragen, das auf 37 °C vorgewärmt wurde.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.14 für die verbleibenden Proben.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig über die Brunnenoberfläche zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Ersetzen Sie das Medium nach 2 Tagen durch komplettes MEM durch Antibiotika.</li>
	<li>Bestätigen Sie den Erfolg der Transfektion, indem Sie die Expression von eGFP unter einem Fluoreszenzmikroskop oder durch Durchflusszytometrie mit einem Kontrollvektor(Abbildung 1) beobachten. HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und erfordert einen zusätzlichen Transfektionsschritt mit einem anderen Plasmid, das eGFP exsep, wie pcDNA3-EGFP, exzessischt.</li>
</ol>3. Induktion der Transkriptionshemmung der GOI
HINWEIS: Die Zellen können mit den gewünschten Behandlungen vor doxycyclin induktion vorbehandelt werden, um ihre Auswirkungen auf die mRNA-Stabilität zu bewerten (Abbildung 5).
<ol><li>Bereiten Sie eine Doxycyclin-Stammlösung von 1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor. Bewahren Sie die Lagerlösung bei -20 °C vor Licht schutzfrei auf. Doxycyclin, ein Tetracyclin-Derivat, wird anstelle von Tetracyclin verwendet, weil es eine längere Halbwertszeit (2x) als Tetracyclin hat. Darüber hinaus ist eine geringere Konzentration von Doxycyclin für die vollständige Inaktivierung des Tet Operon23erforderlich. HINWEIS: Doxycyclin könnte die mRNA-Expression der endogenen GOI beeinflussen. Um dies zu überprüfen, sollte die Wirkung einer 24-h-Behandlung mit Doxycyclin auf Alveolarzellen getestet werden, um das Fehlen von Veränderungen der GOI-Expression zu bestätigen (Abbildung 2).</li>
	<li>Bereiten Sie eine frische 1 g/ml Doxycyclin-Lösung in vollständiger MEM 72 h-Posttransfektion vor und erwärmen Sie sie auf 37 °C.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml vollständiges MEM, das 1 g/ml Doxycyclin pro Brunnen enthält, um die Transkription der GOI zu hemmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie mehrere Brunnen bei 37 °C in 5%CO2 für verschiedene Zeitmengen von 15 min-6 h, um die mRNA-Halbwertszeit der goI zu bewerten.</li>
	<li>Am Ende der Behandlung die Zellen mit eiskaltem PBS waschen und mit einem handelsüblichen Phenol-Chlorform-RNA-Extraktionskit lysieren, indem Sie 500 l Puffer pro Brunnen hinzufügen und die Platte schütteln, um die Zellen zu homogenisieren.</li>
	<li>Isolieren Sie die RNA gemäß dem Herstellerprotokoll. Bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 nm. RNA-Proben mit 260:230 bzw. 260:280 Verhältnissen von 1,8 bzw. 2,0 gelten als rein. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>4. Bestimmung der mRNA-Stabilität der GOI
<ol><li>Behandeln Sie 1 g Gesamt-RNA mit RNAse-freier DNAse I (Verstärkungsgrad), um jede Spur von Plasmid-DNA zu entfernen, die die nachfolgende DNA-Verstärkung stören könnte.<ol>
<li>Kombinieren Sie in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen 1 g RNA, 1 l 10x DNase I-Reaktionspuffer, 1 l DNAse I (1 U/L) und RNAse-freies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 10 l zu erhalten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Reaktion bei RT für 20 min.</li>
		<li>Deaktivieren Sie DNAse I, indem Sie dem 10-L-Reaktionsmix 1 l von 25 mM EDTA hinzufügen und die Reaktion bei 70 °C für 10 min inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Reverse-Transcribe die DNA-erschöpfte Gesamt-RNA in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen cDNA-Synthese-Kit mit einer Mischung aus Oligo(dT) und zufälligen Hexamer-Primern, um die Reverse-Transkriptionseffizienz zu verbessern.<ol>
<li>Fügen Sie kurz 4 l 5x Reaktionsmischung, 1 l Reverse-Transkriptase und 4 l RNAse-freies Wasser zu 11 l des DNA-erschöpften gesamten RNA-Mixes hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 l zu erhalten. Mischen Sie die Reaktion gut, indem Sie sie nach oben und unten pipetieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Reaktion für 5 min bei 25 °C, gefolgt von 20 min bei 46 °C, und inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie sie bei 95 °C für 1 min inkubieren. Jede Reaktion ergibt 50 ng/l cDNA-Produkt.</li>
		<li>Verdünnen Sie die cDNA-Reaktion auf eine Konzentration von 5 ng/l, indem Sie dem 20-L-Reaktionsmix 180 l molekularbiologisches Wasser zusetzen. Bewahren Sie die cDNA-Produkte bei -80 °C auf oder führen Sie sofort die quantitative PCR (qPCR) in Echtzeit durch. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Entwerfen Sie qPCR-Primer speziell für die GOI vorwärts und rückwärts.<ol>
<li>Aufgrund der endogenen Expression der goI in den Zellen müssen die Primer so ausgelegt sein, dass sie ein 100-150 bp Amplikon des Ang.:A5-Epitops verstärken, das an die goI gekoppelt ist (Tabelle 1).</li>
		<li>Interne Referenzgenprimer müssen auch als Normalisierungskontrollen verwendet werden. Üblicherweise werden Haushaltsgene wie Beta-Actin und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1-Gene als Referenzgene verwendet. Diese können jedoch aufgrund der Variation der Transfektionseffizienz nicht mit diesem Induktionssystem verwendet werden. Stattdessen wird die Expression des tTA-Ad-Transkripts zum Zwecke der Normalisierung bewertet, da seine Expression in Zellen aufgrund der Aktivität des Cytomegalievirus-Promotors konstitutiv ist. Jede Variation in seiner Expression, gemessen mit qPCR, ist repräsentativ für die Transfektionseffizienz (Primer: vorwärts 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' und reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp Amplicon) und ermöglicht die Normalisierung der Expression der transfizierten Klone (Abbildung 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie jede qPCR-Reaktion in Dreifacharbeit mit einem SYBR Green Farbstoff-Master-Mix vor.<ol>
<li>Verdünnen Sie die 5 ng/l cDNA-Mischung mit molekularbiologischem Wasser auf eine Konzentration von 1,25 ng/l.</li>
		<li>Kombinieren Sie 5 l SYBR Green Farbstoff-Master-Mix (2x), 0,1 l molekularbiologisches Wasser, 0,45 l von 7,5 'M Vorwärtsprimer, 0,45 'L von 7,5 'M Reverse Primer und 4 'L von 1,25 ng/l cDNA, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 'L zu erhalten. Verwenden Sie optische Klebefolie, um sicherzustellen, dass die Plattenabdeckung versiegelt ist und um Verunreinigungen und Verdunstung zu verhindern.</li>
		<li>Drehen Sie den Reaktionsmix kurz durch Zentrifugation nach unten und legen Sie die Platte in einen qPCR Thermocycler.</li>
	</ol></li>
	<li>Verstärken Sie die V5-getaggten GOI- und tTA-Ad-Amplicons mit den folgenden qPCR-Bedingungen: 95 °C für 10 min als Denaturierungsschritt, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 10 s, 58 °C für 15 s und 72 °C für 20 s. Nach der Auswertung der Amplifikationszyklen muss eine hochauflösende Schmelzkurve erzeugt werden, um die spezifischen Schmelztemperaturen der gewünschten Amplikonen zu bewerten und das Fehlen von Rauschamplikonspitzen zu gewährleisten.<ol>
<li>Schließen Sie negativgesteuerte Kontrollen für die qRT-PCR ein, indem Sie qPCR mit RNA als Vorlage ohne Reverse-Transkriptase durchführen, um als Kontrolle für eine mögliche Plasmid-DNA-Kontamination zu dienen, und qPCR ohne cDNA, die dem qPCR-Mix hinzugefügt wird, um sicherzustellen, dass das Fehlen von Primer-Dimeren oder Kontaminanten.</li>
		<li>Die optimale cDNA-Konzentration, Primereffizienz und Konzentration muss entsprechend der GOI durch einen Standard-Kurventest optimiert werden. Führen Sie dazu eine serielle Verdünnung mit cDNA aus unbehandelten Zellen (kultiviert ohne Doxycyclin) durch. Die Standardkurve wird erzeugt, indem die Cq-Werte mit dem Protokoll des cDNA-Verdünnungsfaktors dargestellt werden, und die Amplifikationseffizienz (E) wird entsprechend der Steigung der Standardkurve mit der folgenden Formel berechnet: E = 10-1/Steigung HINWEIS: Die Verstärkungseffizienz sollte etwa 0,9 bis 1,05 betragen. Andernfalls müssen die Primer neu gestaltet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie die qPCR-Daten mit der vergleichenden Cq-Methode, indem Sie die Expressionswerte der GOI auf die Expression von tTA-Ad normalisieren, um die relativen Expressionsniveaus der GOI zu erhalten und ihre Expression als Prozentsatz der mRNA-Expression der GOI in Zellen desselben Tieres am Startpunkt (t = 0) zu melden (Abbildung 4).</li>
	<li>Die Halbwertszeit wird aus der Ratenkonstante (K) der GOI mRNA Abbaukurve mit der folgenden Gleichung bestimmt: t1/2 = ln 2/K.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die niedrige Transfektionsrate von Alveolarenepithelzellen in der Primärkultur war eine ernsthafte Einschränkung für die Verwendung des Tet-Off-Systems zur Beurteilung der mRNA-Stabilität in diesen Zellen. Diese Einschränkung wurde jedoch durch die Pipettenelektroporation überwunden, die eine Transfektionseffizienz von 25-30 % ermöglichte (Abbildung 1 und Abbildung 3)26.
Die Messung der Transkriptstabilität ist...

Mehrere Techniken wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNAs zu bestimmen. Die Puls-Chase-Zerfallstechnik, die markierte mRNAs verwendet, ermöglicht die gleichzeitige Auswertung eines großen Pools von mRNAs mit minimaler zellulärer Störung. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine direkte Schätzung der Halbwertszeit eines einzelnen Gentranskripts und kann nicht implementiert werden, um die posttranskriptionelle Modulation einer mRNA nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren, ROS, Alarminen oder Entzündungen zu untersuchen1.
Die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, wie Actinomycin D und Amanitin, ist eine relativ einfache Methode zur Messung der mRNA-Abbaukinetik im Laufe der Zeit. Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber früheren Techniken (d. h. Pulse-Chase) beruht auf der Fähigkeit, die Halbwertszeit eines bestimmten Transkripts direkt abzuschätzen und zu vergleichen, wie verschiedene Behandlungen seine Abbaukinetik beeinflussen könnten. Die signifikante schädliche Wirkung von Transkriptionsinhibitoren auf die Zellphysiologie stellt jedoch einen großen Nachteil des Ansatzes2dar. Tatsächlich hat die Hemmung des gesamten Zelltranskriptoms mit diesen Medikamenten die negative Nebenwirkung, die Synthese von Schlüsselelementen, die an der mRNA-Stabilität beteiligt sind, wie z. B. microRNAs (miRNAs), sowie die Expression und Synthese von RNA-bindenden Proteinen, die für den mRNA-Abbau und die Stabilität wichtig sind, zu stören. Die starke Störung der Gentranskription durch diese Medikamente könnte daher die Abbaukurven von Transkripten arteffakt verändern.
Das Promotor-Induktionssystem stellt einen dritten Ansatz zur Messung der Halbwertszeit einer bestimmten mRNA dar. Diese Methode misst den Abbau einer spezifischen mRNA in ähnlicher Weise wie Methoden, die Transkriptionsinhibitoren verwenden. Häufig kommen zwei Arten von Induktionssystemen zum Einsatz: der seruminduzierte c-fos-Promoter3 und das Tet-Off Induzierbare System4. Mit dem c-fos-System ist die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, die toxisch für die Zelle sein können, nicht erforderlich. Diese Methode erfordert jedoch eine Zellzyklussynchronisierung, die die Auswertung der tatsächlichen Stabilität eines Transkripts während der Interphase5verhindert. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Tet-Off-System die starke Expression des Gens von Interesse (GOI) unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors. Dieses System erfordert das Vorhandensein von zwei Elementen, die in die Zelle kotransfiziert werden müssen, um funktionsfähig zu sein. Das erste Plasmid (pTet-Off) drückt das regulatorische Protein tTA-Adv aus, einen hybriden synthetischen Transkriptionsfaktor, der aus dem prokaryotischen Repressor TetR (aus Escherichia coli) besteht, das zu drei Transkriptionstransaktivierungsdomänen aus dem viralen Protein HSV VP16 verschmolzen ist. Die GOI wird unter der Kontrolle eines synthetischen Promotors (PTight) in das pTRE-Tight-Plasmid geklont, das die minimale Sequenz des Cytomegalievirus-Promotors (CMV) umfasst, die zu sieben Wiederholungen der tetO-Operatorsequenz verschmolzen ist. Die Transkription des Gens flussabwärts von PTight ist abhängig von der Wechselwirkung von TetR mit tetO. In Gegenwart von Tetracyclin oder seinem Derivat Doxycyclin verliert der TetR-Repressor seine Affinität zum tetO-Operator, was zu einer Einstellung der Transkription4führt. Die Eigenschaften des Tet-Off-Systems machen es zu einem idealen Modell für die Untersuchung der spezifischen mRNA-Expression in eukaryotischen Zellen unter Vermeidung potenzieller pleiottroper Effekte, die sekundär zum Fehlen prokaryotischer regulatorischer Sequenzen in der eukaryotischen Zelle6sind. Normalerweise werden doppelt stabile Tet-Off-Zelllinien (HEK 293, HeLa und PC12) mit diesem System verwendet, um Kopien des Reglers und Reaktionsplasmide für einen bequemen Zugriff auf die kontrollierbare Genexpression7,8,9zu integrieren.
Mehrere Modelle von Alveolar-Epithelzellen in der Kultur wurden verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolarenepithels zu untersuchen. Seit Jahren nutzen Forscher ausgiebig menschliche oder Nagetier-Primärzellen10,11 sowie verewigte Zelllinien wie menschliche A549- oder Ratten-RLE-6TN-Zellen12,13. Obwohl sie im Allgemeinen weniger proliferativ und schwieriger zu kultur- und transfektionsmittel sind, bleiben Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur der Goldstandard für die Untersuchung der Funktion und Dysfunktion des Alveolarers epithel unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Tatsächlich weisen verewigte Zelllinien wie A549-Zellen nicht die komplexen Eigenschaften und Phänotypen von Primärzellen auf, während alveolare Epithelzellen in der Primärkultur die Haupteigenschaften des Alveolarenepithels rekapitulieren, insbesondere die Fähigkeit, eine polarisierte und enge Barriere14,15zu bilden. Leider sind diese Zellen sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken, wie diejenigen, die Liposomen verwenden, was den Einsatz eines Promotor-induzierten Systems wie Tet-Off sehr schwierig macht.
Die posttranskriptionelle Modulation von mRNAs ist eine der effektivsten Methoden zur schnellen Modulation der Genexpression eines Transkripts16. Die mRNA 3' unübersetzte Region (3' UTR) spielt in diesem Mechanismus eine wichtige Rolle. Es hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zur 5' UTR eine exponentielle Korrelation zwischen der Länge der 3' UTR und den zellulären und morphologischen Komplexitäten eines Organismus besteht. Diese Korrelation legt nahe, dass die 3' UTR, wie die mRNA-Codierungsregionen, einer natürlichen Selektion unterzogen wurde, um eine immer komplexere posttranskriptive Modulation während der gesamten Evolution17zu ermöglichen. Die 3' UTR enthält mehrere Bindungsstellen für Proteine und miRNAs, die die Stabilität und Übersetzung des Transkripts beeinflussen.
In der vorliegenden Arbeit haben wir ein Werkzeug entwickelt, um die Rolle hochkonservierter Domänen in der 3' UTR einer GOI zur Kontrolle der Transkriptstabilität zu untersuchen. Wir konzentrierten uns auf den epithelialen Natriumkanal, die Alpha-Untereinheit (ENaC), die eine Schlüsselrolle in der alveolar epithelialen Physiologie18spielt. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden erfolgreich transfiziert mit den beiden Komponenten des Tet-Off-Systems transfiziert, was die Untersuchung der Rolle der 3' UTR in der mRNA-Stabilität mit einem System ermöglicht, das die Zellphysiologie und den Stoffwechsel im Vergleich zur Verwendung von Transkriptionsinhibitoren mit anderen Protokollen minimal beeinflusst. Es wurde eine Klonstrategie entwickelt, um die Expression der goI von der des endogenen Gens unter Verwendung eines nicht endogen exprimierten Epitops (V5) zu unterscheiden. Die Reaktions- und regulatorischen Plasmide wurden dann mit hilfe einer Pipettenelektroporationstechnik in Alveolar-Epithelzellen übertragen. Anschließend wurde die Expression des Transkripts durch Inkubation der Zellen mit Doxycyclin in unterschiedlichen Zeitintervallen gemessen. Die Halbwertszeit des Transkripts wurde von RT-qPCR mit einer modifizierten Cq-Methode unter Verwendung des transfizierten tTA-Ad mRNA-Produkts zur Normalisierung bewertet. Durch unser Protokoll bieten wir eine bequeme Möglichkeit, die posttranskriptionelle Modulation eines Transkripts unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen und die Einbeziehung der nicht übersetzten Regionen genauer zu definieren.

<table><tbody><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Bright-LineHämazytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform -</td><td>Molekularbiologie Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED Inverses Mikroskop mit Phasenkontrast</td><td></td> <td>Leica-DNase</td><td></td></tr> <tr>I, <td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td>Doxycyclinhyclat <td>Amplifikationsqualität</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS), ohne Calcium und Magnesium</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol - Molekularbiologische Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 KonsoleInkubatorShaker</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA-Synthesekit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol - Molekularbiologische</td><td>Qualität Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon mit Agar (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide ausPseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, Pulver</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatte</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optischer Klebefilm</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage Klasse II Biologische Sicherheitswerkbänke</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51025413</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-exU Elektrophoresesystem</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System 10 & micro; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Vektor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP Plasmid</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA-Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Fortgeschrittener Vektor</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight-Vektor</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Alveolarepithelzellen</td> n.a.n.a.QIAEX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II Gel-Extraktionskit</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 und 7 Flex Real-Time PCR System Software</td><td>Applied Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex Real-Time PCR System, 96 Well Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes Ratten-TNF-alpha-Protein</td><td>R& Ampere; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet-System zugelassen FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines</td><td>Agarose-Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, Molekularbiologie</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

effizientes transkriptionsgesteuertes plasmidexpressionssystem zur untersuchung der stabilität von mrna-transkripten in primären alveolar-epithelzellen

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Das Studium der posttranskriptionalen Regulation ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Modulation einer gegebenen Boten-RNA (mRNA) und ihrer Auswirkungen auf die Zellhomöostase und den Stoffwechsel. Tatsächlich könnten Schwankungen des Transkriptsausdrucks die Übersetzungseffizienz und letztlich die zelluläre Aktivität eines Transkripts verändern. Mehrere experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNA zu untersuchen, obwohl einige dieser Methoden Einschränkungen haben, die die ordnungsgemäße Untersuchung der posttranskriptiellen Modulation verhindern. Ein Promotor-Induktionssystem kann ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors ausdrücken. Diese Methode ermöglicht die Halbwertszeitschätzung einer gegebenen mRNA unter jeder experimentellen Bedingung ohne störende Zellhomöostase. Ein großer Nachteil dieser Methode ist die Notwendigkeit, Zellen zu transfekten, was den Einsatz dieser Technik in isolierten Primärzellen einschränkt, die sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken sind. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden ausgiebig verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolar-Epithels zu untersuchen. Die einzigartigen Eigenschaften und der Phänotyp der primären Alveolarzellen machen es wichtig, die posttranskriptionalen Modulationen von Genen zu untersuchen, die für diese Zellen von Interesse sind. Daher war es unser Ziel, ein neuartiges Werkzeug zu entwickeln, um die posttranskriptionischen Modulationen von mRNAs von Interesse in alveolar epitheliaalen Zellen in der Primärkultur zu untersuchen. Wir haben ein schnelles und effizientes transientes Transfektionsprotokoll entwickelt, um ein transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem in primäre Alveolar-Epithelzellen einzufügen. Diese Klonstrategie, die ein virales Epitop verwendet, um das Konstrukt zu markieren, ermöglicht die einfache Diskriminierung des Konstruktausdrucks von der von endogenen mRNAs. Mit der modifizierten Methode des Quantifizierungszyklus (Cq) kann die Expression des Transkripts dann in verschiedenen Zeitintervallen quantifiziert werden, um seine Halbwertszeit zu messen. Unsere Daten zeigen die Effizienz dieses neuartigen Ansatzes bei der Untersuchung der posttranskriptionalen Regulation unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen in primären Alveolarepithelzellen.

Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um ein Tet-Off-Transkriptions-Expressionssystem zu generieren, um die Bedeutung verschiedener Teile des UTR von ENaC 3 für die Modulation der Transkriptstabilität in primären Alveolar-Epithelzellen zu bewerten.
Der erste Schritt bei der Implementierung dieses Systems bestand darin, eine schnelle, einfache und effiziente Transfektionstechnik für alveolare Epithelzellen in der Primärku...

Hier stellen wir ein Werkzeug vor, mit dem die posttranskriptionische Modulation eines Transkripts in primären Alveolarepithelzellen mithilfe eines induzierbaren Expressionssystems, das an eine Pipettenelektroporationstechnik gekoppelt ist, untersucht werden kann.

Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

So ermöglicht unser Modell die Untersuchung der post-transkriptionellen Modulation eines bestimmten Transkripts in alveolar epitheliale Zellen in der Primärkultur und ihre physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Die transiente Transfektion von primären alveolären Epithelzellen hat also nur minimale Auswirkungen auf die Zellphysiologie und den Stoffwechsel, was einen klaren Vorteil gegenüber klassischen Protokollen mit Transkriptionsinhibitoren darstellt. Für die Erzeugung eines Antwortplasmids, das ein Gen von Interesse ausdrückt, müssen die Sequenz des Gens und die mehrfachen Klonstellen des induzierbaren Vektors analysiert werden, um die Erkennungssequenzen in den mehreren Klonstellen zu identifizieren, die intern im Gen nicht vorhanden sind.Mit High-Fidelity-Taq-Polymerase und Standard-ÜberlappungPCR-Techniken, flankieren Sie das Gen von Interesse mit zwei ausgewählten Restriktions-Enzym-Erkennungsstellen mit Designer-Primern. Eine Sequenz bei der Codierung des V5-Epitops vor dem Gen von Interesse muss enthalten sein, um die Expression des transfizierten Gens von der endogenen Expression zu unterscheiden. Mutanten können durch sequenzielles Löschen erzeugt werden, um die Auswirkungen verschiedener drei erlesener Hauptregionen auf die Stabilität der mRNA des Gens mithilfe von Reverse Primern zu untersuchen, die eine Polyadenylierungsstelle kodieren, die nach und nach das drei Primendedes der nicht übersetzten Region löscht.Letztlich kann die Einfügung des Gens von Interesse durch Eine Restriktionsanalyse bestätigt werden. Die Genorientierung und das Fehlen von Mutationen, die möglicherweise während der rtPCR eingeführt werden, können durch Sequenzierung bestätigt werden. Für die Transfektion der primären Rattenlunge Typ zwei Alveolar Epithelzellen, Samen der Zellen bei einem mal 10 bis sechs Zentimeter pro Quadratzentimeter in 100 Millimeter Petrischalen in Gegenwart von vollständigen minimalen essentiellen Medium.Kultur für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Am nächsten Tag 500 Mikroliter komplettes Medium ohne Antibiotikum in jeden Brunnen einer neuen 12-Brunnenplatte geben und die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius vorwärmen. Während dieser Inkubation fügen Sie ein Mikrogramm des Reaktionsplasmids und ein Mikrogramm regulatorischen Vektors zu einem 1,5 Milliliter-Rohr pro Brunnen hinzu.Waschen Sie die Alveolar-Epithelzellen mit 10 Millilitern pro Brunnen von 37 Grad Celsius PBS ohne Kalzium oder Magnesium und behandeln Sie die Zellen mit fünf Millilitern pro Brunnen von 37 Grad Celsius 0,05%Trypsin für zwei bis vier Minuten im Zellkultur-Inkubator. Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern pro Brunnen des kompletten Mediums ohne Antibiotikum und sammeln Sie die Zellen in einer neuen 50-Milliliter-Röhre. Waschen Sie die Schale mit vier Milliliterfrischem Medium, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren.Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS für das Zählen und Zentrifugieren der Zellen wieder aus. Setzen Sie das Pellet mit einer Dichte von viermal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter Resuspensionspuffer aus und fügen Sie den fünften Zellen mit sanfter Mischung viermal 10 zu den fünften Zellen hinzu. Legen Sie ein Rohr in die Elektroporationsvorrichtung und füllen Sie das Rohr mit 3,5 Milliliter elektrolytischen Puffer.Drücken Sie den Kolben vollständig, um eine vergoldete Elektrodenspitze in eine Pipette einzufügen, und mischen Sie den Rohrinhalt vorsichtig. Die Zellen vorsichtig mit einer Pipette ansaugen und die Pipette in die Elektroporationsstation einlegen, bis ein Klickton ertönt. Wählen Sie das entsprechende Elektroporationsprotokoll für Alveolar-Epithelzellen aus und drücken Sie Start auf dem Touchscreen.Unmittelbar nach der Transfektion die Pipette entfernen und die Zellen in einen Brunnen der vorgewärmten 12 Brunnenplatte übertragen. Wenn alle Zellen elektropoiert und plattiert wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen durch ein komplettes Medium mit Antibiotika nach zwei Tagen. Der Erfolg der Transfektion kann durch die Expression von EGFP bestätigt werden, wie sie durch Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie mit einem Kontrollvektor beobachtet wird.Um die Transkription des Gens von Interesse zu hemmen, ersetzen 72 Stunden nach der Transfektion den Überstand durch einen Milliliter pro Brunnen des kompletten Mediums, ergänzt durch ein Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetes Addoxycyclin. Um die mRNA-Halbwertszeit des gens von Interesse zu bewerten, geben Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator von 15 Minuten bis sechs Stunden zurück. Waschen Sie einen gut mit einem Milliliter eiskaltes PBS, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikroliter Lysepuffer aus einem handelsüblichen Phenolchlorform-RNA-Extraktionskit und sanftem Schütteln zu jedem experimentellen Zeitpunkt lysieren.Isolieren Sie dann die RNA gemäß den Kit-Anweisungen und bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 Nanometern. Um die Stabilität der isolierten RNA zu bestimmen, behandeln Sie zunächst ein Mikrogramm der gesamten RNA aus jeder Probe mit RNase freier DNase, um alle Plasmid-DNA-Spuren zu entfernen. Verwenden Sie ein handelsübliches cDNA-Synthesekit mit einer Mischung aus Oligo dT und zufälligen Hexomer-Primern, um die Reverse-Transkriptionseffizienz zu verbessern, um die DNA-erschöpfte Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA umzuschreiben.Fügen Sie 180 Mikroliter molekularbiologisches Wasser zu den 20 Mikrolitern des Reaktionsmixes hinzu, um die cDNA-Reaktion bei einer Konzentration von fünf Nanogramm pro Mikroliter zu verdünnen und sofort den cDNA-Mix mit frischem molekularbiologischem Wasser zu verdünnen, um eine Konzentration von 1,25 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Kombinieren Sie fünf Mikroliter Cyber-Grünfarbstoff-Master-Mix mit 0,1 Mikroliter molekularbiologischem Wasser, 0,45 Mikroliter 7,5 Mikromolchen-Vorwärtsgrundierung, 0,45 Mikroliter 7,5 Mikromol-Reverse-Primer und vier Mikroliter 1,25 Nanogramm pro Mikroliter cDNA, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 Mikrolitern zu erhalten. Legen Sie die Proben in einen qPCR-Thermocycler und verstärken Sie das V5-Tag-Gen von Interesse und Tetrocyclin-Transaktivator-Advance-Amplicons unter Verwendung der angegebenen qPCR-Bedingungen und erzeugen Sie eine hochauflösende Schmelzkurve, um die spezifischen Schmelztemperaturen der gewünschten Amplicons zu bewerten und das Fehlen von Rauschamplikonspitzen zu gewährleisten.Diese Pipettenelektroporationstechnik ermöglicht eine Transfektionseffizienz rate von 25 bis 30%, wie sie anhand der durch Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesenen Verhältnisse von EGFP-Zellen beobachtet wird. Die Behandlung von Alveolar-Epithelzellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin hat keinen signifikanten Einfluss auf die Expression endogener Alpha-ENaC-mRNA zu irgendeinem Zeitpunkt während des Behandlungszeitraums. Mit Hilfe eines transkriptionsgesteuerten Plasmidexpressionssystems, wie gezeigt, konnte das V5 alpha ENaC-Signal gemäß dem fortgeschrittenen Tetracyclin-Transaktivator normalisiert werden, um die Effizienz der Transfektion mit der Methode des doppelten Delta-Quantifizierungszyklus zu bestimmen.Die Halbwertszeit von alpha ENaC mRNA ist in Gegenwart des Tetracyclin-Off-Systems bis zu siebenmal kürzer als in Gegenwart von Actinomycin D, was bestätigt, dass Actinomycin D zu einer artefaktischen Alpha-ENaC-mRNA-Stabilisierung führt. Darüber hinaus verringerte die Cyclohexamid- und Tumornekrosefaktor-Alpha-Behandlung die Stabilität des Transkripts signifikant, während Lipopolysaccharide dies nicht tun. Signifikante Veränderungen in der Modulation der V5 alpha ENaC mRNA-Stabilität können in Abhängigkeit von den gelöschten und eingeschlossenen Regionen der drei wichtigsten unübersetzten Regionen induziert werden.Darüber hinaus verringert die Überexpression spezifischer RNA-bindender Proteine die Stabilität von 5-alpha ENaC mRNA im Vergleich zur Transfektion mit einem leeren pcDNA-Drei-Plasmid. Dieses Tool wird nützlich sein, um neue Erkenntnisse über die posttranskriptionelle Regulation von Schlüsselgenen, die in die Funktion des Alveolarepithels und deren physiologische oder pathologische Bedingungen involviert sind, zu hinterfragen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Transgene Mäuse, oder virale Vektoren verwendet, um Protein-Expression in der Lunge verbessern. Allerdings sind diese Techniken zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und haben Off-Target-Effekte, die Ergebnisse verwechseln kann. Unser Protein Transfektionsprotokoll verwendet eine Lipidbasis Transfektionsreagenz und einer ultrafeinen Feinzerstäuber gleichmäßig liefern aktives Protein zu Lungenzellen.

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Primäre menschliche Bronchialepithelzellen sind schwer zu transduzieren. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von Lentiviren und deren Konzentration sowie die optimalen Kulturbedingungen, die notwendig sind, um in diesen Zellen während der Differenzierung zu einem pseudostratifizierten Epithel hocheffiziente Transduktionen zu erzielen.

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Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen (Video) | JoVE Journal

Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen

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