Name: Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie die Herstellung hochtiterinfektiöser Influenza-Pseudotyppartikel mit Hüllglykoproteinen aus H5N1- und H7N9-Viren. Diese Methode ermöglicht Infektivitätsstudien in BSL-2-Laboren.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien von Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science and Technologieschlüsselprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) und Kommunales autonomes Anwendungsprojekt hangzhou für soziale Entwicklung und wissenschaftliche Forschung (Grant Numbers, 20191203B134).

1. Tag 1: Zellkultur und Seeding
<ol><li>Kultivieren Sie menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T/17 Zellen in 60 mm Schalen mit Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (DMEM Complete Medium, DCM) in einem 37 °C, 5% Kohlendioxid (CO2) Inkubator bis ca. 80% Confluent. HINWEIS: HEK 293T/17 Arme-Durchgangszellen werden empfohlen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) 1x. HINWEIS: Die manuelle Handhabung der HEK 293T/17-Zellen muss sehr schonend sein, da sie sich leicht lösen.</li>
	<li>Entfernen Sie PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin-Ethylendin-Tetraessigsäure (EDTA)-Lösung. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für nicht mehr als 5 min, bis die Zellen dissoziiert sind.</li>
	<li>Deaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 5 ml DCM hinzufügen. Dispergieren Sie die Zellen in eine einzellige Suspension, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein vorgechilltes 15 ml Zentrifugenrohr. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Dekant so viel von dem Überstand wie möglich. Setzen Sie das Zellpellet mit 6 ml DCM-Medium aus und zählen Sie die Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1 x 106 Zellen/ml mit DCM-Medium.</li>
	<li>Säen Sie die Zellen in eine 6 Brunnenplatte mit 1 ml Zellsuspension pro Brunnen. Klopfen Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (14-16 h) in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
</ol>2. Tag 2: Vier-Plasmid-Cotransfektion durch Lipofection vermittelt
<ol><li>Überprüfen Sie die Zellmorphologie und -dichte unter einem invertierten Lichtmikroskop. Idealerweise sollten Zellen bei Transfektion etwa 85 % konfluent sein. Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml serumfreies DMEM-Medium pro Brunnen, und legen Sie die Platte dann wieder in den Inkubator. HINWEIS: Die manuelle Handhabung der HEK 293T/17-Zellen muss sehr schonend sein, da sie sich leicht lösen.</li>
	<li>Für jeden Zutransfizierten Brunnen kultivierter Zellen 8 l des Transfektionsreageims auf ein Volumen von 150 l mit reduziertem Serummedium (Tube 1) verdünnen. Sanft mischen und 5 min bei Raumtemperatur (RT, ca. 20 °C) inkubieren. HINWEIS: Bereiten Sie für jede Transfektionsprobe zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre mit den Nummern 1 und 2 vor.</li>
	<li>In Tube 2 verdünnen Sie 2,5 g Plasmid-DNA in 150 l reduziertes Serummedium. HINWEIS: In Tube 2 jede Plasmid-DNA, wie in Tabelle 1dargestellt, verdünnen. A plasmid encoding vesicular stomatitis virus (VSV) G glycoprotein (plasmid pLP-VSVG) was used as a positive control, because VSV is able to infect a wide range of cells. Negative Kontrollpartikel ohne Influenza-Hüllkurven-Glykoproteine (env pps) wurden mit pcDNA-Gag-Pol und pcDNA-GFP-Plasmiden erzeugt.</li>
	<li>Kombinieren Sie nach einer Inkubation von 5 min die verdünnte DNA mit einem verdünnten Transfektionsreagenz. Mischen Sie sanft und brüten für weitere 15 min bei RT.</li>
	<li>Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex in den entsprechenden Brunnen, der die Zellen und das serumfreie Medium enthält. Mischen Sie sanft, indem Sie die Platte hin und her schaukeln.</li>
	<li>Nach der Inkubation für 4–6 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, entfernen Sie das Medium, und ersetzen Sie durch 2 ml DMEM. Inkubieren Sie für weitere 36–48 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. HINWEIS: Ersetzen Sie dies durch serum- und antikörperfreies DMEM. In diesem Protokoll können zwei HAs und zwei NAs verwendet werden, um acht Arten von pps zu generieren (siehe Tabelle 1).</li>
</ol>3. Tag 3: Anfällige Zellen Seeding
<ol><li>Für den Infektiositätstest säen Sie jede Art von anfälligen Zellen bei 1 x 104 Zellen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte. HINWEIS: Verwenden Sie zwei Arten von Zielzellen, um den Infektiositätstest in diesem Artikel durchzuführen: eine alveolarabgeleitete menschliche Zelllinie (A549-Zellen) und die Madin-Darby-Canine Kidney(MDCK)-Zellen. MDCK-Zellen sind weit verbreitet in der Grippeforschung und können eine gute Kontrolle sein. Dieser Schritt ist flexibel. Alle anderen Zielzelllinien können je nach Forschungsbedarf verwendet werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte über Nacht (14-16 h) in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
</ol>4. Tag 4: Pseudotypisierte Virale Partikelsammlung, Quantifizierung und Infektiositätstest
<ol><li>Pseudotypisierte virale Partikelsammlung<ol>
<li>Überprüfen Sie die Farbe des Mediums. Idealerweise sollte es hellrosa oder leicht orange sein. Untersuchen Sie die Zellen mit einem invertierten fluoreszierenden biologischen Mikroskop unter 440–460 nm.</li>
		<li>Bei 36–48 h Nachtransfektion ernten Sie die pps, indem Sie einen 0,45 m Polyvinylidenfluorid -Membranfilter (PVDF) passieren, um Zellablagerungen zu beseitigen.</li>
		<li>Teilen Sie die pps in kleine Volumen-Aliquots auf.</li>
		<li>Bewahren Sie die pps bei -80 °C auf. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Dies wird jedoch nicht gefördert, da die Infektiosität der pps nach dem Einfrieren und Auftauen stark abnehmen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pseudotypisierte virale Partikelquantifizierung<ol>
<li>20 l gereinigte pps auf ein 1,5 ml Ribonuklease (RNase)-freies Mikrozentrifugenrohr übertragen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 l von 0,24 U/ml Benzonase-Nuklease hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um jegliche DNA- und RNA-Kontamination zu beseitigen. HINWEIS: Ziel-RNA, häufig downreguliertes Cytomegalievirus (CMV)-GFP-RNA, ist in den pps verpackt und kann vermeiden, durch Benzonase-Nuklease abgebaut zu werden.</li>
		<li>Die Probe bei -70 °C einfrieren, um die Benzonase-Nuklease zu inaktivieren.</li>
		<li>Fügen Sie 2 L Proteinase K. Inkubieren bei 50 °C für 30 min, um die Hüllhautproteine zu verdauen und die CMV-GFP-RNA freizusetzen. Die Proteinase K bei 100 °C für 3 min inaktivieren.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die pps durch quantitative Reverse-Transkription (qRT)-PCR in Echtzeit mit einem Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit, mit dem Vorwärtsprimer 5'-AACAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', dem Reverse Primer 5'-GGGTCTCTTCAGAGTGATTGGATTGACTAC-3', und der Sonde 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', auf einem Echtzeit-PCR-Thermocycler. Normalisieren Sie die pps für RNA-Kopiernummer vor der Infektiosität.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infektiitätstest<ol>
<li>Verdünnen Sie jede Pps-Art in Bezug auf die qRT-PCR-Daten auf 4 x 105 Kopien/ml (pp Normalisierung).</li>
		<li>Fügen Sie Tosyl-Phenylalanin Chloromethyl-Keton (TPCK)-Trypsin zu einer Endkonzentration von 40 g/ml in pps hinzu, die H7N9 HA enthalten. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um seine funktionalen Untereinheiten HA1 und HA2 zu bilden. HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die pps, die H5 beherbergen, mit TPCK-Trypsin zu behandeln, da sie mehrere Arginin- und Lysinrückstände an der HA1-HA2-Spaltungsstelle haben. Diese multi-basic Spaltung Sekolleté-Site kann durch allgegenwärtige zelluläre Proteasen zerklaut taufen.</li>
		<li>Mischen Sie normalisierte pps mit DMEM medium (serumfrei) im Verhältnis 1:1 (Volumen/Volumen).</li>
		<li>Bringen Sie die Platte mit anfälligen Zellen in den Biosicherheitsschrank.</li>
		<li>Den Überstand ansaugen und die Zellen einmal mit 0,1 ml vorgewärmtem PBS waschen.</li>
		<li>0,1 ml pps-DMEM-Mischung zu einem Brunnen geben. Dreifache Infektiitätstests jeder Pps-Typs auf eine anfällige Zelllinie (überblickt in Abbildung 2).</li>
		<li>Inkubieren Sie die 96-Wellplatte für 4–6 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und ersetzen Sie mit 0,1 ml DCM.</li>
		<li>Inkubieren Sie die 96-Wellplatte für weitere 24–36 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tag 5 oder 6: Infektiositätserkennung
<ol><li>Bringen Sie die 96 Well Platte in den Biosicherheitsschrank.</li>
	<li>Den Überstand ansaugen und die Zellen 1x mit 0,2 ml vorgewärmten PBS waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 0,1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung.</li>
	<li>Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 3 min, bis die Zellen getrennt sind. HINWEIS: Vermeiden Sie eine Inkubation für mehr als 5 min, da dies zu Zellverklumpungen führt.</li>
	<li>Deaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 0,4 ml DCM hinzufügen.</li>
	<li>Dispergieren Sie die Zellen in einzellige Suspension, indem Sie mehrmals nach oben und unten pipetieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein gekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Bestimmen Sie die GFP-Reporter-positiven Zellen mit Fluoreszenz Activated Cell Sorting (FACS). ANMERKUNG: Um das Verhältnis der GFP-Reporter-positiven Zielzellen zu bestimmen, legen Sie die Durchflusszytometer-Gatter mithilfe der Kontrollproben (pps-unbehandelte A549-Zellen oder MDCK-Zellen) fest, und zählen Sie dann die GFP-Reporter-positiven Zellen von 10.000 Zellen pro Probe.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Pseudotyppartikeln (pp) des Influenzavirus in einer BSL-2-Einstellung. Das Reporter-Plasmid pcDNA-GFP ist in die pps integriert und kann verwendet werden, um pps von FACS in einem Infektiositätstest zu quantifizieren. Wir haben uns für zwei Arten von anfälligen Zelllinien entschieden, weil sie in der Grippeforschung weit verbreitet sind. MDCK-Zellen würden eine gute Kontrolle für die variablen verewigten menschlichen Zellen bieten, die in diesen Studien...

Die Mission eines viralen Teilchens besteht darin, sein Genom von einer infizierten Wirtszelle in eine nicht infizierte Wirtszelle zu transportieren und in einer replikationskompetenten Form1in das Zytoplasma oder den Zellkern zu liefern. Dieser Prozess wird zunächst durch Bindung an Wirtzellrezeptoren ausgelöst, gefolgt von der Fusion von Virion und Zellmembranen. Für umhüllte Viren, wie Influenzaviren, sind die Spike-Glykoproteine für die Rezeptorbindung und Fusion1,2verantwortlich. Virale Hüllkinkoproteine (z.B. Pyrogene, Antigene) sind an vielen wichtigen Eigenschaften und Ereignissen beteiligt, wie z. B. Viruslebenszyklusinitiierung (Bindung und Fusion), virale Pathogenese, Immunogenität, Wirtszellapoptose und zellulärer Tropismus, der zelluläre endozytische Weg, sowie die Übertragung und Neusortierung zwischen Denspezies1,3,4,5,6,7. Die Forschung an viralen Hüllproteinen wird uns helfen, viele Aspekte des Virusinfektionsprozesses zu verstehen. Pseudotypisierte Viruspartikel (pp), auch Pseudovirions oder Pseudopartikel bezeichnet, können durch eine Pseudotypisierungstechnik8,9,10erzeugt werden. Diese Technologie wurde verwendet, um pseudotypisierte Partikel vieler Viren zu entwickeln, einschließlich Hepatitis C11,12, Hepatitis B13, vesikuläre Stomatitis Virus (VSV)14,15, und Influenza-Virus16,17,18,19. Diese Technologie basiert auf dem Gag-Pol-Protein von Lentiviren oder anderen Retroviren.
Pseudotypisierte Viruspartikel können mit einem Drei-Plasmid-System gewonnen werden, indem ein virales Hüllprotein-Expressionsplasmid, ein retrovirales Verpackungsplasmid, das das Hüllen-Env-Gen fehlt, und ein separates Reporter-Plasmid in pp-Produzentenzellen kotransfiziert werden. Das Retrovirus wird durch sein Gag-Protein zusammengesetzt, und es knospen aus einer infizierten Zellmembran, die das Virus Hülle Protein1ausdrückt. Daher ist es möglich, mit dem Retrovirus Gag-Protein mit hilfe des Retrovirus Gag-Proteins grippereiche Pnospen auf einer Zellmembran zu erhalten, die Influenza HA und NA exekliniert. In unseren früheren Studien waren HAs/NAs in allen Kombinationen funktional und in der Lage, ihre entsprechenden Funktionen im viralen Lebenszyklus16,17,18,20,21auszuführen. Diese pps werden verwendet, um biologische Influenza-Eigenschaften zu untersuchen, einschließlich Hämagglutination, Neuraminidase-Aktivität, HA-Rezeptor-Bindung Tropismus, und Infektiosität. Da HA und NA wichtige oberflächenfunktionelle Proteine im viralen Lebenszyklus sind, können nicht übereinstimmende HAs und NAs, die aus verschiedenen Grippestämmen abgeleitet sind, teilweise eine Neusortierung zwischen ihnen nachweisen. Hier erzeugen wir acht Arten von Influenza-Pps, indem wir zwei HAs und zwei NAs (abgeleitet vom HPAI H5N1-Stamm und dem H7N9-Fleck) mit einem Drei-Plasmid-Pseudotypisierungssystem kombinieren. Diese acht Arten von pps umfassen zwei native pps, H5N1pp, H7N9pp; zwei nicht übereinstimmende pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; und vier Pps, die nur ein einzelnes Glykoprotein (HA oder NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp beherbergen. Studien zum Influenzavirus, wie H5N1 und H7N9, sind durch Biosicherheitsanforderungen begrenzt. Alle Untersuchungen der Wildinfluenza-Virusstämme sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden. Die pseudotypisierte virale Partikeltechnologie kann verwendet werden, um ein künstliches Virion in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) zu verpacken. Daher stellen pps ein sichereres und nützliches Werkzeug dar, um die Influenza-Virusprozesse in Abhängigkeit von seinen beiden wichtigsten Glykoproteinen zu untersuchen: Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA).
Dieses Protokoll beschreibt die Generierung dieser pps mit einer Drei-Plasmid-Kotransfektionsstrategie (im Überblick in Abbildung 1), wie pps zu quantifizieren und Infektiositätsnachweis. Die pp-Produktion umfasst drei Arten von Plasmiden (Abbildung 1). Das Gag-Pol-Gen, das das Retrovirus Gag-Pol-Protein kodiert, wurde aus einem Retrovirus-Verpackungskit geklont und in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und mit dem Namen pcDNA-Gag-Pol aufgenommen. Das verbesserte Grüne fluoreszierende Protein (eGFP) Gen, das grünes Fluoreszenzprotein kodiert, wurde aus dem pTRE-EGFP-Vektor geklont, in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und als pcDNA-GFP bezeichnet. Beim Klonen wurde über eine Grundierung eine Verpackungssignalsequenz hinzugefügt. Die HA- und NA-Gene wurden in ein pVRC-Plasmid namens pVRC-HA bzw. pVRC-NA geklont. Das letzte Plasmid kodiert das Fusionsprotein und kann durch jedes andere Fusionsprotein von Interesse ersetzt werden. Unsere Pseudotypisierungsplattform umfasst zwei Glykoproteinexpressionsplasmide: pVRC-HA und pVRC-NA. Dies kann die Forschung zur Neusortierung zwischen verschiedenen Virusstämmen in einer BSL-2-Einstellung vereinfachen.

<table><tbody><tr><td>Benzonase-Nuklease</td><td>Millipore</td><td>70664</td><td>Effektive Viskositätsreduzierung und Entfernung von Nukleinsäuren aus Proteinlösungen</td></tr><tr><td>Durchsichtige Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit flachem Boden (96 Well)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Behandelt für optimale Zelladhäsion Sterilisiert durch Gammastrahlung und zertifiziert pyrogen Individuelle alphanumerische Codes zur Identifizierung</td></tr> <tr><td>von VertiefungenKlare, TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten (6 Wells)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Individuelle alphanumerische Codes für die Well-Identifizierung Behandelt für eine optimale Zelladhäsion Sterilisiert durch Gammabestrahlung</td></tr><tr><td>Dulbecco's modified essential medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums vieler verschiedener Säugetierzellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Excell</td><td>FND500</td><td>fötale Rinderseren, die ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis für grundlegende Zellkulturen, Spezialforschung und spezifische Assays bieten</td></tr><tr><td>Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)</td><td>Beckman-Schar-Cytoflex</td><td></td><td>Humanes</td></tr><tr><td>Alveolär-Adenokarzinom A549-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Humane embryonale Niere (HEK) HEK-293T/17-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Ein vielseitiges Transfektionsreagenz, das nachweislich die unterschiedlichsten adhärenten und suspensionsgebundenen Zelllinien effektiv transfiziert</td></tr><tr><td>Inverses fluoreszierendes biologisches Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Schneller, sensitiver und präziser sondenbasierter qPCR-Nachweis und Quantifizierung von Ziel-RNA-Zielen.</td></tr><tr><td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td><td>NEB</td><td>E3006L</td><td>Hält bis zu 14.000 RCF RNase-/DNase-freien nichtpyrogenen</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen</td><td>stand ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm, gammasterilisierte</td></tr><tr><td>Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 & Mikro; m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>ein verbessertes Minimal Essential Medium (MEM), das eine Reduzierung der Supplementierung mit fötalem Rinderserum um mindestens 50% ermöglicht, ohne dass sich die Zellwachstumsrate oder -morphologie ändert. Opti-MEM I medium wird auch für die Verwendung mit kationischen Lipidtransfektionsreagenzien, wie z. B. Lipofectamine Reagenz, empfohlen.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>Die Antibiotika Penicillin und Streptomycin werden aufgrund ihrer wirksamen kombinierten Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien eingesetzt, um eine bakterielle Kontamination von Zellkulturen zu verhindern.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Maximale RZB beträgt 12.500 xg Temperaturbereich von -80 &de; C bis 120 &Grad; C RNase-/DNase-free Sterile</td></tr><tr><td>PP-Zentrifugenröhrchen (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>eine stabile und hochreaktive Serinprotease</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>Behandelt für eine optimale Zelladhäsion Sterilisiert durch Gammastrahlung und zertifiziert pyrogenfreie</td></tr>, <tr><td>TC-behandelte Kulturschale (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Trypsin aus der Rinderpankreas TPCK-behandeltes, im Wesentlichen salzfreies, lyophilisiertes Pulver, &ge; 10.000 BAEE-Einheiten/mg Protein</td></tr><tr><td>TPCK-Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>Diese flüssige Formulierung von Trypsin enthält EDTA und Phenolrot. Gibco Trypsin-EDTA wird aus Trypsinpulver hergestellt, einer bestrahlten Mischung von Proteasen, die aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins gewonnen werden. Aufgrund seiner verdauungsfördernden Kraft wird Trypsin häufig für die Zelldissoziation, die routinemäßige Zellkulturpassage und die Dissoziation des primären Gewebes verwendet. Die für die Dissoziation erforderliche Trypsinkonzentration variiert je nach Zelltyp und experimentellen Anforderungen.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von hochtiterinfektiösen influenza-pseudotyppartikeln mit hülllykoproteinen aus hoch pathogenen h5n1- und avian h7n9-viren

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Die gelegentliche direkte Übertragung des hoch pathogenen Aviären Influenza-A-Virus H5N1 (HPAI H5N1) und H7N9 auf den Menschen und ihre Letalität sind ernste Probleme der öffentlichen Gesundheit und deuten auf die Möglichkeit einer Epidemie hin. Unser molekulares Verständnis des Virus ist jedoch rudimentär, und es ist notwendig, die biologischen Eigenschaften seiner Hüllproteine als therapeutische Ziele zu untersuchen und Strategien zur Bekämpfung von Infektionen zu entwickeln. Wir entwickelten eine solide virale pseudotypisierte Partikel-(pp)-Plattform zur Untersuchung des Aviären Influenzavirus, einschließlich der funktionellen Analyse seiner Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllproteine, die Neusortierungseigenschaften der HAs und NAs, Rezeptoren, Tropismen, neutralisierende Antikörper, Diagnose, Infektiosität, für die Zwecke der Arzneimittelentwicklung und Impfstoffentwicklung. Hier beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Ermittlung von pps mit den Hüllproteinen (HA, NA) aus zwei Influenza-A-Stämmen (HAPI H5N1 und 2013 avian H7N9). Ihre Erzeugung basiert auf der Fähigkeit einiger Viren, wie dem murinen Leukämievirus (MLV), Hüllglykoproteine in ein pp zu integrieren. Darüber hinaus beschreiben wir auch, wie diese pps mit RT-qPCR quantifiziert werden, und die Infektiositätserkennung von nativen und nicht übereinstimmenden Virus-Pps, abhängig vom Ursprung der HAs und NAs. Dieses System ist hochflexibel und anpassungsfähig und kann verwendet werden, um virale pps mit Hüll-Glykoproteinen herzustellen, die in jede andere Art von umhüllten Viren eingearbeitet werden können. So kann diese virale Partikelplattform verwendet werden, um Wildviren in vielen Forschungsuntersuchungen zu untersuchen.

Abhängig von dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren haben wir 10 Arten von pps erzeugt, die zwei Gruppen-HAs/NAs oder VSV-G-Glykoprotein oder No-Envelope-Glykoproteine kombinieren (siehe Tabelle 1). Sieben von ihnen sind ansteckend. Die pps, die no-envelope Glycoprotein oder nur Hafen NA beherbergen, zeigten hier keine Infektiosität. Das Herstellungsverfahren für Influenza pp ist in Abbildung 1dargestellt. Transmissionselektronenmikroskopie von pps (z.B. H5N1pp) ist in...

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Prozess zur Herstellung hochtiter infektiöser viraler pseudotypisierter Partikel (pp) mit Hüllglykoproteinen aus zwei Influenza-A-Stämmen und wie ihre Infektiosität bestimmt werden kann. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig, um pps von jeder anderen Art von umhüllten Viren mit verschiedenen Hüll-Glykoproteinen zu entwickeln.

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Diese Technik der Herstellung von Influenza-Virus PP und der Bestimmung seiner Infektiosität kann die Erforschung des Influenzavirus in einer BSL-2-Stadt vereinfachen. Wir normalisierten die PPS für die Infektionen basierend auf qRT-PCR-Daten von PPS. Zwei Glykoprotein-Expressionsplasmide sind kodiert, was die Forschung über die Neusortierung von Viren vereinfachen kann.Überprüfen Sie einen Tag nach der Zellaussaat die Zellmorphologie und -dichte unter einem invertierten Lichtmikroskop. Idealerweise sollte die Zelle bei der Transfektion ca. 85% konfluent sein. Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter serumfreies DMEM pro Brunnen und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.Für jeden zu transfizierten Zellbrunnen acht Mikroliter des Transfektionsreagenzes auf ein Volumen von 150 Mikrolitern mit reduziertem Serummedium verdünnen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten sitzen. In der Zwischenzeit verdünnen Sie 2,5 Mikrogramm Plasmid-DNA in 158 Mikroliter reduzierten Serummediums.Nach der fünfminütigen Inkubation die verdünnte DNA mit verdünntem Transfektionsreagenz kombinieren, die Lösung vorsichtig mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur lassen. Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu den entsprechenden Brunnen mit den Zellen in serumfreiem Medium hinzu. Dann mischen Sie die Platte sanft, indem Sie hin und her schaukeln.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier bis sechs Stunden. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter DMEM pro Brunnen. Dann inkubieren Sie es für weitere 36 bis 48 Stunden.Samen jeder Art von anfälligen Zelle bei 10 000 Zellen pro Brunnen und eine 96 Well Platte. Dann lassen Sie die Platte über Nacht in einem 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator. Überprüfen Sie am dritten Tag nach der Transfektion die Farbe des Mediums, das rosa oder leicht orange leuchten soll, und untersuchen Sie die Zellen mit einem invertierten biologischen Mikroskop unter 440 bis 460 Nanometer Wellenlänge.Nach 38 bis 48 Stunden nach der Transfektion die pseuotypisierten Partikel oder PPS ernten, indem Sie sie durch einen 0,45 Mikrometer Polyvinyliden-Fluorid-Membranfilter passieren, um Zellablagerungen zu beseitigen, sie dann in kleine Mengen aliquots aufzuteilen und sie bei minus 80 Grad Celsius zu speichern. Zur Quantifizierung des PPS 30 Mikroliter der gereinigten Viruspartikel in ein 1,5 Mikroliter RNase-freies Rohr übertragen und einen Mikroliter Benzonase-Nuklease hinzufügen. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um jegliche DNA- und RNA-Kontamination zu beseitigen.Nach der Inkubation die Probe auf minus 70 Grad Celsius einfrieren, um die Nuklease zu aktivieren und zwei Mikroliter Proteinase K.Inkubieren Sie die Mischung für 30 Minuten, um die Hüllproteine zu verdauen und die CMV-GFP-RNA freizusetzen. Dann inaktiv die Proteinase K bei 100 Grad Celsius für drei Minuten. Quantifizieren Sie die PPS mit quantitativer Reverse-Transkription RTPCR mit dem Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit in den primern und sonden im Textmanuskript angegeben.Normalisieren Sie die PPS auf viermal 10 bis 5 RNA-Kopien pro Milliliter. Fügen Sie dann TPCK-Trypsin zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in das PPS, das H7N9-Hemagglutinin beherbergt. Inkubieren Sie das PPS bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die funktionalen Untereinheiten HA1 und HA2 zu bilden.Mischen Sie die normalisierten PPS mit DMEM-Medium im Verhältnis eins zu eins, und bringen Sie dann die Platte mit anfälligen Zellen in den Biosicherheitsschrank. Den Überstand ansaugen und die Zellen einmal mit 100 Mikrolitern vorgewärmtem PBS waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter PPS-DMEM-Mischung in jeden Brunnen, dreifache Infektiositätstests jeder Art von PPS zu einer anfälligen Zelllinie.Inkubieren Sie die Platte für vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Dann den Überstand ansaugen und durch 100 Mikroliter DCM-Inkubation ersetzen, die Platte noch 24 bis 36 Stunden vor der Infektiositätserkennung. Unsere Ergebnisse sind PPS gelten jetzt als ansteckend für die Menschen.Daher werden notwendige Sicherheitsvorkehrungen empfohlen, wie das Tragen einer Maske und die Durchführung der Infektiositätstests in einem Biosicherheitsschrank. Dieses Protokoll wurde erzeugt, um 10 Arten von pseudotypisierten Partikeln oder PPS mit zwei gruppierten Hemaglutinin und Neuraminidase vesikuläre stomatitis Virus G G Glycoprotein oder keine Hüllhaut Glycoproteine zu generieren. Die PPS wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet und ihre Infektiosität wurden in zwei Zelllinien, A549 und MDCK, bewertet.In der PPS-Gruppe, die H5 beherbergt, betrug die Infektiosität von H5N1, H5 plus N9 und H5 etwa 90%18% bzw. 10% für die Zelllinie A549 bzw. 40%5% bzw. 5% für MDCK. In der PPS-Gruppe, die H7 beherbergt, betrug die Infektiosität von H7N9, H7 plus N1 und H7 etwa 10%7% bzw. 1% für die Zelllinie A549 bzw. 8%4% bzw. 1% für MDCK. Die Infektiosität des vesikulären Stomatitisvirus G G Glycoprotein PP betrug etwa 21% für A549 und 16% für MDCK-Zellen.Während die Delta-Hüllkurve Glykoproteine PP zeigte keine Infektiosität. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der PP-Produzent HEK-293T/17 Zellen bilden die Grundlage dieses Verfahrens. Das optimale Wachstum lehrt uns also HEK-293T/17 Zellen.Nach diesem Verfahren oder einem anderen Test, wie z. B. L2-Empfängnis, kann der Begrenzungstest durchgeführt werden. Dieser Assay kann fast die biologischen Besonderheiten der Rezeptorpräferenz loswerden und das Muster wird den Tropismus der PPS offenbaren. Da sie die Glykoproteine aus dem Influenzavirus genommen haben, werden sie in zwei plus max geklont.HA und die NA-Proteine können getrennt untersucht werden, so dass wir zwischen ihnen neu zu sanieren. Die Mutanten und die reifen Effekte können erforscht werden.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Erzeugung von Influenzavirus-ähnlichen Partikeln (VLPs) in einem Säugetiersystem. Nach der Expression von drei eukaryotischen Expressionsvektoren – die für verschiedene virale Strukturproteine kodieren – in geeigneten Säugetier-Wirtszellen ordnen sich die exprimierten viralen Proteine auf der Plasmamembran des Wirts selbst zu VLPs an und werden durch Knospung von der Zelloberfläche freigesetzt.

Eine Technik zur Erzeugung von Influenzavirus-ähnlichen Partikeln über ein Säugetiersystem

Das Video zeigt eine Methode zur Herstellung von kälteadaptierten rekombinanten Influenzaviren. Dabei werden menschliche Zellen mit bidirektionalen Plasmiden transfiziert, gefolgt von einer Inkubation bei niedrigeren Temperaturen, um Viren zu erhalten, die für die Impfstoffproduktion geeignet sind und sich durch eine verminderte Replikation unter wärmeren Bedingungen auszeichnen.

Erzeugung rekombinanter abgeschwächter Lebend-Influenzaviren für Impfstoffe

Hier beschreiben wir einen Weg, korrekt gefaltete und funktionelle Influenza-Virus-Oberflächenantigene von den neuen chinesischen H7N9-Virus in Insektenzellen abgeleitet auszudrücken. Die Technik lässt sich an beliebigen Ektodomänen viraler oder zellulärer Oberflächenproteine ​​exprimieren.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

Es besteht ein allgemeiner Mangel an Wissen darüber, wie Impfstoffe wirken. Hier schlagen wir die kombinierte Verwendung von reverser Genetik und chimären Knochenmarkmäusen vor, um Einblicke in die frühen Immunantworten des Wirts auf Impfstoffe zu erhalten, mit besonderem Fokus auf dendritische Zellen und T-Zell-Immunität.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Wir beschreiben eine Methode mit der identifizieren wir kritische Rückstände für die Bindung von menschlichen oder murinen monoklonalen Antikörpern, die die virale Hämagglutinin der Influenza A-Viren Zielen erforderlich. Das Protokoll kann zu anderen Virus Oberfläche Glykoproteine und ihre entsprechenden neutralisierende Antikörper angepasst werden.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur pseudotyped Partikel in eine Einstellung "BSL-2" unter Einbeziehung der Spike-Protein des hoch pathogenen Viren Nahen Osten respiratorisches Syndrom und Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronaviren zu generieren. Diese pseudotyped Partikel enthalten eine Luciferase Reporter-gen ermöglicht die Quantifizierung der Virus Eintritt in Zielzellen Host.

Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verpackung von Pseudoviren und die Messung der Antikörper-neutralisierenden Aktivität.

Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität

Das Protokoll beschreibt eine High-Throughput-Ansatz zur Bestimmung Strukturen von Membranproteinen mittels Kryo-Elektronen-Tomographie und 3D-Bildverarbeitung. Es deckt die Einzelheiten der Probenvorbereitung, Datenerfassung, Datenverarbeitung und-interpretation, und schließt mit der Produktion von einer repräsentativen Ziel für den Ansatz, die HIV-1 Envelope Glykoproteins. Diese Berechnungsverfahren sind in einer Weise, Forscher und Studenten ermöglicht, remote arbeiten und einen Beitrag zur...

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Eine Methode, um zu bewahren, zu erkennen und Sequenz der RNA von Vogelgrippeviren wurde validiert und erweitert mit natürlichen Kotproben von Vögeln. Diese Technik beseitigt die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung einer Kühlkette und Handhabung von infektiösen Viren und kann in einer 96-well High-Throughput-Setup verwendet werden.

Avian Influenza Surveillance mit FTA-Karten: Field Methods, Biosafety-und Transportprobleme gelöst

Lernen Sie die Herstellung hochtiterinfektiöser Influenza-Pseudotyppartikel mit Hüllglykoproteinen aus H5N1- und H7N9-Viren. Diese Methode ermöglicht Infektivitätsstudien in BSL-2-Laboren.

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren (Video) | JoVE Journal

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

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