Name: Charakterisierung der Exon-Skipping-Effizienz in DMD-Patientenproben in klinischen Studien mit Antisense-Oligonukleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Muskelgewebe-Präparation für Exon-Skipping-Studien bei Duchenne-Muskeldystrophie. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen von Dystrophin-Expression und Therapieeffizienz.

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Wir danken Dr. Takashi Saito, Dr. Tetsuya Nagata, Herrn Satoshi Masuda und Dr. Eri Takeshita für die wissenschaftliche Diskussion.

<ol><li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy%2C+part+2%3A+implementation+of+multidisciplinary+care%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li>
<li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+21+years+experience+in+Wales+%28UK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li>
<li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li>
<li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li>
<li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li>
<li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients%3A+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li>
<li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li>
<li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug%3A+Implications+for+FDA+Policy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li>
<li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065%2FNCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li>
<li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+%28Pre-%29Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467(2016).</li>
<li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807(2019).</li>
</ol>

Klinische Studien mit DMD haben in den letzten Jahren sowohl Erfolge als auch Misserfolge hervorgebracht. Sowohl RT-PCR als auch Western Blotting sind gängige Techniken zur Beurteilung der Überspringeffizienz, die durch Exon-Skipping-Verbindungen erzeugt wird, die den Patienten verabreicht werden. Es wurde jedoch berichtet, dass RT-PCR die Übersprungseffizienz im Vergleich zu digitaler PCR15überschätzt. Obwohl dies auf eine Reihe von Gründen zurückzuführen ist, wird es in erster Linie durch die effizientere Verstärkung der kleineren übersprungenen Fragmente während PCR-Zyklen verursacht. Es scheint, dass RT-PCR in dieser klinischen Studie verwendet auch höhere Überspringwirkung im Vergleich zu der Proteinexpression durch Western Blotting geschätzt erzeugt. Nach Angaben der FDA, Dies ist ein zuverlässiger Weg, um Dystrophin-Restauration zu quantifizieren12. Daher ist Vorsicht geboten, wenn die Ergebnisse von RT-PCR übersprungen werden; Die Proben können jedoch noch verglichen werden. Proben mit höheren Sprungeffizienzen auf basis der RT-PCR-Ergebnisse exhbit höhere Proteinexpressionsniveaus in westlichen Blot-Analysen.
Da alle Patienten in klinischen DMD-Studien nicht das gleiche Deletionsmuster aufweisen, kann es schwierig sein, Primer und Sonden zu entwerfen, die für die Durchführung digitaler oder qPCR-Tests auf allen Proben ausreichend spezifisch sind. Daher ist RT-PCR immer noch eine gute Alternative für eine erste Bewertung der Überspringeffizienz. Bevor die klinische Studie mit NS-065/NCNP-01 begann, war es mühsam, die Übersprungseffizienz für jeden Patienten in vitro zu bewerten, da entweder eine Muskel- oder Hautbiopsie obligatorisch war, um patientenspezifische Myoblasten zu erzeugen. Jedoch haben wir vor kurzem eine neuartige Technik veröffentlicht, um patientenspezifische MYOD1-konvertierte, urinabgeleitete Zellen (UDCs) als neuartiges DMD-Muskelzellmodell16zu generieren. Daher ist nur Urin vom Patienten gesammelt erforderlich, um die Myoblasten zu erzeugen, und kein invasives Verfahren ist notwendig. Wir glauben, dass diese Methode verwendet werden kann, um verschiedene AONs in patientenspezifischen Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus können verschiedene Primer und Sonden getestet werden, bevor der Patient eine klinische Studie beginnt. Dies kann den Einsatz von qPCR oder digitaler PCR für Exon-Skipping-Messungen in klinischen DMD-Studien in der Zukunft erleichtern.
Für die Durchführung der Western Blot-Analyse in dieser klinischen Studie wurde ein einziger Antikörper gegen Dystrophin verwendet, und nur eine gesunde Kontrolle wurde als Referenzprobe verwendet. Daher wurde die Spezifität des Antikörpers nicht angemessen validiert. Dies, zusammen mit der Tatsache, dass der Antikörper nur die C-Terminal-Domäne von Dystrophin erkennt, ist eine Einschränkung des Protokolls. Gesündere Kontrollen und Antikörper, die gegen verschiedene Bereiche des Dystrophinmoleküls gerichtet sind, sind in Zukunft ratsam.
Hier haben wir die Protokolle zusammengefasst, die in der jüngsten von Densaim initiierten, ersten studierten Studie mit NS-065/NCNP-01 verwendet wurden. NS-065/NCNP-01 ist potenziell für 10,1 % der Patienten mit DMD anwendbar.

Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine degenerative Muskelerkrankung verursacht progressiven Verlust der Muskelmasse, Ateminsuffizienz, und Kardiomyopathie, und es führt zu vorzeitigem Tod1. Die Krankheit wird durch einen Mangel an dem großen strukturellen Muskelprotein Dystrophin2verursacht. Mutationen im DMD-Gen auf dem X-Chromosom sind rezessiv, und die Krankheit betrifft 1 von 3500-5000 neugeborenen Männchen3,4,5. Die Mutationen sind oft große Deletionen in einem Hotspot-Bereich zwischen exons 44 und 55, die zu einem verzerrten Leserahmen und vorzeitigen Stop-Codons führen, was zu Unsinn-vermitteltem Zerfall und einem fast vollständigen Mangel an Dystrophin-Protein6,7,8führt. Der Leserahmen kann mit Antisense-Oligonukleotiden (AONs) korrigiert werden, die Exon-Überspringen und Wiederherstellen des Leserahmens induzieren, teilweise die Dystrophinexpression wiederherstellen und das Fortschreiten der Krankheit verzögern9,10,11. Der Morpholino AON eteplirsen, der kürzlich von der Federal Drug Agency (FDA) zugelassen wurde, induziert das Überspringen von Exon 51 und kann den Leserahmen bei Patienten mit Exon 52 Deletionen12,13wiederherstellen. Exon 53 skipping stellt jedoch den Leserahmen für Patienten mit Exon 52-Deletionen wieder her und kann potenziell etwa 10% der DMD-Patienten14behandeln. Das Morpholino-AON-Medikament NS-065/NCNP-01 hat gezeigt, dass Exon 53 in menschlichen Zellen und wir haben kürzlich NS-065/NCNP-01 an DMD-Patienten in einer phase 1 offenen klinischen Phase-1-Studie zur Dosiseskalation (nachfolgend "die Studie" genannt) (registriert als UMIN: 000010964 und ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14verabreicht. Die Studie zeigte eine dosisabhängige Zunahme von Exon 53 Skipping basierend auf RT-PCR und Dystrophin-Protein-Spiegel auf der Grundlage von westlichen Blotting, und keine schweren unerwünschten Arzneimittelereignisse oder Aussetzer wurden beobachtet14.
In allen klinischen Studien ist die Analyse der Ergebnisse von größter Bedeutung. Für klinische DMD-Studien wird noch über die beste Methode diskutiert, um einen Behandlungsvorteil zu zeigen. Klinische Tests wie der 6-minütige Walk-Test haben gewisse Nachteile. Die molekulare Charakterisierung der Dystrophinexpression kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wie Z. B. RT-PCR, qPCR, Digital-PCR, Western Blotting und Immunhistochemie. Das Ausmaß der Proteinexpressionswiederherstellung, das erforderlich ist, um einen klinischen Nutzen zu erzielen, bleibt jedoch unklar. In diesem Methodenartikel beschreiben wir detailliert die RT-PCR- und Western-Blotting-Methoden, die zur Bestimmung des Exon-Skipping- bzw. Proteinspiegels in der Phase-1-Studie des AON-Überspringmedikaments NS-065/NCNP-0114verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Takara</td><td>3407A</td><td>Markerlösung für MultiNA</td></tr><tr><td>1mol/l-Tris-HCl Pufferlösung (pH 7,6)</td><td>Nacalai</td><td>35436-01</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Nacalai</td><td>21418-42</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan (Isopentan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15-2220</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6&mal; Ladepuffer</td><td>Takara</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ME</td><td>Iwai Chemikalie</td><td>50013R</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 3730 DNA-Analysator</td><td>Applied Biosystems</td><td>A41046</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Nacalai</td><td>05808-61</td><td></td></tr><tr><td>Centri-Sep 96-Well-Platten</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4367819</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Blocking Reagenz</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>RPN418</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>GeneTools</td><td>2922498000</td><td></td></tr><tr><td>Experion Automatisierte Elektrophoresestation</td><td>Bio-Rad</td><td>7007010</td><td>Mikrochip-Elektrophoresesystem Ein</td></tr><tr><td>Experion DNA 1K-Analysekit für 10 Chips</td><td>Bio-Rad</td><td>7007107JA</td><td></td></tr><tr><td>Experion Priming Station</td><td>Bio-Rad</td><td>7007030</td><td></td></tr><tr><td>Experion Vortex Station II</td><td>Bio-Rad</td><td>7007043</td><td></td></tr><tr><td>Extra Thick Blot Filterpapier</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>EzBlot</td><td>Atto</td><td>AE-1460</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Nukleinsäure Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>Iwaki</td><td>1880 SV20</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Nacalai</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Histofine Simple Stain MAX PO</td><td>Nichirei</td><td>424151</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Transfermembran</td><td>Millipore</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>ITS Flüssigmedium Ergänzung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Klarer Klebefilm</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>SHIMADZU</td><td>MCE-202</td><td>Mikrochip-Elektrophoresesystem B</td></tr><tr><td>Multiplate 96-Well PCR-Platten</td><td>Bio-Rad</td><td>mlp9601</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Mikrovolumen UV-Vis Spektralphotometer mit Wi-Fi</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM Lyophilisierter monoklonaler Maus-Antikörper Dystrophin (C-Terminus)</td><td>Leica biosystems</td><td>NCL-DYS2</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM Lyophilisierter monoklonaler Maus-Antikörper Spectrin</td><td>Leica biosystems</td><td>NCL-SPEC1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetat-Proteingele</td><td>Invitrogen</td><td>EA03785BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidans</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS-Probe Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Probenreduktionsmittel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetat SDS Laufpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>Oriol Fluoreszierender Gelfleck</td><td>Bio-Rad</td><td>1610496</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung stabilisiert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Physcotron Handy Mikro-Homogenisator</td><td>MICROTEC</td><td>NS-310E3</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene Infektions-/Transfektionsreagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid-Färbelösung</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Fasergewebe Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74704</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Nacalai</td><td>31606-75</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Dry Transfer Maschine</td><td>Bio Craft</td><td>41-1293</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nukleinsäure Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>für MultiNA</td></tr><tr><td>TAE Puffer</td><td>Nacalai</td><td>35430-61</td><td></td></tr><tr><td>Traganth Gum</td><td>Wako</td><td>200-02245</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA Buffer</td><td>Nippon Gen</td><td>316-90025</td><td>für MultiNA</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Nacalai</td><td>35907-15</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Zelle</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung der exon-skipping-effizienz in dmd-patientenproben in klinischen studien mit antisense-oligonukleotiden

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine degenerative Muskelerkrankung, die progressiven Verlust der Muskelmasse verursacht, was zum vorzeitigen Tod. Die Mutationen verursachen oft einen verzerrten Leserahmen und vorzeitige Stop-Codons, was zu einem fast vollständigen Mangel an Dystrophin-Protein führt. Der Leserahmen kann mit Antisense-Oligonukleotiden (AONs) korrigiert werden, die exon skipping induzieren. Das Morpholino AON viltolarsen (Codename: NS-065/NCNP-01) hat gezeigt, dass exon 53 überspringen, wiederdenzielle den Leserahmen für Patienten mit Exon 52 Deletionen. Wir haben kürzlich NS-065/NCNP-01 intravenös an DMD-Patienten in einer von einem explorativen Prüfarzt initiierten, ersten am Menschen initiierten Studie mit NS-065/NCNP-01 verabreicht. In diesem Methodenartikel stellen wir die molekulare Charakterisierung der Dystrophinexpression mit Sanger-Sequenzierung, RT-PCR und Western Blotting in der klinischen Studie vor. Die Charakterisierung der Dystrophin-Expression war in der Studie für den Aufzeigen der Wirksamkeit von grundlegender Bedeutung, da keine funktionellen Ergebnistests durchgeführt wurden.

Um RT-PCR zum Erkennen von Exon-Skipping zu verwenden, wurden Primer auf beiden Seiten des Exons, die übersprungen werden, so konzipiert und ausgewertet, dass nur bestimmte Bänder ergeben (siehe Abbildung 2 für ein schematisches Diagramm des Exon-Springens und der Primer-Position). Die Primer sollten Produkte erzeugen, die leicht nach Größe auf einem MCE-System oder normaler Agarose-Gel-Elektrophorese unterschieden werden können, wenn MCE nicht verfügbar ist. Abbildung 3a zeigt MCE-System A-Gel-Bilder von RT-PCR-Reaktionen und die Sequenzierungsergebnisse des übersprungenen Bandes von den Patienten NS-03 und NS-07 vor und nach der Behandlung mit NS-065/NCNP-01 in der Dosis-Eskalationsphase 1-Studie. NS-03 und NS-07 beherbergen Löschungen, die die Exons 45-52 bzw. 48-52 umfassen. NS-03 erhielt 5 mg/kg und NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 wöchentlich für 12 Wochen. Wie vor der Behandlung erwartet, zeigten beide Patienten kein Überspringen, und nur ein nicht übersprungenes Band konnte visualisiert werden. Nach 12 Wochen Behandlung wurde für NS-07 ein deutlich übersprungenes unteres Band visualisiert. Es war jedoch immer noch schwierig, ein übersprungenes Produkt für Patienten NS-03 zu erkennen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten eine Verkettung der Exons 47 und 54 für NS-07 sowie der Exons 44 und 54 für NS-03. Je nach Sequenz könnten diese theoretisch eine funktionelle, aber verkürzte Dystrophin-Isoform erzeugen. Um den in Abbildung 3bdargestellten Überspringprozentsatz zu berechnen, wurde die Molkonzentration für das übersprungene Band durch das übersprungene und das nicht übersprungene Band geteilt. Bei Patient NS-07 betrug der Prozentsatz nach der Behandlung 72 % und für NS-03 3,4 %. Westliche Blotdaten (in dreifacher Ausfertigung) von Patienten NS-03, NS-07 und eine gesunde Kontrolle sind in Abbildung 4adargestellt. Voraussichtlich wurde vor der Behandlung kein Dystrophinband nachgewiesen. Nach der Behandlung wurde ein Band des Patienten NS-07 mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle nachgewiesen (Wildtyp Dystrophin hat ein Molekulargewicht von 427 kDa, und NS-07 Dystrophin hat ein Molekulargewicht von 389 kDa). Aufgrund der Exon-Deletion und des Überspringens fehlte der Dystrophin-Isoform des Patienten NS-07 mehrere Exons, und es wurde erwartet, dass sie ein geringeres Molekulargewicht haben würde. Patient NS-03 zeigte nach der Behandlung keine nachweisbaren Dystrophinspiegel. In Abbildung 4bwird die Menge an Dystrophin im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle für Den Patienten NS-07 angezeigt. Die Stelle, an der Signalintensitäten für die Berechnung der Dystrophin-Restauration gemessen wurden, wird mit blauen Quadraten angezeigt. Das Dystrophin-Spektrin-Verhältnis wurde verwendet, um die Menge an Dystrophin im Vergleich zu der der gesunden Kontrolle zu berechnen. Zu diesem Zweck wurde das Signal aus dem Dystrophin minus Hintergrund durch die Summe der beiden Spektrinisoformen (lang und kurz) minus Hintergrund geteilt (siehe Schritt 8.6.5). Das Verhältnis für eine gesunde Kontrolle wurde auf 100% festgelegt. Die Menge an Dystrophin im Vergleich zur gesunden Kontrolle bei Patient NS-07 nach der Behandlung betrug 9,1%. Der Prozentsatz konnte jedoch für den Patienten NS-03 aufgrund eines schwachen Dystrophinbandes, das ähnlich dem für frühere Behandlungsproben beider Patienten erhalten wurde, nicht berechnet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematisches Diagramm des Übertragungsstapels für die Western-Blot-Analyse. Montage des Western Blot Transfer Stacks mit Blotting-Papier, das in Blotting-Puffer A im Boden eingeweicht ist, gefolgt von Blotting-Papier, das in Blotting-Puffer B, PVDF-Membran, dem 3-8% Tris-Acetat-Gel und auf den oberen 2 Blotting-Papieren, die in Fleckpuffer C eingeweicht sind, gezeigt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Zeichnung des Exon-Überspringens von Exon 53 bei einem Patienten mit Exon 45-52-Deletion im DMD-Gen. Zum Beispiel, Patient NS-03 in der Dosis-Eskalation klinischen Studie hatte diese Deletion. Wenn exon 53 beibehalten wird, ist die mRNA aus dem Rahmen, da die Exon-Exon-Kreuzung zwischen exon 44 und 53 den Leserahmen stört, was zu einem Stop-Codon in exon 53 führt. Der Leserahmen wird wiederhergestellt, wenn exon 53 übersprungen wird und eine kürzere Isoform von Dystrophin erzeugt wird. Um exon 53-skipping per RT-PCR zu erkennen, werden Primer in exon 44 und 54 verwendet, so dass das PCR-Produkt zwischen übersprungener und nicht übersprungener mRNA leicht erkannt werden kann. FWD: Vorwärtsgrundierung, REV: Reverse Primer, PMO: Phosphorodiamid-Morpholino-Oligomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> Abbildung 3: Überspringen der Effizienz für Patienten NS-03 und NS-07 aus tibialis vorderen Muskelbiopsieproben. a) Gelbild, das durch das Elektrophoresesystem A von RT-PCR-Proben unbehandelter und behandelter Proben der Patienten NS-03 und NS-07 erzeugt wird. Das obere Panel zeigt NS-03 und das untere Panel NS-07 in Dreifachausführung. Bei NS-03 beträgt das nicht übersprungene Band 422 bp und das übersprungene Band 212 bp. Für NS-07 sind die Bänder 836 bp bzw. 624 bp. Die Sequenzanalyse ergab eine Verkettung von Exon 44 und Exon 54 für NS-03 und exon 47 zu exon 54 für NS-07. b) Für die Patienten NS-03 und NS-07 wird die Effizienz vor und nach der Behandlung übersprungen, berechnet aus der Molkonzentration der beiden vom System A bereitgestellten Bänder als übersprungenes Band/(übersprungenes Band + nicht übersprungenes Band) x 100. Die Überspringwirkung für NS-03 war nach der Behandlung sehr gering; für NS-07 betrug die Übersprungeffizienz über 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> Abbildung 4: Proteinquantifizierung von Dystrophin-Isoformen vor und nach der Exon-Skipping-Therapie. a) Proteinquantifizierung von Dystrophin-Isoformen vor und nach der Exon-Skipping-Therapie. Western Blot der Muskelbiopsie von tibialis anterior von den Patienten NS-03 und NS-07 vor und nach der Behandlung und von gesunder Kontrolle in Triplicate. Dystrophin kann bei 427 kDa für die gesunde Kontrolle und bei 389 kDa für NS-07 nach der Behandlung gesehen werden. Für den Patienten vor der Behandlung konnte weder Dystrophin noch nach der Behandlung des Patienten NS-03 dys nachgewiesen werden. Der Bereich in der Blackbox ist in Abbildung 4bdargestellt. Links in jedem Fleck wird der Marker angezeigt. b) Die Menge an Dystrophin, die nach der Behandlung des Patienten NS-07 wiederhergestellt wurde. Dystrophin-Wiederherstellung wurde basierend auf den Intensitäten der Bänder für Dystrophin, Hintergrund und die lange und kurze Isoform von Spectrin nach der Formel berechnet: (Dystrophin - Hintergrund)/(spectrin L -background) + (spectrin S - Hintergrund), wo das Verhältnis für eine gesunde Kontrolle auf 100% eingestellt ist. Die Intensität jedes Bandes wurde in den blauen Boxen gemessen, die in der Abbildung dargestellt sind. Die Dystrophin-Restauration für NS-07 betrug nach der Behandlung 9,1%. Das Dystrophinsignal war zu schwach, um es in den unbehandelten Proben messen zu können. Markergrößen werden in Kilodaltons dargestellt. Dys: Dystrophin, BG: Hintergrund, SL: Spectrin long isoform, SS: Spectrin short isoform, My: Myosin type 1. Markergrößen werden in Kilodaltons dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lösung</td>
			<td>Volumen/Reaktion (l)</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNasefreies Wasser (im Vorzeichen)</td>
			<td>Variable</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x QIAGEN OneStep RT-PCR Puffer</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (enthält 10 mM jedes dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 m von jedem dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vorwärts-Primer (10 m)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reverse Primer (10 'M)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0,6 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Enzymmix</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-Inhibitor (optional)</td>
			<td>Variable</td>
			<td>5–10 Einheiten/Reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Template-RNA</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>gesamt</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: RT-PCR-Reagenzien. Die notwendigen Verbindungen für eine Reaktion der RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer</td>
			<td>Sequenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCTCTCTCACTCACCCTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Primerliste. Sequenzen für die in dieser Studie verwendeten Primer. F: Vorwärts, R: Rückwärts.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 Zyklus</td>
			<td>Umgekehrte Transkription</td>
			<td>30 Min.</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 Zyklus</td>
			<td>Erster PCR-Aktivierungsschritt</td>
			<td>15 Min.</td>
			<td>95 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 Zyklen</td>
			<td>Denaturierung</td>
			<td>1 Min.</td>
			<td>94 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glühen</td>
			<td>1 Min.</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erweiterung</td>
			<td>1 Min.</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 Zyklus</td>
			<td>Endgültige Verlängerung</td>
			<td>7 Min.</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Halten</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: PCR-Konditioniert verwendet. PCR-Bedingungen für die RT-PCR-Reaktion anzeigen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lösung</td>
			<td>Volumen/Reaktion (l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNasefreies Wasser</td>
			<td>Variable</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vorwärts-Primer/Reverse Primer (3,2 m)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Template-RNA</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>gesamt</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Reagenzien, die für die Sequenzierungsreaktion erforderlich sind. Verwenden Sie entweder Vorwärts- oder Rückwärtsgrundierung im Setup, nicht beide gleichzeitig.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 Zyklus</td>
			<td>1 Min.</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 Zyklen</td>
			<td>10 s</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 s</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 Min.</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Halten</td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 5: PCR-Bedingungen für die Sanger-Sequenzierung.

Hier stellen wir die molekulare Charakterisierung der Dystrophin-38-Expression mit Sanger-Sequenzierung, RT-PCR und Western Blotting in der klinischen Studie vor.

Charakterisierung der Exon-Skipping-Effizienz in DMD-Patientenproben in klinischen Studien mit Antisense-Oligonukleotiden

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methodik für die Vorbereitung und Handhabung von Muskelgewebe in präklinischen Umgebungen und klinischen Studien, was wichtig ist, um zuverlässige Ergebnisse im DMD-Bereich zu erhalten. Die Techniken sind relevant für exon überspringen Tryouts für DMD. Und der Hauptvorteil ist, dass sie gut etabliert und reproduzierbar sind, wenn sie kollektiv durchgeführt werden.Diese Techniken konzentrieren sich hauptsächlich auf Exon-Skipping in DMD, aber mit einem Wechsel der Primer können die gleichen Techniken auf andere Krankheiten angewendet werden, die mit Spleißtherapien behandelt werden. Diese Methoden können verwendet werden, um Exon-Skipping-Effizienz sowohl als auch RNA und Protein zu erreichen. Um eine Probe für die Analyse vorzubereiten, mischen Sie zuerst gleiche Mengen an Tragacanth-Kaugummi und Wasser, bis das Zahnfleisch weich und klebrig wird.Diese Mischung in 25-Milliliter-Spritzen geben und 0,5 bis 1 Zentimeter Kaugummi auf einzelne Korkscheiben abgeben. Beschriften Sie die Scheiben auf der gegenüberliegenden Seite und legen Sie einen Behälter mit Isopentan in flüssigen Stickstoff, bis ein Teil der Flüssigkeit gefriert. Legen Sie jede Probe in das Tragacanth-Kaugummi auf den Scheiben mit einer Längsachse jedes Muskels senkrecht zum Kork.Legen Sie Kaugummi an den Boden jedes Muskels, um den Muskel an Ort und Stelle zu halten, und verwenden Sie pinnzere, um die Proben in der kälte isopentane einzufrieren. Bewegen Sie die Proben kontinuierlich für eine Minute oder bis vollständig gefroren, bevor Sie sie vorübergehend auf Trockeneis legen. Dann legen Sie die Proben in Glasfläschchen für 80 Grad Celsius Lagerung.Um das gefrorene Muskelgewebe für die Analyse zu sektionieren, stellen Sie einen Kryostat auf eine Arbeitstemperatur von 25 Grad Celsius ein und montieren Sie den Muskelblock auf den Halter. Schneiden Sie den Gewebeblock, bis flache Abschnitte erreicht sind. Für Reverse-Transkriptase-PCR- und Western-Blot-Analysen erhalten Sie 10 Mikrometer dicke Scheiben.Für die immunhistochemische Analyse erhalten sie sechs bis acht Mikrometer dicke Scheiben und für Hämatoxylin- und Eosinfärbung 10 bis 12 Mikrometer dicke Scheiben. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte nach derEn Erwerb in zwei Milliliter-Rohre. Bewahren Sie die Proben für PCR und Western Blotting bei 80 Grad Celsius auf.Hier werden Mikrochip-Elektrophorese-System, ein Gel-Bild von Reverse-Transkriptase-PCR-Reaktionen und die Sequenzierungsergebnisse des übersprungenen Bandes von zwei Patienten vor und nach der Behandlung mit einem Antisense-Oligonukleotid in einer Dosiseskalationsphase 1-Studie gezeigt. Beide Patienten hegen Streichungen. Wie erwartet zeigten beide Patienten vor der Behandlung kein Überspringen und nur ein nicht übersprungenes Band konnte visualisiert werden.Nach 12 Wochen Der Behandlung wurde für den zweiten Patienten ein deutlich übersprungenes unteres Band visualisiert, es war jedoch immer noch schwierig, ein übersprungenes Produkt für den ersten Patienten zu erkennen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten eine Verkettung der Exons 47 und 54 für den zweiten Patienten und exons, 44 und 54 für den ersten Patienten. Um den übersprungenen Prozentsatz zu berechnen, wurde die Molkonzentration für das übersprungene Band durch die übersprungenen und nicht übersprungenen Bänder geteilt.Wie erwartet, wurde kein Dystrophinband von Western Blot vor der Behandlung nachgewiesen. Nach der Behandlung wurde beim zweiten Patienten ein Band mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Vergleich zu dem bei der gesunden Kontrolle beobachteten Band nachgewiesen. Der erste Patient zeigte jedoch nach der Behandlung keine nachweisbaren Dystrophinspiegel.Es ist wichtig, das Muskelgewebe richtig zu behandeln und jede Probe auf dem Tragacanth-Zahnfleisch in konsistenter Weise zu platzieren. Die Gewebeabschnitte können auf verschiedene Arten analysiert werden, einschließlich künstlicher PCR, digitaler PCR, Western Blot, Immunhistochemie und mit verschiedenen Arten von Omics. Diese Techniken können beschleunigt werden, die Entwicklung, zusätzliche Exon überspringen Medikamente auf verschiedene Exons, und kann auf die Entwicklung von viralen basierten und wieder in der Bearbeitung für DMD angewendet werden.

characterizing-exon-skipping-efficiency-dmd-patient-samples-clinical

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