Charakterisierung der Exon-Skipping-Effizienz in DMD-Patientenproben in klinischen Studien mit Antisense-Oligonukleotiden
7. Mai 2020
Hier stellen wir die molekulare Charakterisierung der Dystrophin-38-Expression mit Sanger-Sequenzierung, RT-PCR und Western Blotting in der klinischen Studie vor.
Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methodik für die Vorbereitung und Handhabung von Muskelgewebe in präklinischen Umgebungen und klinischen Studien, was wichtig ist, um zuverlässige Ergebnisse im DMD-Bereich zu erhalten. Die Techniken sind relevant für exon überspringen Tryouts für DMD. Und der Hauptvorteil ist, dass sie gut etabliert und reproduzierbar sind, wenn sie kollektiv durchgeführt werden.
Diese Techniken konzentrieren sich hauptsächlich auf Exon-Skipping in DMD, aber mit einem Wechsel der Primer können die gleichen Techniken auf andere Krankheiten angewendet werden, die mit Spleißtherapien behandelt werden. Diese Methoden können verwendet werden, um Exon-Skipping-Effizienz sowohl als auch RNA und Protein zu erreichen. Um eine Probe für die Analyse vorzubereiten, mischen Sie zuerst gleiche Mengen an Tragacanth-Kaugummi und Wasser, bis das Zahnfleisch weich und klebrig wird.
Diese Mischung in 25-Milliliter-Spritzen geben und 0,5 bis 1 Zentimeter Kaugummi auf einzelne Korkscheiben abgeben. Beschriften Sie die Scheiben auf der gegenüberliegenden Seite und legen Sie einen Behälter mit Isopentan in flüssigen Stickstoff, bis ein Teil der Flüssigkeit gefriert. Legen Sie jede Probe in das Tragacanth-Kaugummi auf den Scheiben mit einer Längsachse jedes Muskels senkrecht zum Kork.
Legen Sie Kaugummi an den Boden jedes Muskels, um den Muskel an Ort und Stelle zu halten, und verwenden Sie pinnzere, um die Proben in der kälte isopentane einzufrieren. Bewegen Sie die Proben kontinuierlich für eine Minute oder bis vollständig gefroren, bevor Sie sie vorübergehend auf Trockeneis legen. Dann legen Sie die Proben in Glasfläschchen für 80 Grad Celsius Lagerung.
Um das gefrorene Muskelgewebe für die Analyse zu sektionieren, stellen Sie einen Kryostat auf eine Arbeitstemperatur von 25 Grad Celsius ein und montieren Sie den Muskelblock auf den Halter. Schneiden Sie den Gewebeblock, bis flache Abschnitte erreicht sind. Für Reverse-Transkriptase-PCR- und Western-Blot-Analysen erhalten Sie 10 Mikrometer dicke Scheiben.
Für die immunhistochemische Analyse erhalten sie sechs bis acht Mikrometer dicke Scheiben und für Hämatoxylin- und Eosinfärbung 10 bis 12 Mikrometer dicke Scheiben. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte nach derEn Erwerb in zwei Milliliter-Rohre. Bewahren Sie die Proben für PCR und Western Blotting bei 80 Grad Celsius auf.
Hier werden Mikrochip-Elektrophorese-System, ein Gel-Bild von Reverse-Transkriptase-PCR-Reaktionen und die Sequenzierungsergebnisse des übersprungenen Bandes von zwei Patienten vor und nach der Behandlung mit einem Antisense-Oligonukleotid in einer Dosiseskalationsphase 1-Studie gezeigt. Beide Patienten hegen Streichungen. Wie erwartet zeigten beide Patienten vor der Behandlung kein Überspringen und nur ein nicht übersprungenes Band konnte visualisiert werden.
Nach 12 Wochen Der Behandlung wurde für den zweiten Patienten ein deutlich übersprungenes unteres Band visualisiert, es war jedoch immer noch schwierig, ein übersprungenes Produkt für den ersten Patienten zu erkennen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten eine Verkettung der Exons 47 und 54 für den zweiten Patienten und exons, 44 und 54 für den ersten Patienten. Um den übersprungenen Prozentsatz zu berechnen, wurde die Molkonzentration für das übersprungene Band durch die übersprungenen und nicht übersprungenen Bänder geteilt.
Wie erwartet, wurde kein Dystrophinband von Western Blot vor der Behandlung nachgewiesen. Nach der Behandlung wurde beim zweiten Patienten ein Band mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Vergleich zu dem bei der gesunden Kontrolle beobachteten Band nachgewiesen. Der erste Patient zeigte jedoch nach der Behandlung keine nachweisbaren Dystrophinspiegel.
Es ist wichtig, das Muskelgewebe richtig zu behandeln und jede Probe auf dem Tragacanth-Zahnfleisch in konsistenter Weise zu platzieren. Die Gewebeabschnitte können auf verschiedene Arten analysiert werden, einschließlich künstlicher PCR, digitaler PCR, Western Blot, Immunhistochemie und mit verschiedenen Arten von Omics. Diese Techniken können beschleunigt werden, die Entwicklung, zusätzliche Exon überspringen Medikamente auf verschiedene Exons, und kann auf die Entwicklung von viralen basierten und wieder in der Bearbeitung für DMD angewendet werden.
Übersicht
Diese Studie stellt eine standardisierte Methodik zur Vorbereitung und Handhabung von Muskelgewebe in klinischen Studien im Zusammenhang mit der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) vor. Im Mittelpunkt stehen Exon-Skipping-Techniken, die für die Entwicklung wirksamer Therapien von entscheidender Bedeutung sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Klinische Studien
Hintergrund
- Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere Muskelschwundkrankheit.
- Exon-Skipping ist ein aussichtsreicher therapeutischer Ansatz für die DMD.
- Ein zuverlässiges Gewebemanagement ist entscheidend für genaue experimentelle Ergebnisse.
- Standardisierte Methoden können die Reproduzierbarkeit in der Forschung verbessern.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Protokolls zur Vorbereitung von Muskelgewebe.
- Unterstützung von Exon-Skipping-Studien für DMD.
- Bereitstellung eines Rahmens, der auf andere Erkrankungen anwendbar ist, die mit Spleißtherapien behandelt werden.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Muskelgewebe unter Verwendung von Traganthgummi und Isopentan.
- Einfrieren und Schneiden von Muskelproben zur Analyse.
- Reverse Transkriptase-PCR und Western Blotting zur Detektion der Dystrophin-Expression.
- Sequenzierung zur Analyse der Exon-Skipping-Effizienz.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von ausgelassenen Banden bei behandelten Patienten.
- Nachweis von Dystrophin bei einem Patienten nach der Behandlung.
- Variabilität der Therapieantwort zwischen den Patienten.
- Bedeutung einer konsistenten Gewebebehandlung für genaue Ergebnisse hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- Standardisierte Methoden sind entscheidend, um Therapien bei DMD voranzubringen.
- Das Exon-Skipping zeigt Potenzial, erfordert jedoch weitere Optimierung.
- Zukünftige Studien können auf diesen Methoden aufbauen, um sie breiter anzuwenden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll etabliert einen standardisierten Arbeitsablauf zur Beurteilung der Effizienz des Exon-Skipping in Proben von DMD-Patienten und unterstützt damit direkt die Zielvalidierung bei der Entwicklung antisense-Oligonukleotid-basierter Therapien. Durch die ermöglichte quantitative Messung der molekularen Wiederherstellung liefert es eine mechanistische Risikominderung für Exon-53-Skipping-Therapien wie Viltolarsen. Der Ansatz erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Übertragung von präklinischen auf klinische Anwendungen, indem biochemische Endpunkte mit dem therapeutischen Wirkmechanismus verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der durch Antisense-Oligonukleotide vermittelten Exon-Überspringung als therapeutische Hypothese in von Patienten stammenden Proben.
- Operativer Wert: Bietet reproduzierbare Sanger-Sequenzierungs-, RT-PCR- und Western-Blot-Methoden, um die gezielte molekulare Wirkung zu bestätigen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Verhältnisse von übersprungenen zu gesamten Banden für die Dosis-Wirkungs-Bewertung der Exon-Überspringungseffizienz.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gewebeprotektion und Schnittprotokolle, um die Reproduzierbarkeit des Assays über präklinische und klinische Probenmengen hinweg sicherzustellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Analyse krankheitsrelevanter Systeme durch die Charakterisierung der Wiederherstellung von Dystrophin in Muskelbiopsien echter Patienten.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem konsistente molekulare Messgrößen über verschiedene Modellsysteme hinweg verwendet werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und liefert eine molekulare Bestätigung des Wirkmechanismus vor der Untersuchung der funktionellen Wirksamkeit.
- Entdeckungsbiochemie: Bestätigt die korrekte Spleißkorrektur des Ziel-Exons in Patientenproben und unterstützt somit die Hypothesenvalidierung für antisense-Oligonukleotide.
- Screening: Ermöglicht die quantitative Bestimmung von Exon-Ausschlussraten mittels Gelelektrophorese und Sequenzierung, wodurch ein Vergleich verschiedener Substanzen ermöglicht wird.
- Analytik: Bietet eine auf molarer Konzentration basierende Quantifizierung der ausgeschlossenen Bande zur vergleichenden Analyse über verschiedene Dosen und Patienten hinweg.
- Translationale Forschung: Verknüpft den molekularen Exonausschluss mit dem Nachweis des Dystrophinproteins und schließt damit die Lücke zwischen RNA-vermittelter Wirkmechanismen und proteinaufgelösten Ergebnissen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren Rahmen für die Gewebebehandlung und -analyse, der auf mehrere Exon-Ziele und Spleißtherapien anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Entlastung durch direkte Visualisierung von Exon-Skipping und Wiederherstellung von Dystrophin im menschlichen Gewebe.
- Operationaler Wert: Standardisiertes Einbetten mit Traganth und Kryoschnitte gewährleisten Probeneinheitlichkeit und verringern die Variabilität.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem molekulare Nachweise der Zielinteraktion vor funktionellen Endpunkten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von antisense-Oligonukleotiden basierend auf der Effizienz des Exon-Skippings in relevanten Patientengenotypen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularbiologischen Techniken, einschließlich RT-PCR, Western Blotting und Sanger-Sequenzierung.
- Abhängig von Kryostat-Ausrüstung zur Gewebeschnittführung sowie flüssigem Stickstoff/Isopentan zur schnellen Einfrierung.
- Benötigt standardisierte Protokolle für die Gewebebehandlung, um die Probenechtheit über verschiedene Standorte oder Zeitpunkte hinweg aufrechtzuerhalten.
- Muss bei der Primerentwicklung zur Detektion von Exon-Skipping die Variabilität patientenspezifischer Mutationen berücksichtigen.
- Eingeschränkt durch den halbquantitativen Charakter gelförmer Methoden, sofern keine Validierung mittels digitaler PCR oder Kapillarelektrophorese erfolgt.
