Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung
23. Juni 2020
Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.
Diese Methode kann verwendet werden, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies in anhaftenden Zellen mit nur einem Fluoreszenzmikroskop zu analysieren und die Intensität reaktiver Sauerstoffspezies mit fluoreszenzplattenleser zu quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig. Beginnen Sie mit der Aussaat von zwei mal 10 bis zu den fünften HCT116 Dickdarmkrebszellen in DMEM in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium durch 100 mikromolares Eisensulfat oder 10 mikromolare Doxorubicin-haltiges Medium, und bebrüten die Platte für weitere 24 Stunden. Bereiten Sie die DCFH-DA-Lösung vor, indem Sie 4,85 Milligramm DCFH-DA in einem Milliliter DMSO auflösen, um eine 10 Millimolar-Lagerlösung herzustellen.
Unmittelbar vor dem Hinzufügen in die Brunnen, verdünnen Sie den Bestand mit vorgewärmtDM, um eine 10 Mikromolar Arbeitslösung zu machen, und wirbeln Sie es für 10 Sekunden. Um die Zellen zu färben, entfernen Sie das medikamentenhaltige Medium und waschen Sie es einmal mit DMEM. Fügen Sie 500 Mikroliter DCFH-DA Arbeitslösung in jeden Brunnen, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.
Nach der Inkubation die DCFH-DA aus den Brunnen entfernen und zweimal mit DMEM und einmal mit PBS waschen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzu. Verwenden Sie den grünen fluoreszierenden Proteinkanal am Fluoreszenzmikroskop, um repräsentative Bilder der Zellen zu machen.
Entfernen Sie dann die PBS, und fügen Sie 200 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte fünf Minuten lang auf Eis bebrüten und die Zelle lysiert in 1,5 Milliliter-Röhren sammeln. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 21, 130 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann 100 Mikroliter des Überstandes auf eine schwarze 96-Well-Platte übertragen. Verwenden Sie einen Mikroplattenleser mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 530 Nanometern, um die Fluoreszenz in jedem Brunnen zu messen. Als nächstes messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay, indem Sie einen Mikroliter des Überstandes auf eine klare 96-Well-Platte mit 100 Mikroliter Protein-Assay-Lösung übertragen.
Verwenden Sie die Proteinkonzentrationen, um die Fluoreszenzintensitäten zu normalisieren. HCT116 Dickdarmkrebszellen wurden mit 100 mikromolarem Eisensulfat oder 10 mikromolarem Doxorubicin behandelt, um oxidativen Stress zu induzieren. Wie erwartet, wurde die grüne Fluoreszenz durch beide Behandlungen dramatisch erhöht.
Um die relativen Intensitätsänderungen zu quantifizieren, wurden die Zellen lysiert und mit Proteinkonzentrationen normalisiert. Die relative Fluoreszenzintensität wurde durch Eisensulfat oder Doxorubicin signifikant erhöht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die DCFH-DA-Lösung frisch zu machen und Lichteinwirkung zu vermeiden, sowie Zellstatusstörungen zu minimieren und eine umfangreiche PBS-Wäsche direkt vor der Aufnahme durchzuführen.
Neben der Detektion des gesamten ROS durch dieses Protokoll können insbesondere ROS wie Peroxid durchgeführt werden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Detektion von gesamten zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von DCFH-DA vor. Die Methode ermöglicht die Visualisierung der Lokalisation von ROS in adhärenten Zellen sowie die Quantifizierung der ROS-Intensität.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Analyse reaktiver Sauerstoffspezies
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Reaktive Sauerstoffspezies spielen eine entscheidende Rolle in der zellulären Signalübertragung.
- Das Verständnis der Lokalisation von ROS kann Einblicke in zelluläre Prozesse ermöglichen.
- Fluoreszenztechniken werden häufig zur ROS-Detektion eingesetzt.
- Dieses Protokoll wurde hinsichtlich Benutzerfreundlichkeit und Kosteneffizienz konzipiert.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in adhärenten Zellen bereitstellen.
- Die Visualisierung und Quantifizierung von ROS mittels Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen.
- Den Prozess für Forschende auf diesem Gebiet vereinfachen.
Verwendete Methoden
- Ansäen von HCT116-Darmkrebszellen in einer 24-Loch-Platte.
- Inkubation der Zellen mit Eisen(II)-sulfat oder Doxorubicin.
- Zubereitung der DCFH-DA-Lösung zur ROS-Detektion.
- Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie und Plattenreader.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Lokalisation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Zellen.
- Die Quantifizierung der ROS-Intensität zeigte die Wirksamkeit der Methode auf.
- Das Protokoll erwies sich als einfach und effizient für Forschende.
- Kostengünstiger Ansatz zur Analyse reaktiver Sauerstoffspezies in zellulären Studien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine einfache Methode zur Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
- Es kann auf verschiedene adhärente Zelltypen angewendet werden.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um tiefere Einblicke in zelluläre Mechanismen zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Detektion von gesamtreaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in anhaftenden Zellen mittels DCFH-DA-Färbung liefert einen standardisierten Endpunkt für oxidativen Stress, ein Schlüsselfaktor in der Krankheitsmodellierung und bei Studien zur Arzneimittelwirkung. Diese Methode ermöglicht eine robuste Beurteilung des zellulären Redoxstatus nach chemischen oder genetischen Störungen und unterstützt die mechanistische Entlastung sowie die Zielvalidierung in der frühen Entdeckung. Ihre Kosteneffizienz und Skalierbarkeit machen sie für die Integration in Hochdurchsatz-Screenings und translationsmedizinische Arbeitsabläufe geeignet.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die quantitative Untersuchung von Wegen des oxidativen Stresses in krankheitsrelevanten Zellmodellen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die das zelluläre Redoxgleichgewicht modulieren.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem Verbindungen oder genetische Eingriffe mit der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht einen reproduzierbaren, fluoreszenzbasierten Assay zur Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in anhaftenden Zellen.
- Unterstützt die Standardisierung und Normalisierung des Assays mithilfe von Protein-Konzentrationsmessungen.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung compoundinduzierter oxidativer Stresszustände im Rahmen von Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Korrelatiert oxidative Stressparameter mit Krankheitsmodellen zur translationellen Biomarker-Entwicklung.
- Unterstützt die Kontinuität von der In-vitro-Entdeckung bis zur präklinischen Validierung redoxmodulierender Wirkstoffe.
- Bietet einen prädiktiven Wert für die Sicherheit und Wirksamkeit von Wirkstoffen im Zusammenhang mit oxidativen Mechanismen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses auf DCFH-DA basierende Nachweisverfahren für ROS fügt sich in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen ein und liefert eine quantitative Aussage zur Modulation des oxidativen Stresses in zellulären Systemen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung rotenabhängiger Zielstrukturen und Signalwege.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative ROS-Messungen für die Substanztriage.
- Analytik: Integriert die Normalisierung der Fluoreszenzintensität für robuste Datenvergleiche.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse zum oxidativen Stress mit der Validierung in präklinischen Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen breit anwendbaren, kosteneffizienten Assay für diverse Zelltypen und Interventionen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit in der Redoxbiologie und bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Vereinfacht die Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies durch skalierbare und reproduzierbare Arbeitsabläufe.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem Interventionen mit Ergebnissen bezüglich oxidativen Stresses verknüpft werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von redoxmodulierenden Wirkstoffen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Fluoreszenzmikroskopie und im Umgang mit Plattenlesegeräten.
- Benötigt Zugang zu Standardinfrastruktur für Zellkultur und Proteinquantifizierung.
- Erfordert sorgfältige Handhabung des DCFH-DA-Reagenz zur Vermeidung lichtinduzierter Degradation.
- Die Standardisierung von Wasch- und Normalisierungsschritten ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit.
- Das Protokoll ist auf verschiedene adhärente Zelllinien übertragbar, erfordert jedoch möglicherweise Optimierungen für spezifische Modelle.
