Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

Dieses Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung einer vollständigen funktionellen Konzentrationsreaktionsbeziehung von GPCR-Agonisten aus einer Zellpopulation und ermöglicht eine detaillierte agonistische Charakterisierung auch bei niedrigen Zellprobenzahlen. Der Hauptvorteil der seriellen Dosierung ist die Erhöhung des Durchsatzes, da ein einzelner Brunnen für eine vollständige Konzentrationsreaktionsanalyse ausreicht. Diese Technik eignet sich gut, um einzelne Transduktionen in seltenen und komplexen biologischen Modellen zu untersuchen, wie Organ-on-Chip-Formate in geschlossenen mikrofluidischen Behältern.

Das Protokoll ist nicht schwer durchzuführen, sofern die entsprechende Ausrüstung verfügbar ist. Die Vorbereitung der verschiedenen GPCR-Ligandlösungen in der richtigen Konzentration ist der Schlüssel zum Erfolg. Michael Skiba, ein Student, und Anne Mildner, eine Studentin, aus unserem Labor werden das Verfahren demonstrieren.

Für die Zellaussaat auf die Elektroden-Arrays, fügen Sie die entsprechende Konzentration der Zellen zu den Brunnen jedes Elektroden-Array, und lassen Sie die Zellen homogen auf den Brunnenboden für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur absetzen. Nach mindestens 36 Stunden in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, inspizieren Sie die Zellschichten durch Phasenkontrastmikroskopie, um eine vollständige Abdeckung jeder Elektrode mit Zellen zu gewährleisten. Dann ersetzen Sie das Zellkulturmedium in jedem Brunnen durch das entsprechende Volumen des vorgewärmten, serumfreien Mediums.

Um eine Impedanzaufnahme zu starten, legen Sie das Elektrodenarray in den Anschluss-Array-Halter des Impedanzanalysators und bestätigen Sie einen korrekten Kontakt mit niedriger Impedanz zwischen den Elektroden und dem Impedanzanalysator. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche der Software den Elektrodentyp und/oder das Multi-Well-Format aus. Wenn Einzel- und Mehrfachfrequenzdatenerfassungsmodi verfügbar sind und die Anzahl der zu analysierenden Bohrungen gering ist oder die Zeitauflösung nicht kritisch ist, wählen Sie mehrere Frequenzaufzeichnungen aus.

Um eine maximale Zeitauflösung zu gewährleisten, wählen Sie eine einzige Überwachungshäufigkeit aus. Starten Sie dann mit der Erfassung der Zeitkursdaten, und wählen Sie den Datenordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen. Die Impedanzwerte werden bei der angegebenen Anzahl von Frequenzen für jeden Brunnen aufgezeichnet Um das serielle Additionsprotokoll im Agonistenmodus für ein Acht-Well-Array zu initiieren, fügen Sie den Zellen 30 Mikroliter der niedrigsten Konzentration des Agonisten hinzu.

Dann lassen Sie die Zellen reagieren und für den vordefinierten Zeitraum auslagern, bevor Sie 30 Mikroliter der nächsthöchsten Konzentration hinzufügen, bis jede serielle Verdünnung des Agonisten hinzugefügt wurde. Um die Daten zu analysieren, subtrahieren Sie die Impedanz des letzten Datenpunkts vor dem ersten Hinzufügen der Agonistenlösung, und legen Sie die Zeit des Hinzufügens Null fest, um die Impedanzwerte zu normalisieren. Zeichnen Sie den Zeitverlauf der normalisierten Impedanz und zeichnen Sie die einzelnen Zeitläufe, um die Maxima in Impedanz nach jedem Additionsschritt zu identifizieren.

Erstellen Sie ein Datenblatt mit diesen Werten, und zeichnen Sie die Werte der maximalen Impedanzänderung in Abhängigkeit von der agonistischen Konzentration. Verwenden Sie dann eine Datenanpassungsroutine, um die halbmaximale effektive Konzentration und maximale Reaktion mithilfe des Logistikmodells mit vier Parametern zu bestimmen. In diesem repräsentativen Experiment wurden den Zellen alle 15 Minuten sequenziell 10 Lösungen mit steigender Histaminkonzentration hinzugefügt, und die Änderung der Impedanz wurde zu jedem Zeitpunkt gemessen.

Die Impedanzänderungen könnten dann als Funktion der Histaminkonzentration und der Übertragungsfunktion eines vierparametern logistischen Modells dargestellt werden, das aus sieben Brunnen an die experimentellen Datenpunkte angepasst ist. Um eine mögliche Histaminrezeptor-Downregulation, Zelldesensibilisierung oder Überstimulation zu berücksichtigen, kann der Datenbereich für die Analyse reduziert werden, wie für dieses einzelne serielle Dosierexperiment gezeigt. Die Drei-Parameter-Optimierung kann dann auf die Daten angewendet werden, was eine halbmaximale effektive Konzentration von 0,75 plus oder minus 0,12 Mikromolar für diese Analyse liefert.

Die Zugabe des Histaminrezeptor-Antagonisten Diphenhydramin 20 Minuten vor dem ersten Histamin führt zu einer verzögerten Erhöhung der Impedanz innerhalb des seriellen Dosierschemas, entsprechend der Notwendigkeit eines höheren Agonisten, um eine Zellreaktion auszulösen. In der Dosis-Reaktions-Beziehung wird die Wirkung des Antagonisten als eine Rechtsverschiebung der Kurven ausgedrückt, was einer Erhöhung der halbmaximalen effektiven Konzentration entspricht, vorausgesetzt, der Antagonist ist ein kompetitiver Liganden im Vergleich zum Agonisten. Die erfolgreiche Anwendung des seriellen Dosierschemas ist technisch einfach, erfordert aber eine durchdachte Planung, da es schwierig ist, alle Schritte mit dem richtigen Timing durchzuführen.

Die serielle Dosierung hat den Weg für die Durchführung von Konzentrationsreaktionsstudien mit anderen Auslesesystemen geebnet, die hinsichtlich der Anzahl der parallel überwachten Proben begrenzt sind. Die besonderen Vorteile der seriellen Dosing ermöglichen die Untersuchung der rezeptorvermittelten Signaltransduktion mit völlig neuen Auslesungen, die empfindlich auf andere phänoseische Veränderungen wie die Zytomechanik reagieren. Bitte tragen Sie Handschuhe und Schutzbrillen bei der Vorbereitung der Stammlösungen des Rezeptor-Agonisten, da sie beim Einatmen oder Verschlucken gefährlich sein können.