Name: Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Lernen Sie die Messung des Sauerstoffverbrauchs in nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Inseln zur Bewertung der mitochondrialen Funktion. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Analysen mit kleinen Probenmengen.

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Die Autoren möchten den Vanderbilt High Throughput Screening Core für die Nutzung ihrer Einrichtungen, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) für nichtmenschliche Primaten-Islet-Isolierungen und Eric Donahue (Vanderbilt University) für die Unterstützung von Abbildung 1 würdigen. J.M.E. wurde von NIGMS der National Institutes of Health unter der AuszeichnungT32GM007347 unterstützt. M.G. wurde vom NIH/NIDDK (R24DK090964-06) und dem Department of Veterans Affairs (BX003744) unterstützt.

1. Vorbereitung von Mikroplatte und Sensorpatrone am Tag vor dem Ausführen des Assays
Inselchen wurden von dreijährigen japanischen Makaken isoliert, wie zuvor beschrieben13. Diese Methode ist sehr ähnlich der, die verwendet wird, um menschliche Inselchen von Kadaverspendern zu isolieren, unterscheidet sich aber von Mäusen, bei denen Pankreata oft mit Kollagenaselösung aufgeblasen werden, während das Tier unter Sedierung und vor der Organentfernung steht. Der Islet Retrieval wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Oregon National Primate Research Center (ONPRC) und der Oregon Health and Science University durchgeführt und vom ONPRC IACUC genehmigt. Das ONPRC hält sich an den Animal Welfare Act und die Vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten (USDA) durchgesetzten Vorschriften und die Politik des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren in Übereinstimmung mit dem von den National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
<ol><li>Herstellung von Spheroid Mikroplatte<ol>
<li>Bereiten Sie 3 ml einer 0,1M-Lösung von Natriumbicarbonat vor. Filter sterilisieren die Lösung. Wir haben einen 0,45-m-Filter (Materialtabelle )verwendet.</li>
		<li>In einer Zellkulturhaube 200 l Zell- und Gewebeklebstoff (Materialtabelle) zu 2,8 ml 0,1M Natriumbicarbonat hinzufügen. Fügen Sie dann 20 L dieser Lösung an den Boden jeder Bohrung der 96-Well-Sphäroid-Mikroplatte (Tabelle der Materialien) hinzu. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen von der Pipettenspitze entfernt werden und nur der Boden der Platte abgedeckt ist. Die Beschichtung der Mikroplatte verhindert, dass sich Dieschen an den Seiten der Brunnen nach oben bewegen, wenn Medikamente hinzugefügt und während des Assays in den Brunnen gemischt werden. HINWEIS: Es ist nur notwendig, so viele Brunnen zu beschichten, wie für Inselchen verwendet werden, wenn der Test ausgeführt wird. Wenn nur wenige Brunnen verwendet werden, kann die Zellklebstofflösung entsprechend verkleinert werden. Der im Test verwendete Zellklebstoff ist eine formulierte Proteinlösung, die aus der Meeresmuschel extrahiert wird. Alternativ können Mikroplattenbohrungen auch mit 20 l poly-D-Lysin mit 100 g/ml beschichtet werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C, Nicht-CO2 2-Inkubator für eine Stunde.</li>
		<li>In einer sterilen Umgebung, Aspirieren Zellklebstofflösung von der Platte. Waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit 400 l 37 °C sterilem Wasser mit einer Mehrkanalpipette. Trocknen lassen.</li>
		<li>Nach 30-40 Minuten die Platte abdecken und über Nacht bei 4 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydration der Sensorpatrone<ol>
<li>Öffnen Sie in einer sterilen Umgebung das Sensorkassettenpaket (Materialtabelle) und entfernen Sie den Inhalt. Stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Gebrauchsschild.</li>
		<li>Füllen Sie jeden Brunnen der Versorgungsplatte mit 200 l sterilem Wasser und senken Sie die Sensorpatrone wieder in die Versorgungsplatte. Legen Sie montierte Sensorpatrone und Nutzplatte über Nacht in einen 37 °C, nicht CO2-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Calibrant<ol>
<li>Aliquot 25 ml Kalibrant (Materialtabelle) in ein 50 ml konisches Rohr. Rohr über Nacht in einen 37 °C, nicht-CO2 2-Inkubator legen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protokoll zur Medienvorbereitung, Beladung von Inselchen und Beladung der Sensorpatrone am Tag des Assays
<ol><li>Vorbereitung von Medien<ol>
<li>Auf 48,5 ml Basismedien (minimal DMEM, siehe Materialtabelle)500 l von je 1 mM Natriumpyruvat und 2 mM Glutamin hinzufügen. Zusätzlich 496 l mit 200 mg/ml Glukose hinzufügen (die Endkonzentration von Glukose in den Medien beträgt 5,5 mM). ANMERKUNG: Die Glukosebasiskonzentration wurde für diese Experimente konstant gehalten. Jedoch, Glukose kann auch verwendet werden, um die Atmung zusätzlich zu den pharmakologischen Manipulationen beschrieben Schlag10zu stimulieren.</li>
		<li>Bestätigen Sie, dass der pH-Wert 7,4 +/- 0,1 beträgt und bei Bedarf angepasst wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Sensorpatrone<ol>
<li>Nehmen Sie die Sensorpatrone aus dem Inkubator, entfernen Sie den Deckel der Sensorpatrone und werfen Sie Wasser aus Brunnen aus. Legen Sie 200 ml vorgewärmten Kalibrant in jeden Brunnen und ersetzen Sie den Deckel der Sensorpatrone.</li>
		<li>Stellen Sie die Sensorpatrone für ca. 1 Stunde (bis erforderlich) wieder in den Inkubator ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung von Medikamenten für mitochondrialen Stresstest<ol>
<li>Öffnen Sie das Stresstestkit (Materialtabelle) und entfernen Sie den Inhalt. Bestands- und Arbeitslösungen für Oligomycin, Carbonylcyanid-4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazone (FCCP) und Rotenon/Antimycin A (AA) wie folgt.<ol>
<li>Oligomycin: Fügen Sie 630 l montierte Medien in die Röhre ein, um 100 -M-Lager zu bilden. Dann mit Medien auf 45 m verdünnen, um eine Portkonzentration zu erhalten (endende Brunnenkonzentration nach der Injektion beträgt 4,5 m)</li>
			<li>FCCP: Fügen Sie 720 l montierte Medien zu Tube hinzu, um 100 -M-Lager zu machen. Verdünnung auf 10 m mit Medien, um eine Portkonzentration zu erhalten (Endbrunnenkonzentration beträgt 1 m) HINWEIS: BSA und/oder FBS sollten nicht zu Medien hinzugefügt werden, da dies die Wirkung von mitochondrialen Entkopplern beeinflussen kann14.</li>
			<li>Rotenone/AA: Fügen Sie 540 l montierte Medien in die Röhre ein, um 50 -M-Lager zu bilden. Verdünnung auf 25 m mit Medien, um eine Portkonzentration zu erhalten (Endbrunnenkonzentration beträgt 2,5 m) ANMERKUNG: Die oben genannten Konzentrationen haben zu konsistenten Ergebnissen in unseren Händen geführt. Zusätzliche FCCP führte zu keiner weiteren Erhöhung der Atmung. Allerdings müssen die Wirkstoffkonzentrationen je nach Inselgröße und insbesondere bei Inselchen verschiedener Arten oder Nicht-Inselspheroide angepasst werden. Zum Vergleich: Der durchschnittliche Durchmesser einer nichtmenschlichen Primaten-Islet beträgt etwa 150 m15.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Sphäroidplatte und Transfer von Inselchen<ol>
<li>Handpflücken Sie Pankreasinseln in eine 60 mm x 15 mm Zellkulturschale mit montierten Medien, um nahezu 100% Reinheit zu erhalten. HINWEIS:Inselchen sollten gerundet, mit einer klar definierten Peripherie erscheinen und dichter erscheinen als exokrine Gewebeverunreinigungen. Vermeiden Sie Inselchen, die beschädigt oder ausgefranst erscheinen. In diesem Experiment wurde die Inselgröße nicht direkt gemessen, obwohl wir versuchten, Für jeden Brunnen und jede Probe Inseln von ungefähr gleicher Größe zu pflücken.</li>
		<li>Laden Sie jede Bohrung mit Sphäroid-Mikroplatte mit 175 l montierten Medien mit einer Mehrkanalpipette.</li>
		<li>Mit einer P20-Pipette, die auf 15 l eingestellt ist, 15 Inselchen aus der Zellkulturschale aspirieren. Inselchen sollten in der Pipettenspitze mit bloßem Auge sichtbar sein.</li>
		<li>Um Inselchen auf sphäroide Mikroplatte zu übertragen, niedrigere Pipette Spitze auf den Boden des Brunnens, kaum heben, und langsam Pipette aus einem sehr kleinen Volumen (ca. 5 l). Vergewissern Sie sich, dass alle Inselchen die Pipettenspitze verlassen haben. Jeder Brunnen sollte 15 Inseln erhalten. Überprüfen Sie gelegentlich sphäroide Mikroplatte unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Inselchen an der Unterseite jedes Brunnens befinden, anstatt an den Seiten zu kleben. HINWEIS: Vermeiden Sie das Laden der Eckbrunnen mit Inselchen. Sauerstoff und pH-Fluss aus dem Kunststoff können während des Testes auftreten, und dies wird in den vier Eckbrunnen verschärft.</li>
		<li>Sobald alle Inselchen auf die Sphäroid-Mikroplatte übertragen wurden, inkubieren Sie die Mikroplatte in einem 37 °C, nicht-CO2-Inkubator, während Sie die folgenden Schritte ausführen.</li>
	</ol></li>
	<li>Laden der Sensorpatrone und Ausführen des Assays<ol>
<li>Entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem Inkubator. Ports A-C für jeden Brunnen müssen entweder mit Drogen oder Medien geladen werden. Brunnen mit Inselchen und die vier Eckbrunnen sollten mit Drogen beladen werden. Nicht-Eckbrunnen ohne Inselchen sollten mit Medien beladen werden. Port D kann leer gelassen werden. Lastanschluss A (oben links von jedem Sensor) mit 20 l Oligomycin oder Medien. Ladeanschluss B (oben rechts) mit 22 L FCCP oder Medien. Lastanschluss C (unten links) mit 25 L Rotenon/AA oder Medien.</li>
		<li>Programmieren Sie einen extrazellulären Flussanalysator-Assay für eine 30-minütige Baseline-Atmungsphase (5 Zyklen mit 3-Minuten-Mix, 3-Minuten-Messung), 42-minütige Oligomycin-Messperiode (7 Zyklen 3-Minuten-Mix, 3-Minuten-Messung), 30 Minuten FCCP (5 Zyklen 3-Minuten-Mix, 3-Minuten-Messung) und 30 Minuten Rotenone/AA (5 Zyklen 3-Minuten-Mischung, 3-Minuten-Messung).</li>
		<li>Führen Sie den Test aus und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Sensor zu kalibrieren und die Mikroplatte einzulegen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribing+%CE%B2-cell+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcribing β-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li>
<li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li>
<li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420(1970).</li>
<li>Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li>
<li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139(2019).</li>
<li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion%3A+the+%CE%B2%2F%CE%B1%2F%CE%B4+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).</li>
<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+measurement+of+oxygen+consumption+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).</li>
<li>Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).</li>
<li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PLoS One. 7 (5), e33023(2012).</li>
<li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li>
<li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li>
<li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBS%2FBSA+media+concentration+determines+CCCP%27s+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li>
<li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+%28Rhesus%29+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Oxygen+Consumption+Rate+%28OCR%29+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Untersuchung des Sauerstoffverbrauchs der Insel wurde bisher durch die kugelförmige Form von Inselchen, deren mangelnde Haftung an Kulturoberflächen und die Anzahl der pro Brunnen benötigten Inselchen behindert. In diesem Protokoll unterstreichen wir die Wirksamkeit der 96-Well-Sphäroid-Mikroplatte zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Inselchen auf einer kleinen Anzahl von Inselchen und zeigen eine Technisch machbare und konsistente Technik zum Um- und Laden von Inselchen Ergebnisse.
D...

Um den normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten, muss die Pankreas-Zelle Erhöhungen in Glukose spüren und Insulin entsprechend absondern. Die Kopplung der Insulinsekretion mit dem Glukosespiegel ist direkt mit dem Glukosestoffwechsel und der Produktion von ATP durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung verbunden. Daher spielen Mitochondrien eine entscheidende Rolle bei der Stimulus-Sekretionskopplung1. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion der Zelle kann Defekte aufdecken, die zu einer beeinträchtigten Insulinsekretion führen. Die Sekretion von Glucagon durch Pankreaszellen ist ebenfalls eng mit der mitochondrialen Funktion2verbunden. Obwohl sich verewigte Inselzelllinien für einige Arten von Assays als nützlich erwiesen haben, rekapituliert die Physiologie dieser Zellen die Funktion der ganzen Insel inselnicht genau, wie die Potenzierung der Insulinsekretion durch Glucagon3,4 und die Hemmung der Glucagonsekretion durch Insulin/Somatostatin5,6 in intakten Inselchen zeigt. Dies zeigt die Notwendigkeit, den Sauerstoffverbrauch mit ganzen, intakten Inseln zu messen.
Techniken zur Messung der Isletzell-Respirometrie haben sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt, von der Verwendung von sauerstoffempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen7 bis hin zu Festkörpersensoren, die den Sauerstoffverbrauch direkt messen8. Ursprünglich für monolayer, haftende Zellen entwickelt, haben sich häufig verwendete Zellkulturplattensysteme als unwirksam für Pankreasinseln erwiesen. Da Inselchen nicht natürlich an den Brunnen haften, neigen sie dazu, an die Peripherie der Kultur brunnen geschoben zu werden, was zu einer ungenauen Messung des Sauerstoffverbrauchs9führt. Um dieses Problem zu bekämpfen, wurden spezialisierte 24-Well-Platten mit einer zentralen Depression entwickelt, die Inselchen enthalten könnte9. Das 24-Well-Plattensystem wurde jedoch durch die große Anzahl der benötigten Inseln (50-80 pro Brunnen) und die Anzahl der Bedingungen, die gleichzeitig getestet werden konnten,10begrenzt. Die jüngste Entwicklung von 96-Well-Mikroplatten, die speziell für die extrazelluläre Flussflussanalyse in Sphäroiden entwickelt wurden, hat diese Barrieren überwunden und ermöglicht die Messung der Inselrespirometrie mit 20 oder weniger Inselchen pro Brunnen10.
Hier zeigen wir die Verwendung dieses Systems zur Messung des Sauerstoffverbrauchs in Inselchen aus dem japanischen Makaken (Macaca fuscata), einem Tiermodell mit ähnlicher Inselbiologie wie Menschen11,12. In diesem Protokoll werden 15 Makakeninseln pro Brunnen analysiert. In unseren Händen produzierten 15 Inseln pro Brunnen einen höheren Ausgangssauerstoffverbrauch als weniger Inseln, mit robuster Aktivierung und Unterdrückung der Atmung als Reaktion auf pharmakologische Manipulation. Wir heben die Schritte zur Vorbereitung auf den Assay hervor, eine effektive Methode für das konsistente Laden von Inselchen in der Mitte jedes Brunnens und gemeinsame Herausforderungen bei der Durchführung dieses Assays.

<table><tbody><tr><td>Zellkulturschale, 60 mm x 15 mm Ausführung</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Zell- und Gewebekleber</td><td>Corning</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreie Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td>Für Glukoselösung, 200 mg/ml, steril fileteriert</td></tr><tr><td>Einweg-Reservoire (steril), 25 ML</td><td>Vistalab</td><td>3054-1033</td><td>zum Beladen von Mehrkanalpipetten</td></tr><tr><td>EZFlow Sterile 0,45 &mu; m PES Spritzenvorsatzfilter, 13 mm</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>371-3115-OEM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100x)</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Pipettenspitzen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94410810</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette, 15-1250 &mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672100BT</td><td>Empfohlene</td></tr><tr><td>P20-, P200- und P1000-Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>pH-Sonde</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2210-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen, 20 & mu; L, 200 &mu; L, 1000 &mu; L</td><td>Olympus</td><td>24-404, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Media</td><td>Agilent</td><td>103334-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Enthält Oligomycin, FCCP und Rotenon/Antimycin A</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7800B</td><td>Inklusive Vorbereitungsstation mit 37 > C Nicht-CO2-Inkubator</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini</td><td>Agilent</td><td>102905-100</td><td>Enthält Sensorpatrone, Sphäroid-Mikrotiterplatte und Kalibrant</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>100 mM (100x)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX9</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (steril), 5 mL</td><td>BD</td><td>309603</td><td>Für die Sterilfiltration</td></tr><tr><td>Wasser (steril)</td><td>Sigma</td><td>W3500-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen primaten-pankreas-islet

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

Die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroid-Clustern von Zellen, wie ex vivo Pankreasinseln, war historisch eine Herausforderung. Wir demonstrieren die Messung des Sauerstoffverbrauchs der Islet enmitieren mit einer 96-Well-Mikroplatte, die für die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroiden entwickelt wurde. In diesem Test werden Sphäroid-Mikroplatten am Tag vor dem Test mit einem Zell- und Gewebekleber beschichtet. Wir verwenden ein kleines Volumen an Klebstofflösung, um die Befolgung der Leten nur an der Unterseite des Brunnens zu fördern. Am Tag des Assays werden 15 Inselchen mit einer Technik, die eine optimale Positionierung der Inselchen und eine genaue Messung des Sauerstoffverbrauchs gewährleistet, direkt in die Basis jedes Brunnens geladen. Verschiedene Aspekte der mitochondrialen Atmung werden pharmakologisch in nichtmenschlichen Primateninseln untersucht, einschließlich ATP-abhängiger Atmung, maximaler Atmung und Protonenleck. Diese Methode ermöglicht konsistente, reproduzierbare Ergebnisse mit nur einer kleinen Anzahl von Inselchen pro Bohrplatz. Es kann theoretisch auf alle kultivierten Sphäroide ähnlicher Größe angewendet werden.

Um Inselchen in Mikroplatten zu laden, sollten 15 Inselchen in 15 l Medien angesaugt werden, wie in Abbildung 1Adargestellt. Inselchen werden sich natürlich innerhalb weniger Sekunden zur Unterseite der Pipettenspitze absetzen. Dann wird die Pipettenspitze auf den Boden des Brunnens abgesenkt. Die Spitze ist sehr leicht angehoben, und ein kleines Volumen (ca. 5 l) wird zusammen mit den Inselchen herausgepfetet. Diese Technik führt zu einer ko...

Dieses Protokoll demonstriert die genaue und reproduzierbare Messung des Sauerstoffverbrauchs in nichtmenschlichen Pankreasinseln. Die Beladetechniken der Isleten und die Beschichtung der Mikroplatte bieten einen Rahmen für eine effiziente Messung der Atmung in anderen Arten von kultivierten Sphäroiden.

Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs von einer kleinen Anzahl von Inselchen von relevanten Arten, wie nicht-menschlichen Primaten und Menschen, was eine Bewertung der mitochondrialen Funktion ermöglicht. Diese Technik kann mit einer kleinen Anzahl von Primärinseln durchgeführt werden, wodurch die technischen Replikationen erhöht werden, die Daser mehrere Bedingungen testen und die Strenge und Reproduzierbarkeit des Tests verbessern. Diese Technik bewertet die mitochondriale Gesundheit, eine wichtige Bestimmung der Islet-Funktion und Insulinsekretion, die oft bei Diabetes beeinträchtigt ist und ein signifikanter Prädiktor für eine erfolgreiche Islet-Transplantation ist.Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Inselchen nach dem Transfer in der Mitte der Brunnen lokalisiert sind. Geschieht dies nicht, führt dies zu inkonsistenten Sauerstoffverbrauchsmessungen. Die Demonstration dieses Verfahrens wird, Valerie Ricciardi, eine Studentin in meinem Labor arbeiten.Am Tag vor dem Test 200 Mikroliter Zell- und Gewebeklebstoff zu 2,8 Millilitern 0,1 Molar-Natriumbicarbonat-Lösung hinzufügen und 20 Mikroliter der resultierenden Lösung auf den Boden jedes Brunnens einer 96 well spheroiden Mikroplatte geben. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen von der Pipettenspitze entfernt werden. Wenn alle Brunnen beladen sind, legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius nicht-Kohlendioxid-Inkubator.Nach einer Stunde die Zellklebstofflösung in einer sterilen Umgebung von der Platte absaugen und jeden Brunnen zweimal mit 400 Mikrolitern 37 Grad Celsius sterilem Wasser waschen. Dann lassen Sie die Brunnen für 30 bis 40 Minuten trocknen, bevor Sie die Platte für die Nachtlagerung bei vier Grad Celsius bedecken. Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, öffnen Sie in einer sterilen Umgebung das Sensorpatronenpaket und entfernen Sie den Inhalt.Stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Versorgungsplatte und füllen Sie jeden Brunnen der Nutzplatte mit 200 Mikroliter sterilem Wasser. Wenn alle Brunnen geladen sind, senken Sie die Sensorpatrone in die Versorgungsplatte und legen Sie die montierte Sensorpatrone und Dienutzplatte über Nacht in den 37 Grad Celsius nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Entfernen Sie am Tag des Testes den Deckel der Sensorpatrone und dekantiert das Wasser aus den Brunnen der Versorgungsplatte.Fügen Sie 200 Milliliter vorgewärmten Kalibrant zu jedem Brunnen hinzu und ersetzen Sie den Deckel der Sensorpatrone. Legen Sie die Sensorpatrone dann für etwa eine Stunde wieder in den Inkubator. Um die Inselchen für den Transfer vorzubereiten, pflücken Sie die Inselchen von Hand in eine 60 mal 15 Millimeter große Zellkulturschale, die das zusammengesetzte Medium bis zu einer Reinheit von fast 100 % enthält.Wenn alle Inselchen gesammelt sind, laden Sie jeden Brunnen der vorbereiteten Sphäroid-Mikroplatte mit 175 Mikrolitern montiertem Medium und verwenden Sie eine P20-Pipette, die auf 15 Mikroliter eingestellt ist, um 15 Inselchen in 15 Mikroliter Medium aus der Zellkulturschale zu aspirieren. Um die Inselchen auf die Sphäroid-Mikroplatte zu säen, senken Sie die Pipettenspitze bis zum Boden des Brunnens, heben Sie kaum die Spitze an und geben Sie langsam etwa fünf Mikroliter Medium aus. Um die Inselchen in die Brunnen zu laden, lassen Sie die Inselchen in der Pipettenspitze absetzen, bevor Sie sie sanft direkt über dem Boden des Brunnenzentrums in einem kleinen Volumen von Medium loslassen.Bestätigen Sie, dass alle Inselchen die Pipettespitze verlassen haben, und überprüfen Sie gelegentlich die Sphäroid-Mikroplatte unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Inselchen an der Unterseite der Platte gesät sind und nicht an den Seiten der Brunnen kleben. Wenn alle Inselchen übertragen wurden, legen Sie die Mikroplatte in den 37 Grad Celsius nicht-Kohlendioxid-Inkubator. Vor Beginn des Assay-Verfahrens Port A der Sensorpatrone mit 20 Mikroliter frisch zubereitetem 45 Mikromolar-Oligomycin, Port B mit 22 Mikrolitern frisch zubereitetem 10 Mikromolaren FCCP und Port C mit 25 Mikroliterfrisch 25 Mikromolar-Rotona AA beladen. Als Nächstes programmieren Sie einen extrazellulären Flussanalysator-Assay für eine 30-minütige Baseline-Atmungsphase, 42 Minuten Oligomycin-Messzeit, 30 Minuten FCCP-Periode und 30 Minuten Rotone AA-Periode.Führen Sie dann den Test nach den Anweisungen auf dem Bildschirm aus, um den Sensor zu kalibrieren und die Mikroplatte einzulegen. Für die Inselabgabe an die Assayplatte sollten 15 Inselchen in 15 Mikrolitern Medium angesaugt werden, wie dargestellt. Diese Technik führt zu einer konsistenten Platzierung von Inselchen in der unteren Mitte jedes Mikroplattenbrunnens, was genaue Sauerstoffverbrauchsmessungen ermöglicht.In diesem repräsentativen Experiment, das den Sauerstoffverbrauch einzelner Brunnen zeigte, waren die Brunnen schlecht belastet, was zu einem sehr niedrigen Ausgangswert des Sauerstoffverbrauchs und wenig bis gar keiner Reaktion auf FCCP führte. In diesem Experiment zeigten die meisten Brunnen eine signifikante Grundatmung und Reaktion auf Medikamente. Jedoch, zwei Brunnen zeigten keine Reaktion auf Rotone, was darauf hindeutet, dass das Medikament nicht richtig in den Brunnen freigesetzt wurde.Diese Brunnen wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen. Hier können die Ergebnisse eines erfolgreichen Assays beobachtet werden, bei dem die Brunnen ordnungsgemäß mit Inselchen beladen und richtig mit Medikamenten injiziert wurden. Es ist von Vorteil, die Reagenzien und Platten am Tag vor der Durchführung des Assays vorzubereiten, damit die Inselchen kurz nach ihrer Isolation oder dem Erhalt verwendet werden können.Nach dem Test können die Inseln für die Protein- oder DNA-Extraktion zurückgewonnen werden, um die Sauerstoffverbrauchsdaten zu normalisieren oder den mitochondrialen DNA-Gehalt zu quantifizieren. Die Fähigkeit, die mitochondriale Funktion in einer kleinen Anzahl von primären Primateninseln zu messen, ermöglicht das Testen mehrerer Medikamente und anderer Manipulationen in einer einzigen biologischen Replikation. Personen, die mit primären Primateninseln arbeiten, sollten sicher sein, in der richtigen und sicheren Handhabung mit diesen Geweben geschult zu werden.Insbesondere die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die ordnungsgemäße Entsorgung dieser Proben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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