Dextran Etikettierung und Aufnahme in lebenden und funktionellen Murine Cochlear Haarzellen
8. Februar 2020
Hier präsentieren wir eine Methode zur Visualisierung der Aufnahme von 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditiven Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen. Darüber hinaus kann Dextrans von 3–10 kDa verwendet werden, um Endozytose im Haar und unterstützenden Zellen des Organs von Corti zu studieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Aufnahme von regulären Dextran fluoreszierend mit Texas Red in lebenden Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die drei Kilodalton Texas Red Dextran verwendet werden können, um die Mechanotransduktionskanalfunktion in lebenden Haarzellen zu bewerten. Um die Cochlea zu ernten, legen Sie den Schädel einer postnatalen Sechsermaus in eine 60-Millimeter-Kulturschale mit Leibovitz' L-15-Medium und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen Ende bis zum hinteren Ende des Schädels und über die äußeren Gehörskanäle zu machen.
Falten Sie die Haut in Richtung der Nase, um den Schädel freizulegen und einen Schnitt von hinten nach vorne des Schädels und über die Augenlinie zu machen. Trennen Sie den Schädel in zwei Hälften und verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um das Gehirn zu entfernen. Wenn die zeitlichen Knochen beobachtet werden können, verwenden Sie eine kleine Schere, um diese Knochen zu schneiden, um das Gewebe zu verbrauchen.
Untertauchen Sie die zeitlichen Knochen in die 35-Millimeter-Schale mit frischem L-15-Medium und legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop, das mit einem Weitfeld-Okular und einer externen Wechselstrom-Halogenlichtquelle ausgestattet ist. Verwenden Sie Zangen, um das umgebende Cochlea-Gewebe, halbkreisförmige Kanäle und vestibuläre Organe zu entfernen. Sobald die Cochlea seziert und in eine neue Schüssel mit frischen L-15-Medien gelegt wurde, verwenden Sie chirurgische Zangen, um eine Stichwunde am runden Fenster und eine Punktion im apikalen Cochlea-Bereich zu machen.
Wenn alle Cochleae geerntet sind, legen Sie das Gewebe in einen Brunnen einer neun Well-Glas-Depressionsplatte mit 200 Mikroliter frisches L-15 Medium. Für die Dextran-Kennzeichnung der isolierten Gewebe, ersetzen Sie das Medium aus jeder Probe gut mit 200 Mikroliter frisches L-15-Medium, ergänzt durch zwei Milligramm pro Milliliter der fluoreszenz konjugierten Dextran von Interesse. Inkubieren Sie die Proben für zwei Stunden bei Raumtemperatur und 25 Umdrehungen pro Minute in einem dreidimensionalen Shaker in einem geneigten Winkel von 25 Grad, der vor Licht geschützt ist.
Am Ende der Inkubation die Gewebe einmal mit Medium und einmal mit HBSS für zwei Minuten pro Wäsche waschen. Nach der zweiten Wäsche die Proben in 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, gefolgt von zwei schnellen und sanften Wäbungen in HBSS. Nach der zweiten Wäsche verwenden Sie feine Spitzenzange, um den Cochlea-Knochen, das Spiralband und die tektoriale Membran zu entfernen und das isolierte Organ von Corti in HBSS zu waschen.
Achten Sie beim Entfernen der transparenten tektorialen Membran besonders darauf, da das Gewebe an den Haarzellen während dieses Schritts leicht beschädigt werden kann. Um das F-Actin zu kennzeichnen, permeabilisieren Sie die Proben in 0,5%Triton X-100 in PBS, ergänzt durch 100 bis 200 Verdünnung von fluoreszierend markiertem Phalloidin für 30 Minuten bei Lichtschutz im Raum. Am Ende der Inkubation das Gewebe zwei- bis dreimal in frischem HBSS pro Waschgang waschen, wie gezeigt, gefolgt von einer einzigen Wäsche in PBS.
Verwenden Sie ein geeignetes Montagemedium, um das Organ von Corti-Geweben auf Glasmikroskop zu montieren, das Haarstereocilia Seiten nach oben schiebt und die Proben auf einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop mit dem 63X Öl-Immersion-Objektiv abbilden. Nach einer zweistündigen Inkubation mit drei Kilodalton-Dextran fluoreszierend konjugiert mit Texas Red, Organ von Corti Explant aus wilden Typ postnatalen Tag sechs Mäuse zeigen eine robuste und spezifische Kennzeichnung von inneren und äußeren Haarzellen. Die Bildgebung der Haarzellstereocilia und der Zellkörper zeigt, dass nur die Zellen, die drei Kilodalton Dextran Texas Red in ihren Zellkörper integriert haben, auch eine fluoreszierende Etikettierung ihrer Stereocilia demonstrierten.
Wichtig ist, dass entlang der Stereocilia ein gleichmäßiges fluoreszierendes Signal mit Anreicherung an den Spitzen der kürzeren Stereocilia-Reihen beobachtet wird, in denen sich der Mechanotransduktionskanal befindet. Vesikelartige Strukturen im Zellkörper der Haarzellen und der benachbarten Stützzellen werden ebenfalls beobachtet, was darauf hindeutet, dass Dextran Texas Red auch durch Endozytose aufgenommen werden kann. Größere 10 Kilodalton Dextrans produziert auch ein vesikelartiges Muster im Zellkörper von Haarzellen und unterstützenden Zellen.
Insbesondere verhindert das Vorhandensein eines Kalziumchelators oder mechanotransduktionskanalblockers die Stereocilia-Etikettierung und die Aufnahme von drei Kilodalton-Dextran Texas Red in Haarzellen. Das vesikelartige Muster wird jedoch immer noch in Gegenwart einer Mechanotransduktionskanalblockade beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses Aufnahmemuster unabhängig von funktionellen MET-Kanälen ist. Es ist sehr wichtig, das Organ des Corti-Gewebes sorgfältig zu sezieren und die richtige Ausrichtung der Haarzellen zu bestätigen, bevor das Gewebe für die Bildgebung montiert wird.
Nach der Dextran-Kennzeichnung von lebenden und funktionellen Haarzellen kann eine Immunfärbung des festen Gewebes durchgeführt werden, um bestimmte Zelltypen von Proteinen von Interesse zu identifizieren.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Visualisierung der Aufnahme von 3 kDa Texas Red-markiertem Dextran in auditorische Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen vorgestellt. Diese Technik ermöglicht die Beurteilung der Funktion von Mechanotransduktionskanälen in lebenden Haarzellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Hörforschung
Hintergrund
- Das Verständnis der Mechanotransduktion in den Haarzellen des Gehörs ist entscheidend für die Hörfunktion.
- Dextrans unterschiedlicher Größe können verwendet werden, um zelluläre Prozesse wie die Endozytose zu untersuchen.
- Das Corti-Organ ist eine Schlüsselformung in der Cochlea, die an der Hörfunktion beteiligt ist.
- Die fluoreszenzmarkierte Färbung hilft dabei, zelluläre Aufnahmeprozesse sichtbar zu machen.
Zweck der Studie
- Visualisierung der Aufnahme von Texas-Red-markiertem Dextran in lebenden auditorischen Haarzellen.
- Beurteilung der Funktionalität von Mechanotransduktionskanälen in diesen Zellen.
- Untersuchung des Einsatzes von Dextranen zur Erforschung der Endozytose in Haar- und Stützzellen.
Verwendete Methoden
- Isolierung der Cochlea von Mäusen am sechsten Tag nach der Geburt.
- Chirurgische Techniken zur Freilegung der cochleären Strukturen anwenden.
- Texas-Red-markiertes Dextran auf die auditorischen Haarzellen auftragen.
- Die Aufnahme mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisieren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Dextran-Aufnahme in lebenden Haarzellen.
- Nachgewiesene Funktionalität der Mechanotransduktionskanäle.
- Gewonnene Erkenntnisse über Endozytosemechanismen im Corti-Organ.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung der Hörzellbiologie.
Schlussfolgerungen
- Die Methode visualisiert effektiv die Aufnahme von Dextran in auditorische Haarzellen.
- Dieser Ansatz kann das Verständnis der Mechanotransduktion beim Hören verbessern.
- Zukünftige Studien können auf dieser Technik aufbauen, um verwandte zelluläre Prozesse zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Beurteilung der Funktionalität von Mechanotransduktionskanälen in lebenden auditorischen Haarzellen ist entscheidend für die Zielvalidierung bei Therapeutika gegen Hörverlust. Diese Methode liefert einen direkten, quantitativen Nachweis der Kanalaktivität mittels fluoreszierender Dextranaufnahme und ermöglicht so die mechanistische Absicherung von Zielstrukturen, die an der sensorischen Transduktion beteiligt sind. Der Ansatz unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit in der frühen Entdeckungsphase, indem er die molekulare Funktion mit dem zellulären Phänotyp in einem krankheitsrelevanten System verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die funktionelle Aktivität von Mechanotransduktionskanälen direkt in lebenden Haarzellen gemessen wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Entschärfung von Zielstrukturen durch einen robusten, bildbasierten Test für die Kanalfunktion.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffportfolios, indem Verbindungen identifiziert werden, die die Funktion des MET-Kanals erhalten oder modulieren, im Gegensatz zu solchen, die dies nicht tun.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsscreening vor, indem die MET-abhängige Dextran-Aufnahme als funktioneller Biomarker bestätigt wird.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt messbare Fluoreszenzsignale in den Stereozilien und im Zellkörper, die mit der Kanalaktivität korrelieren und über verschiedene Proben hinweg normalisiert werden können.
- Skalierbarkeit und Wiederverwendbarkeit: Ermöglicht die Anpassung der Plattform für die Hochdurchsatzanalyse der Farbstoffaufnahmekinetik in Organ-of-Corti-Explantaten.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verwendet postnatale murine Corti-Organkulturen als krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der Funktion auditorischer Haarzellen.
- Translationale Kontinuität: Schließt die Lücke zwischen Entdeckung und präklinischer Validierung, indem ein konsistenter Nachweis der MET-Aktivität über alle experimentellen Stadien hinweg bereitgestellt wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem Verbindungen identifiziert werden, die die Dextran-Aufnahme durch Blockade des MET-Kanals stören.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung zum Zielkandidaten bis hin zur Leitsubstanzidentifizierung ein, wobei die funktionelle Validierung von Mechanotransduktionskanälen der Substanz-Screening und -Optimierung vorausgeht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem sie einen direkten Nachweis der MET-Kanal-abhängigen zellulären Aufnahme in Haarzellen liefert.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Dextran-Markierungsprotokolle, die reproduzierbare, quantitative Fluoreszenzsignale in Stereozilien und Zellkörper ergeben.
- Analytik: Liefert messbare abhängige Variablen (Fluoreszenzintensität in Stereozilienreihen und vesikelähnliche Muster), die den Vergleich experimenteller Bedingungen und Wirkstoffeffekte ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem derselbe Nachweis der MET-Aktivität zur Beurteilung der Zielstrukturnbindung in Krankheitsmodellen verwendet wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Bewertung der sensorischen Transduktionsfunktion in verschiedenen auditorischen Forschungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Zuversicht bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten bei der Analyse von Mechanotransduktionswegen verringert werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch definierte Inkubations-, Wasch- und Abbildungsparameter für die Dextranaufnahme.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch, indem die Zielmodulation mit funktionellen Haarzell-Auslesungen verknüpft wird, wodurch das biologische Risiko in späteren Stadien reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf deren Wirkung auf die MET-abhängige Dextranaufnahme in einem krankheitsrelevanten System.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der murinen Cochleadissektion, der Isolierung des Corti-Organs und der Fluoreszenzmikroskopie.
- Setzt eine konfokale Abbildungstechnik mit geeigneten Laser- und Detektoreinstellungen für die Texas-Red-Fluoreszenz voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Dextrankonzentration, der Inkubationszeit und der Schüttelbedingungen über verschiedene Labore hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf verschiedene Säugetiermodelle oder Entwicklungsstadien angewendet wird.
- Ist durch die Notwendigkeit der frischen Gewebepräparation und die Empfindlichkeit der Haarzellen gegenüber mechanischen und umgebungsbedingten Belastungen während der Dissektion begrenzt.
