OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Unsere enzymatische Methode verwendet Proteinoligomer mit einer kontrollierten Anzahl von Polymerisationsgraden. Es ist eine perfekte Probenvorbereitung für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studie sowie die proteinbasierte Materialkonstruktion. Unsere Methode führt kein Cystein in das Zielprotein ein.

Da Cystein einer der wichtigsten funktionellen Rückstände für Proteine ist, erleichtert es den Aufbau von polymerisiertem Materieprotein oder Enzymen. Demonstriert wird das Verfahren von Yibing Deng und Shengchao Shi, Grad-Studenten aus meinem Labor. Zu Beginn 20 Gramm Kaliumchromat in 40 Milliliter Reinstwasser in einem Becher auflösen.

360 Milliliter konzentrierte Schwefelsäure langsam in die Kaliumdichromatlösung geben und mit einer Glasstange sanft rühren. Einen Glasdeckel in die Chromsäure geben und 30 Minuten bei 80 Grad Celsius in einen Ofen geben. Reinigen Sie den Deckelrutsch mit Wasser und dann absoluten Ethylalkohol und trocknen Sie den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom.

Tauchen Sie den Deckelschlupf in 1%Volumen pro Volumen APTES Toluluenlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur ein und schützen sie vor Licht. Waschen Sie den Deckelrutsch zuerst mit Toluin und dann mit absolutem Ethylalkohol und trocknen Sie den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom. Den Deckelrutsch bei 80 Grad Celsius 15 Minuten lang inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.

Verwenden Sie eine Pipette, um 200 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Sulfo-SMCC in DMSO-Lösung zwischen zwei immobilisierten Abdeckungen hinzuzufügen und für eine Stunde vor Licht geschützt zu inkubieren. Nach einer Stunde die Deckelmitlipse zuerst mit DMSO und dann mit absolutem Ethylalkohol waschen, um Denrest Sulfo-SMCC zu entfernen. Trocknen Sie den Deckelunterstrich unter einem Stickstoffstrom.

60 Mikroliter 200 Mikromolien GL-ELP-50 Cys-Protein-Lösung auf einen funktionalisierten Deckelschlupf und inkubieren bei 25 Grad Celsius für etwa drei Stunden. Danach den Deckelrutsch mit reinstem Wasser waschen, um die unreagierten GL-ELP-50-Cys zu entfernen. Um die funktionalisierte Auslegeroberfläche vorzubereiten, tauchen Sie zunächst die Ausleger in Chromsäure ein und reinigen Sie die Ausleger bei 80 Grad Celsius für 10 Minuten.

Verwenden Sie Wasser und absoluten Ethylalkohol, um die Säure wegzuwaschen. Tauchen Sie den Ausleger mit 1%Volumen pro Volumen APTES Tolululuin-Lösung ein, um eine Stunde lang eine Aminosalinisierung in einer Kunststoffrohrkappe durchzuführen. Spülen Sie den Ausleger mit absolutem Ethylalkohol und backen Sie den Ausleger bei 80 Grad Celsius 15 Minuten.

Den Ausleger eine Stunde in Sulfo-SMCC-Lösung eintauchen und dann mit absolutem Ethylalkohol abspülen. Um die cys-ELP-50-NGL mit der Oberfläche zu verbinden, tauchen Sie die Ausleger 1,5 Stunden lang in die cys-ELP-50-NGL mit der Maleimidgruppe von Sulfo-SMCC ein. Dann waschen Sie die unreagierten Zys-ELP-50-NGL auf dem Ausleger durch Reinstwasser weg.

Als nächstes tauchen Sie einen funktionalisierten Ausleger in eine Lösung ein, die 200 Mikroliter 50 Mikroliter GL-CBM-XDockerin-Proteinlösung mit 200 Nanomolar OaAEP1 enthält, und legen Sie sie 20 bis 30 Minuten bei 25 Grad Celsius ab. Verwenden Sie dann den AFM-Puffer, um unreagiertes Protein wegzuwaschen. Es ist wichtig, unreagiertes Restprotein vor dem AFM-Experiment wegzuwaschen, da es ein Kohesin-Dockerin-Paar bildet und der Block der Ausleger, um neues Protein auf der Oberfläche aufzunehmen.

Um das Ligationseinheit-Cohesin-T-L-Protein von interest-NGL mit dem auf der Deckbedeckungsoberfläche immobilisierten GL-ELP-50 zu verbinden, fügen Sie 15 Mikroliter OaAEP1 auf den Deckelschlupf ein und lassen es 30 Minuten brüten. Verwenden Sie 15 bis 20 Milliliter AFM-Puffer, um unreagierte Proteine wegzuwaschen. Fügen Sie 100 Mikroliter TEV-Protease hinzu, um die Proteineinheit am TEV-Erkennungsstandort eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius zu spalten.

Verwenden Sie dann 15 bis 20 Milliliter AFM-Puffer, um Restproteine wegzuwaschen. Verknüpfen Sie die Ligationseinheit cohesin-T-L-Protein von interest-NGL 30 Minuten lang mit dem GL-ubiquitin-NGL Glas von OaAEP1. Je nach Proteinkonstrukte GL-Ubiquitin-NGL, die auf der Glasoberfläche aufgebaut werden soll, wiederholen Sie die Polyproteinvorbereitungsschritte n1 mal.

Lassen Sie die letzte TEV-Spaltungsreaktion aus, um Cohesin auf dem Proteinpolymer als Cohesin-TEV-L-Ubiquitin-n-NGL-Glas zu reservieren. Fügen Sie einen Milliliter AFM-Puffer mit 10 Millimolar Calciumchlorid und fünf Millimolar-Ascorbinsäure in die AFM-Flüssigkeitskammer. Wählen Sie die D-Spitze der funktionalisierten AFM-Sonde für das Experiment aus.

Tauchen Sie die Sonde in den AFM-Puffer ein. Ziehen Sie den Ausleger mit einer konstanten Geschwindigkeit von 400 Nanometern pro Sekunde von der Oberfläche ab. Zeichnen Sie in der Zwischenzeit die Kraftverlängerungskurve mit einer Abtastrate von 4.000 Hertz auf.

Verwenden Sie den Equipartitionssatz, um den Ausleger im AFM-Puffer vor jedem Experiment mit einem genauen Federkonstanten-K-Wert zu kalibrieren. Befestigen Sie die mit Dockerin funktionalisierte Auslegerspitze an der mit Kohesin funktionalisierten Protein-Ablagefläche, um das Kohesin-Dockerin-Paar zu bilden. Öffnen Sie dann die JPK-Datenverarbeitungssoftware und wählen Sie die Kraftverlängerungskurve mit dem charakteristischen Sägezahn-ähnlichen Muster und einer hohen Absenkraft.

In dieser Studie hatten die NGL-Rückstände, die durch OaAEP1-Ligation zwischen benachbarten Proteinen eingebracht wurden, keinen Einfluss auf die Proteinmonomerstabilität im Polymer, ausgedrückt als die Entfaltungskraft und das Contra-Längen-Inkrement mit früheren Studien vergleichbar war. Die Reinigung von Eisenform Rubredoxin zeigte typische UV-visualisierte Absorptionsspitzen bei 495 Nanometern und 575 Nanometern, während die Zinkform dies nicht tat. SDS-Seiten-Gel-Ergebnisse der schrittweisen Verdauung und Ligation zeigen kohäsives TEV-L-Ubiquitin, die Ergebnisproteinmischung aus TEV-Spaltung, reiner GFP-TEV-Protease und gereinigtem Produkt GL-Ubiin.

Die gespaltete GL-Ubiquitin und Cohesin-TEV-L-Ubiquitin Ligationsmischung mit oder ohne OaAEP1 und reines OaAEP1 werden ebenfalls gezeigt. Es ist wichtig, die Oberfläche mit aktivem Sulfo-SMCC für eine erfolgreiche Peptidbefestigung zu funktionalisieren. Hier bieten wir eine neue Methode, um polymerisiertes Protein zu bauen.

Es erleichtert Forschern, komplexe Proteinsysteme mit einer Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zu untersuchen. Chromsäure ist stark korrosiv und sauer. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie es vorbereiten und behandeln.