Name: OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie die enzymatische Polymerisation von Proteinen für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Synthese von Proteinpolymeren ohne Cystein-Einführung.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. BK20160639) und Shuangchuang-Programm der Provinz Jiangsu.

1. Proteinproduktion
<ol><li>
Genklon
	<ol>
<li>Kaufen Sie Gene, die für das Protein von Interesse (POI) kodieren: Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, das Cellulose-Bindungsmodul (CBM), dockerin-X Domain (XDoc) und Kohäsion aus Ruminococcus flavefacience, Tabak-Etch-Virus (TEV) Protease, Elastin-ähnliche Polypeptide (ELPs).</li>
		<li>Führen Sie polymerase-Kettenreaktion durch und verwenden Sie das Drei-Restriktions-Verdauungsenzymsystem BamHI-BglII-KpnI, um das Gen aus verschiedenen Proteinfragmenten zu rekombinieren.</li>
		<li>Bestätigen Sie alle Gene durch direkte DNA-Sequenzierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proteinexpression und -produktion
	<ol>
<li>Transformieren Sie E. coli BL21(DE3) mit dem pQE80L-POI oder pET28a-POI Plasmid zur Expression.</li>
		<li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie in 15 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika (z. B. 100 g/ml Ampicillin-Natriumsalz oder 50 g/ml Kanamycin). Schütteln Sie die Kulturen bei 200 Umdrehungen von Euro bei 37 °C für 16-20 h.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Nachtkulturen in 800 ml LB-Medium (1:50 Verdünnung). Zentrifugieren Sie bei Rubredoxin die Kultur bei 1.800 x g, setzen Sie sie dann in 15 ml M9-Medium (ergänzt mit 0,4% Glukose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4) aus und verdünnen Sie sie dann in 800 ml M9-Medium.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C, während sie bei 200 Umdrehungen von mir schüttelt, bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,6 erreicht. Speichern Sie 100 l Probe der Kultur als Vorinduktionskontrolle für die Prüfung der Proteinexpression.</li>
		<li>Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM und schütteln Sie die Kultur bei 37 °C für 4 h bei 200 Rprossen. Reservieren Sie eine 100-L-Probe der Kultur als Nachinduktionskontrolle für die Prüfung der Proteinexpression.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Kultur bei 13.000 x g für 25 min bei 4 °C und lagern Sie bei -80 °C vor der Reinigung. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reinigung von Proteinvon Interesse
	<ol>
<li>Setzen Sie die Zellen in 25 ml Lysepuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 mit DNase, RNase, PMSF) wieder auf und verwenden Sie einen Beschallungsmittel (15% Amplitude), um sie 30 min auf Eis zu lysieren.</li>
		<li>Das Zelllysat bei 19.000 x g 40 min bei 4 °C klären.</li>
		<li>1 ml (Bettvolumen) co-NTA oder Ni-NTA Affinitätssäule packen und die Säule mit 10 Säulenvolumina (CV) Reinstwasser und dann 10 CVs Waschpuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM Imidazol, pH 7,4) durch Schwerkraftfluss waschen.</li>
		<li>Passieren Sie das Protein-Übertät durch die Säule durch Schwerkraftfluss für dreimal.</li>
		<li>Gießen Sie den Waschpuffer auf die Säule mit 50 Lebensläufen, um Schadstoffproteine wegzubewegen.</li>
		<li>Das gebundene Protein mit 3 Lebensläufen eiskalter Elutionspuffer (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,4) zu verleuchten. Bei Rubredoxin-Proteinen ist eine weitere Anionenaustauschreinigung mittels Anionenaustauschsäule bei pH 8,5 bei 4 °C erforderlich.</li>
		<li>Analysieren Sie das Beispiel nach SDS-PAGE.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Funktionalisierung der Deck- und Auslegeroberfläche
<ol><li>
Funktionalisierte Deckslip-Oberflächenvorbereitung
	<ol>
<li>20 g Kaliumchromat in 40 ml Reinstwasser auflösen. 360 ml konzentrierte Schwefelsäure mit Glasstab langsam umrühren und die Chromsäure zuzubereiten, 360 ml konzentrierte Schwefelsäure langsam zugeben. VORSICHT: Die hier verwendete Chemikalie und die endgültige Chromsäure ist stark korrosiv und sauer. Arbeiten Sie mit der richtigen Schutzausrüstung. Die Lösung gibt Wärme ab, wenn konzentrierte Schwefelsäure hinzugefügt wird, was bedeutet, dass das Hinzufügen und die richtige Pause zum Abkühlen langsam ist.</li>
		<li>Reinigen und aktivieren Sie einen Glasdeckel bei 80 °C für 30 min durch Chromsäurebehandlung. Tauchen Sie die Abdeckungen vollständig in 1% (v/v) APTES Toluenlösung für 1 h bei Raumtemperatur ein und schützen Sie sie vor Licht.</li>
		<li>Den Deckelrutsch mit Toluin und absolutem Ethylalkohol waschen und den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom trocknen.</li>
		<li>Den Deckelrutsch bei 80 °C 15 min inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 l Sulfo-SMCC (1 mg/ml) in Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösung zwischen zwei immobilisierten Abdeckungen und Inkubation für 1 h vor Licht geschützt.</li>
		<li>Waschen Sie den Deckelrutsch zuerst mit DMSO und dann mit absolutem Ethylalkohol, um Restsulfo-SMCC zu entfernen.</li>
		<li>Trocknen Sie den Deckelunterstrich unter einem Stickstoffstrom.</li>
		<li>Pipetten Sie 60 l von 200 'M GL-ELP50nm-C Proteinlösung auf einen funktionalisierten Deckelschlupf und inkubieren für ca. 3 h.</li>
		<li>Waschen Sie den Deckelrutsch mit reinstem Wasser, um den unreagierten GL-ELP50nm-C zu entfernen. HINWEIS: Funktionalisierte Abdeckungen sind für etwa zwei Wochen unter Lagerung bei 4 °C in der Lage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Funktionalisierte Freischwinger-Oberflächenvorbereitung
	<ol>
<li>Reinigen Sie die Ausleger bei 80 °C für 10 min durch Chromsäurebehandlung.</li>
		<li>Funktionalisieren Sie den Ausleger durch Amino-Silanisierung mit 1% (v/v) APTES Tolululuonlösung und backen Sie den Ausleger dann 15 min bei 80 °C, bevor er zu Sulfo-SMCC konjugiert wird.</li>
		<li>Verknüpfen Sie den C-ELP50nm-NGL mit der Oberfläche mit der Maleimidgruppe von Sulfo-SMCC für 1,5 h.</li>
		<li>Waschen Sie den unreagierten C-ELP50nm-NGL auf dem Deckelrutsch durch Reinstwasser weg.</li>
		<li>Tauchen Sie einen funktionalisierten Ausleger in 200 L mit 50 M GL-CBM-XDoc-Proteinlösung ein, die 200 nM OaAEP1 bei 25 °C für 20-30 min enthält. Dann verwenden Sie AFM-Puffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4), um unreagiertes Protein wegzuwaschen. HINWEIS: Die Oberflächenchemie der Ausleger und der Deckslip sind ähnlich.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Schrittweise Polyproteinzubereitung mit kontrollierten Sequenzen
<ol><li>Verknüpfen Sie die Ligationseinheit Coh-tev-L-POI-NGL mit dem GL-ELP50nm, der von OaAEP1 30 min auf der Deckbedeckungsfläche immobilisiert ist.</li>
	<li>Verwenden Sie 15-20 ml AFM-Puffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4), um unreagierte Proteine wegzuwaschen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l TEV-Protease (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] Glycerin, pH 8,0) hinzu, um die Proteineinheit an der TEV-Erkennungsstelle für 1 h bei 25 °C zu spalten.</li>
	<li>Verwenden Sie 15-20 ml AFM-Puffer, um Restproteine wegzuwaschen.</li>
	<li>Verknüpfen Sie die Ligationseinheit Coh-tev-L-POI-NGL 30 min mit dem GL-Ub-NGL-Glass von OaAEP1.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3,3 bis 3,5 N-1 mal, um das Proteinkonstrukt GL-(Ub)n-NGL auf der Glasoberfläche zu bauen. Lassen Sie die letzte TEV-Spaltungsreaktion aus, um Kohesin auf dem Proteinpolymer als Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass zu reservieren.</li>
</ol>4. AFM Experimentmessung und Datenanalyse
<ol><li>
AFM-Messungen
	<ol>
<li>1 ml AFM-Puffer mit 10 mM CaCl2 und 5 mM Ascorbinsäure in die Kammer geben.</li>
		<li>Wählen Sie die D-Spitze der funktionalisierten AFM-Sonde für das Experiment aus. Verwenden Sie den Equipartitionssatz, um den Ausleger im AFM-Puffer vor jedem Experiment mit einem genauen Federkonstantenwert (k) zu kalibrieren.</li>
		<li>Befestigen Sie die Auslegerspitze an der Probenoberfläche, um das Paar Cohesin/Dockerin zu bilden.</li>
		<li>Ziehen Sie den Ausleger mit einer konstanten Geschwindigkeit von 400 nmvon der Oberfläche ein. Zeichnen Sie in der Zwischenzeit die Kraftverlängerungskurve mit einer Abtastrate von 4000 Hz auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Datenanalyse
	<ol>
<li>Verwenden Sie JPK-Datenverarbeitung select force-extension traces.</li>
		<li>Verwenden Sie Software, um die Ablaufverfolgungen zu analysieren. Passen Sie die Kurven mit dem Wurm-like-Chain (WLC) Modell der Polymerelastizität an und erhalten Sie Entfaltungskraft und Konturlängeninkremente für einzelne Protein-Entfaltungsspitzen.</li>
		<li>Passen Sie die Histogramme der sich entfaltenden Kräfte mit dem Gaußschen Modell an, um die wahrscheinlichsten Werte der Entfaltungskraft (<Fu>) und des Konturlängeninkrements (<-Lc>) zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir haben ein Protokoll zur enzymatischen Biosynthese und Immobilisierung von Polyprotein beschrieben und das Polyproteindesign durch AFM-basierte SMFS verifiziert. Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz für den Aufbau des Protein-Polymers in einer entworfenen Sequenz, die frühere Methoden für Polyprotein-Engineering und Immobilisierung4,6,52,53,54,...

Im Vergleich zu synthetischen Polymeren haben natürliche Mehrdomänenproteine eine einheitliche Struktur mit einer gut kontrollierten Anzahl und Art der Subdomains1. Diese Funktion führt in der Regel zu einer verbesserten biologischen Funktion und Stabilität2,3. Viele Ansätze, wie z. B. die Zysulfidbindungskopplung und die rekombinante DNA-Technologie, wurden für den Aufbau eines solchen polymerisierten Proteins mit mehreren Domänen4,5,6,7entwickelt. Die erste Methode führt jedoch immer zu einer zufälligen und unkontrollierten Sequenz, und die zweite führt zu anderen Problemen, einschließlich der Schwierigkeit für die Überexpression toxischer und großformatigen Proteine und der Reinigung komplexer Proteine mit Kofaktor und anderen empfindlichen Enzymen.
Um dieser Herausforderung gerecht zu werden, entwickeln wir eine enzymatische Methode, die Proteinmonomer für Polymer/Polyprotein schrittweise mit einer Proteinligase OaAEP1 in Kombination mit einem Protease TEV8,9konjugiert. OaAEP1 ist eine strenge und effiziente Endopeptidase. Zwei Proteine können kovalent als Asn-Gly-Leu-Sequenz (NGL) durch zwei Termini von OaAEP1 in weniger als 30 min verbunden werden, wenn der N-Terminus Gly-Leu-Rückstände(GL) und das andere, von dem der C-Terminus NGL-Rückstände10ist. Die Verwendung von OaAEP1 führt jedoch nur zur Verknüpfung von Proteinmonomer zu einem Proteinpolymer mit einer unkontrollierten Sequenz wie der Cystein-basierten Kopplungsmethode. Daher entwerfen wir den N-Terminus der Proteineinheit mit einer abnehmbaren TEV-Protease-Site plus einem Leucin-Rückstand als ENLYFQ/G-L-POI. Vor der TEV-Spaltung würde das N-Terminal nicht an der OaAEP1-Liga teilnehmen. Und dann werden die GL-Rückstände am N-terminus, die mit weiterer OaAEP1-Ligatur kompatibel sind, nach der TEV-Spaltung freigelegt. So haben wir eine sequenzielle enzymatische Biosynthesemethode von Polyprotein mit einer relativ gut kontrollierten Sequenz erreicht.
Hier kann unsere schrittweise enzymatische Synthesemethode in der Polyproteinprobenvorbereitung eingesetzt werden, einschließlich sequenzgesteuerter und unkontrollierter, und Proteinimmobilisierung auch für Einzelmolekül-Studien, insbesondere für das komplexe System wie Metalloprotein.
Darüber hinaus ermöglichen uns AFM-basierte SMFS-Experimente, die Proteinpolymerkonstruktion und -stabilität auf Einzelmolekülebene zu bestätigen. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie, einschließlich AFM, optischer Pinzette und magnetischer Pinzette, ist ein allgemeines Werkzeug in der Nanotechnologie, um Biomoleküle mechanisch zu manipulieren und deren Stabilität zu messen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein-Molekül AFM wurde weit verbreitet in der Untersuchung von Protein (un)folding21,22,23,24,25, die Festigkeitsmessung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische Bindung20,36,37,38,39,40,41,42,43 und Metall-Ligand-Bindung in Metallprotein44,45,46,47,48,49,50 . Hier wird einmolekulares AFM verwendet, um die synthetisierte Polyproteinsequenz auf Basis des entsprechenden Proteinentfaltungssignals zu verifizieren.

<table><tbody><tr><td>Eisen (III)-chlorid hexahydrat</td><td>Energiechemikalie</td><td></td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Zinkchlorid</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>100,00 %</td></tr> <tr><td>Calciumchloridhydrat</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>99,9965 % kristallines Aggregat</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma Life Science</td><td></td><td>Bio Xtra, &ge; 99,0%, kristallin</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)-Triethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>&ge&ge; 99%</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>90%</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Macklin</td><td></td><td>99%</td></tr><tr><td>5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoesäure)</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene</td><td>Genscript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanowizard 4 AFM</td><td>JPK Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLCT Ausleger</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mono Q 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Segel Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel-Bildsystem</td><td>Tanon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oaaep1-vermittelte enzymatische synthese und immobilisierung von polymerisiertem protein für die einzelmolekül-kraftspektroskopie

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemische und biokonjugationische Techniken wurden in den letzten Jahren schnell entwickelt und ermöglichen den Aufbau von Proteinpolymeren. Ein kontrollierter Proteinpolymerisationsprozess ist jedoch immer eine Herausforderung. Hier haben wir eine enzymatische Methodik entwickelt, um polymerisiertes Protein Schritt für Schritt in einer rational gesteuerten Sequenz zu konstruieren. Bei dieser Methode ist der C-Terminus eines Proteinmonomers NGL für die Proteinkonjugation mit OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), während der N-Terminus eine skleavable TEV (Tabak-Etch-Virus) Spaltungsstelle plus ein L (ENLYFQ/GL) zum vorübergehenden N-Terminal-Schutz war. Folglich konnte OaAEP1 jeweils nur ein Proteinmonomer hinzufügen, und dann spaltete die TEV-Protease die N-Terminus zwischen Q und G, um den NH2-Gly-Leu freizulegen. Dann ist das Gerät bereit für die nächste OaAEP1 Ligation. Das entwickelte Polyprotein wird durch Die Entfaltung einzelner Proteindomäne mittels atomarer Mikroskopie-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (AFM-SMFS) untersucht. Daher bietet diese Studie eine nützliche Strategie für Die Polyprotein-Engineering und Immobilisierung.

Die NGL-Rückstände, die durch OaAEP1-Ligation zwischen benachbarten Proteinen eingebracht werden, haben keinen Einfluss auf die Proteinmonomerstabilität im Polymer, da die Entfaltungskraft (<f>u&gt;) und das Konturlängeninkrement (&lt;-Lc&gt;) mit der vorherigen Studie vergleichbar ist (Abbildung 1). Das Reinigungsergebnis des Rubredoxin-Proteins ist in Abbildung 2dargestellt. Um das Protein nach der TEV-Spaltung zu beweisen, ist es kompatibel mit der...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Unsere enzymatische Methode verwendet Proteinoligomer mit einer kontrollierten Anzahl von Polymerisationsgraden. Es ist eine perfekte Probenvorbereitung für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studie sowie die proteinbasierte Materialkonstruktion. Unsere Methode führt kein Cystein in das Zielprotein ein.Da Cystein einer der wichtigsten funktionellen Rückstände für Proteine ist, erleichtert es den Aufbau von polymerisiertem Materieprotein oder Enzymen. Demonstriert wird das Verfahren von Yibing Deng und Shengchao Shi, Grad-Studenten aus meinem Labor. Zu Beginn 20 Gramm Kaliumchromat in 40 Milliliter Reinstwasser in einem Becher auflösen.360 Milliliter konzentrierte Schwefelsäure langsam in die Kaliumdichromatlösung geben und mit einer Glasstange sanft rühren. Einen Glasdeckel in die Chromsäure geben und 30 Minuten bei 80 Grad Celsius in einen Ofen geben. Reinigen Sie den Deckelrutsch mit Wasser und dann absoluten Ethylalkohol und trocknen Sie den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom.Tauchen Sie den Deckelschlupf in 1%Volumen pro Volumen APTES Toluluenlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur ein und schützen sie vor Licht. Waschen Sie den Deckelrutsch zuerst mit Toluin und dann m

oaaep1-mediated-enzymatic-synthesis-immobilization-polymerized

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

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Erfahren Sie die enzymatische Polymerisation von Proteinen für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Synthese von Proteinpolymeren ohne Cystein-Einführung.

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