Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Die meisten Mais-Inzuchtlinien können nicht mit herkömmlichen Transformationsprotokollen genetisch transformiert werden. Hier beschreiben wir eine QuickCorn-Transformationsmethode, die schnell und weniger genotypabhängig ist. Die QuickCorn-Methode verwendet Mais-Transkriptionsfaktoren BABY BOOM und WUSCHEL.

Wenn diese Gene in das Transformationsvektorsystem integriert sind, arbeiten sie synergistisch, um das embryogene Wachstum zu stimulieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Maistransformationsprotokollen beinhaltet die QuickCorn-Methode während der Transformation keinen Callus-Induktionsschritt. Die T-DNA-Region des binären Vektors, der in unserer Arbeit verwendet wird, enthält drei Schlüsselkomponenten, morphogene Gene, Markergene und das Cre/LoxP-Rekombinationssystem.

Das wärmeinduzierte Cre/LoxP-Rekombinationssystem wurde in die T-DNA aufgenommen, um die morphogenen Gene aus dem Maisgenom zu entfernen, um eine normale Callusregeneration in der Pflanzenentwicklung zu ermöglichen. Etwa zwei bis drei Tage, nachdem Seiden entstanden sind und wenn Pollen am nächsten Tag verfügbar sein werden, schneiden Sie die Seiden und Schale mit 70% Ethanol-sterilisierten Scheren, etwa 2 1/2 Zentimeter unter dem Ende der Schalenblätter, wo die Seiden auftauchen, und bedecken Sie die Seide mit einem Schießbeutel. Sobald Anthers aus einer Quaste auftauchen, bedecken Sie die Quaste mit einer Quastetasche und legen Sie eine rutschige Büroklammer an die Basis der Tasche um den Stiel.

Am Morgen nach dem Platzieren der Quaste Tasche, sanft biegen Sie die Pflanze, und tippen Sie auf den Beutel, um Pollen zu fördern, freigesetzt werden. Entfernen Sie dann den Quastenbeutel und falten Sie die Oberseite des Beutels um, um zu verhindern, dass Pollen entweichen. Um eine Empfängerpflanze zu bestäubern, setzen Sie die Seiden aus und gießen Sie schnell Pollen aus dem Quastenbeutel auf die Seiden.

Bedecken Sie sofort das bestäubte Ohr mit dem Quastenbeutel und sichern Sie die Basis der Tasche um den Stiel mit Heftklammern. Um die unreife Embryogröße neun bis zwölf Tage nach der Bestäubung zu überprüfen, ziehen Sie die Schale vorsichtig nach unten, um die Kerne bei etwa 1/3 bis 1/4 des Umfangs des Ohres und etwa 1/3 des Abstands nach unten des Ohres freizulegen. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Kappe eines einzelnen Kernels abzuschneiden, der der Mehrheit der anderen Kerne in Größe und Farbe ähnelt, und verwenden Sie einen Spachtel mit einem Lineal, um den Embryo zu extrahieren.

Verwenden Sie dann das Lineal oder einen Bremssattel, um die Länge des Embryos zu messen. Innerhalb von ein bis vier Tagen nach der Ernte die Schalen und Seiden von den geernteten Ohren entfernen und einen geeigneten Griff in die Oberseite oder die Basis jedes Ohres einfügen. Tauchen Sie die Ohren in einen großen Behälter mit Desinfektionsbleichlösung in einer sterilen laminaren Durchflusshaube mit nach oben gerichtetem Griff ein.

Nach 20 Minuten die Ohren dreimal mit einem großzügigen Volumen an frischem sterilem destilliertem Wasser für fünf Minuten pro Wäsche abspülen, bevor die Ohren mehrere Minuten trocknen. Als nächstes füllen Sie ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr pro Ohr mit 700A flüssigem Medium, und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die oberen ein bis zwei Millimeter jeder Kernkrone zu entfernen, um das Endosperm des Ohres freizulegen. Suchen Sie den unreifen Embryo im Kern auf der Seite mit Blick auf die Ohrspitze, in der Nähe der Befestigung an der Cob.

Für Top-Handler und Rechtshänder, ruhen Sie das Ohr auf eine große sterile Petrischale, und legen Sie einen Mikro-Spachtel in das Endosperm in der Perikarpfen am weitesten weg vom Embryo. Drehen Sie vorsichtig nach oben, um das Endosperm zu vertreiben und den Embryo freizulegen, und verwenden Sie den Spachtel, um den Embryo vorsichtig in eine Röhre mit 700A flüssigem Medium zu legen. Für Basishandler, die das Ohr mit der linken Hand halten, legen Sie einen Mikrospachtel in das Endosperm in den Pericarp, der am weitesten vom Embryo entfernt ist, und drehen Sie sich sanft nach oben, um das Endosperm zu lösen.

Um die Embryonen in einer Agrobacterium Suspensionskultur zu kultivieren, sammeln Sie Bakterien aus einer frisch zubereiteten Arbeitsplatte in 10 Milliliter 700A flüssiges Medium und Wirbel, um die Bakterienkultur vollständig auszusetzen. Messen Sie die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern und waschen Sie die Embryonen mit einem Milliliter frischem 700A-Medium. Tauchen Sie die Embryonen in einen Milliliter Agrobacterium Suspension, und Wirbel auf einer niedrigen Einstellung für 30 Sekunden.

Setzen Sie die Embryonen mit den Rohren in horizontaler Ausrichtung fünf Minuten lang auf die Bank, bevor Sie den gesamten Inhalt jedes Rohres auf einzelne Platten des 562V-Anbaumediums übertragen. Wirbeln Sie die Platten sanft, um die Embryonen gleichmäßig zu verteilen, und saugen Sie die überschüssige Agrobacterium Suspension an. Richten Sie die Embryonen sorgfältig mit der kuppelförmigen Seite nach oben aus, wobei Darauf geachtet wird, dass die Embryonen nicht beschädigt werden.

Dann legen Sie Teller in Plastikboxen für eine nächtliche Inkubation bei 21 Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Morgen, sorgfältig übertragen infizierte Embryonen auf ruhende Medium 605T, legen Sie etwa 30 Embryonen pro Platte, scutellum Seite nach oben, für eine vier- bis 10-Tage-Inkubation bei 26 Grad Celsius im Dunkeln. Nach etwa sieben Tagen kann die somatische Embryoentwicklung auf der Oberfläche des zygotischen Scutellums beobachtet werden.

Am Ende der Ruhezeit stellen Sie die Schachtel mit Embryonen in einen 45-Grad-Celsius-Inkubator mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit für zwei Stunden, gefolgt von einer ein- bis zweistündigen Inkubation bei 26 Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation 10 bis 15 hitzegeschockte unreife Embryonen auf einzelne Platten des Triebbildungsmediums legen, ergänzt um 05 Milligramm pro Liter des Herbizids Imazapyr als selektives Mittel. Entfernen Sie vorsichtig alle Kolotile nach Bedarf, und bringen Sie die Embryonen für zwei Wochen in den 26-Grad-Grad-Celsius-Dunkelbrutschrank zurück.

Am Ende der Inkubation etwa acht Gewebestücke pro Platte auf verwurzelende Mittelplatten für eine ein- bis zweiwöchige Inkubation mit 16 Stunden Licht und acht Stunden Dunkelheit bei 27 Grad Celsius übertragen. Wenn sich Pflanzenentwickeln entwickeln, legen Sie ein stärkeres Pflanzgefäß, das sowohl Triebe als auch kräftige Wurzeln enthält, weitere sieben bis 14 Tage unter Licht auf einzelne Platten des Wurzelmediums. Lassen Sie Triebe, die noch nicht vollständig entwickelt sind, für weitere ein bis zwei Wochen auf demselben Medium bebrütet werden, bis sie bereit sind, auf den Boden zu bewegt zu werden.

Wenn die Pflanze kräftiger wird, spülen Sie die Wurzeln mit Leitungswasser ab, um Agar zu entfernen. Dann verpflanzen Sie die einzelnen Pflanzen in Drei-Zoll-Töpfe, die ein vorbenetztes bodenloses Substrat in einer Schale mit Abflusslöchern enthalten, und legen Sie das Tablett in eine Wachstumskammer mit oder ohne Kunststoff-Feuchtigkeitskuppel. Neun bis 14 Tage nach dem Topftransfer jede Pflanze mit Erde in einen 1,5-Gallonen-Topf transplantieren.

Fügen Sie einen kontrolliert freigesetzten Dünger in den Topf und halten Sie die Pflanzen im Gewächshaus. Wenn Ohrsprossen aus der Pflanze zu entstehen beginnen, verwenden Sie eine halbtransparente Schießtasche, um die Triebe zu bedecken, so dass die entstehenden Seiden beobachtet werden können, ohne den Beutel zu entfernen. Dann bestäubisieren Sie die Pflanzen in der entsprechenden Entwicklungsstufe, wie gezeigt.

Die Maisohren werden in der Regel neun bis zwölf Tage nach der Bestäubung geerntet. Unreife Embryonen mit Längen zwischen 1,5 und zwei Millimetern sind die besten Explants für die Transformation für dieses Protokoll. Acht Tage nach der Infektion können ZsGreen-extierende somatische Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden.

Die Wärmebehandlung acht Tage nach der Infektion induziert eine crerekombinatore Expression, was zur Exzision der morphogenen Gen-, Cre- und ZsGreen-Expressionskassetten führt, die zwischen den beiden LoxP-Standorten flankiert sind. Nach drei bis vier Wochen Kultur auf Triebbildung Medium mit Herbizid, vermehrenden Geweben mit reifenden Embryonen oder Triebknospen resistent gegen das Herbizid kann beobachtet werden. Einige der herbizidresistenten Gewebe können für ZsGreen negativ sein, was darauf hindeutet, dass in diesen Geweben wahrscheinlich eine kreidevermittelte Exzision aufgetreten ist.

Nach der Verschiebung des Gewebes auf Wurzelmedium und leichte Inkubation können gesunde, kräftige, wachsende Triebe mit gut entwickelten Wurzeln geerntet werden. Beachten Sie, dass einige Gewebe möglicherweise mehrere Triebe haben, die möglicherweise auf klonale Pflanzen mit identischen Transgenintegrationsmustern zurückzuführen sind. Die QuickCorn-Methode kann die Effizienz der Maistransformation erheblich verbessern und die Liste der transformierbaren Genotypen erweitern.

Das Protokoll kann von Forschern mit minimaler Maisumwandlung erfolgreich reproduziert werden. Mit der QuickCorn-Methode sollten verwurzelte Pflanzen in nur fünf bis sieben Wochen nach dem Tag der Infektion bereit sein, auf den Boden zu übertragen. Achten Sie auf die mittlere Zusammensetzung, das Timing der Subkulturen und die Temperatur- und Lichtverhältnisse.

Die Qualität der Ausgangsstoffe ist auch für eine erfolgreiche Transformation unerlässlich. Die in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien, Bleichlösungen und Herbizide sind biogefährlich. Bitte achten Sie darauf, die entsprechende persönliche Schutzausrüstung während des Gebrauchs zu tragen.