Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Die Quantifizierung der konformen Veränderungen in einzelnen Biomolekülen unter Scherfluss ist nützlich, um die Funktion und Biophysik von Makromolekülen wie Protein und DNA zu verstehen. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Echtzeit-In-situ-Visualisierung einzelner Moleküle in physiologischen Strömungsumgebungen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies ist unübertroffen von anderen Techniken wie AFM.

Durch die Charakterisierung der Scherkraft, unter der unsere DNA globale Konformationsveränderungen hat, kann man besser Medikamente entwerfen, die diese biophysikalischen Eigenschaften imitieren. Dieses Protokoll kann weit verbreitet werden, um das Verhalten oder andere Polymere, insbesondere Biopolymere, unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen zu untersuchen und die Rheologie komplexer Flüssigkeiten zu untersuchen. Der Zeitpunkt der Schritte ist entscheidend für den Erfolg.

Wir empfehlen, die Oberflächenbehandlung und Fluoreszenzmikroskopie der mikrofluidischen Geräte mehrmals zu praktizieren, um sie effizient auszuführen. Die Erfassung von konformen Veränderungen in Biomolekülen ist ein visuelles und dynamisches Phänomen, das am besten auf Film betrachtet wird. Wissenschaftler werden diese Methode besser verstehen, nachdem sie die in diesem Video vorgestellte Echtzeit-Protein- und DNA-Mikroskopie gesehen haben.

Um das mikrofluidische Gerät vorzubereiten, fügen Sie fünf Teile der Silikonelastomerbasis zu einem TeilHärtungsmittel in einem Wägeboot hinzu. und rühren Sie den Inhalt gründlich für eine Minute, um eine vorgehärtete PDMS-Lösung zu erstellen. Legen Sie den Master-Silizium-Wafer in eine Kunststoff-Petrischale und gießen Sie die PDMS-Lösung über den Wafer, um eine Fünf-Millimeter-Schicht zu erstellen.

Bedecken Sie die Schale und lassen Sie sie in einem Trockentrockner unter Vakuum für eine Stunde, um Luftblasen zu entfernen. Dann inkubieren Sie die bedeckte Petrischale bei 60 Grad Celsius über Nacht, um das PDMS in einen flexiblen Feststoff auszuhärten, was dazu führt, dass an der PDMS-Wafer-Schnittstelle mikrofluidische Kanäle in das PDMS eingegossen werden. Verwenden Sie am nächsten Tag mit einem Rasiermesser 20 mal 10 Millimeter Rechtecke um jeden mikrofluidischen Kanal im PDMS und entfernen Sie die rechteckigen Blöcke mit einer Pinzette.

Verwenden Sie eine 25-Spur stumpfe Endnadel mit geschärften Kanten, um ein Loch von 0,5 Millimetern an einem Ende des Kanals zu schlagen, um sicherzustellen, dass das Loch vollständig durch den PDMS-Block geht. Verwenden Sie eine dünne Nadel, um das PDMS aus dem Loch zu stanzen und den Prozess am anderen Ende des Kanals zu wiederholen. Legen Sie den PDMS-Block mit der Kanalseite nach oben und dem Deckelrutsch in die Kammer einer Plasma-Bindungsmaschine und starten Sie die Behandlung.

Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, legen Sie den PDMS-Block schnell auf einen Deckel, so dass der Kanal mit dem Schlupf in Berührung kommt. Drücken Sie auf die Ränder des Blocks, und legen Sie dann die Abdeckungsrutsch-PDMS-Baugruppe 15 Minuten lang auf eine Kochplatte bei 115 Grad Celsius, um die dauerhafte Bindung zu verstärken. Fügen Sie schließlich eine Länge von 10 Zentimetern ein.

0,25 Millimeter Innendurchmesser Rohr in das Auslassloch an der Oberseite des PDMS-Blocks, damit Flüssigkeit leicht aus dem Kanal fließen kann. Für von Willebrand-Faktor- oder VWF-Experimente injizieren bis zu 10 Mikroliter von 10 Mikroliter pro Milliliter BSA-Biotin in sterilem 1X PBS gelöst in den Einlass des mikrofluidischen Geräts. Halten Sie nach der Injektion ein paar Mikroliter BSA-Biotin in der Pipettenspitze ein und lassen Sie die Spitze in den Einlass einbetten.

Lassen Sie das BSA-Biotin zwei Stunden lang im Gerät inkubieren, was dazu führt, dass BSA nicht spezifisch an die Deckbedeckungsoberfläche bindet. Entfernen Sie dann die Pipettenspitze und injizieren Sie bis zu 10 Mikroliter Casein-Blockierlösung in den Kanal. Lassen Sie die Casein-Lösung 30 Minuten lang inkubieren, damit sie freie Stellen blockieren und die unspezifische Bindung der Biomoleküle an die Oberfläche reduzieren kann.

Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie bis zu 10 Mikroliter Streptavidin in sterilem PBS in den Kanal, der an die Biotingruppen des BSA-Biotins bindet. Als nächstes injizieren Sie bis zu 10 Mikroliter Waschmittellösung, um überschüssiges Streptavidin wegzuwaschen. Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie entweder VWF in Casein-Lösung oder Lambda-DNA.

Inkubieren Sie VWF für drei Minuten oder Lambda-DNA für 45 Minuten. Dann injizieren Sie fünf Millimolar freies Biotin, um die überschüssigen Streptavidin-Bindungsstellen zu blockieren. Einen Milliliter Casein-Blockierlösung in eine Spritze geben und in einer Spritzenpumpe sichern.

Befestigen Sie dann ein Ende des Schlauches an der Spritzennadel und fließen Sie in die Lösung, um Luftblasen zu entfernen. Etwa drei Minuten nach der kostenlosen Biotin-Injektion das andere Ende des Rohres am Einlass des mikrofluidischen Geräts befestigen. Wählen Sie das höchste Vergrößerungsziel des TIRF- oder konfokalen Fluoreszenzmikroskops aus.

Fügen Sie bei Bedarf einen Tropfen Tauchöl auf das Ziel. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf die Mikroskopstufe, so dass der Deckelschlupf bündig mit dem Objektiv ist. Starten Sie die Hellfeldmikroskopie und passen Sie den Fokus so an, dass Features wie Schmutz und Blasen sichtbar sind.

Passen Sie dann die Bühne in X- und Y-Richtung an, bis der Rand des mikrofluidischen Kanals sichtbar ist und den Rahmen zerschneidet. Wechseln Sie zum FITC-Kanal und passen Sie den Z-Pegel und den TIRF-Winkel nach Bedarf an, bis die einzelnen grünen Kugelmoleküle unterschieden werden können. Passen Sie die Laserintensität und Belichtungszeit an, um fluoreszierende Moleküle zu visualisieren, ohne sie zu schnell zu photobleicht zu machen.

Passen Sie dann den Kontrast an, um die Moleküle besser zu visualisieren. Genau fünf Minuten nach der kostenlosen Biotin-Injektion starten und stoppen Sie den Fluss aus der Spritzenpumpe, um die Veränderungen der molekularen Konformation mit Durchflussraten zwischen 5000 und 30.000 Mikroliter pro Stunde zu beobachten. Bei VWF ist es wichtig, mindestens eine kleine Menge Anfluss anzuwenden, wie 30 Sekunden 10.000 Mikroliter pro Stunde Genau fünf Minuten nach der kostenlosen Biotininjektion.

Wiederholen Sie dies in verschiedenen Bereichen des mikrofluidischen Geräts und lokalisieren Sie Moleküle, die sich bei mehreren Zyklen des Startens und Stoppens des Durchflusses ausdehnen und entspannen können. Beachten Sie, wie lange es dauert, bis Moleküle die maximale Ausdehnung erreichen und die Entspannung vollständig abschließen und Videos des kontinuierlichen Verhaltens von Molekülen unter Scherfluss aufzeichnen. Die Flexibilität eines Moleküls, die Bestätigung zu ändern, wird oft durch seine Fähigkeit zur Verlängerung demonstriert, da höhere Scherraten aufgrund des zunehmenden Durchflusses angewendet werden.

Die Verlängerung stolieren der Scherrate eines von Willebrand-Faktormoleküls ist nützlich, um die biomechanischen Eigenschaften des Proteins zu charakterisieren. Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Lambda-DNA zeigen in ähnlicher Weise eine erhöhte Ausdehnung bei höheren Scherraten bei 30 Sekunden und eine allmähliche Entspannung über zwei Minuten nach dem Anhalten des Durchflusses. Wenn Sie mit VWF arbeiten, denken Sie daran, es nur für drei Minuten zu inkubieren und Biotin für fünf Minuten vor dem Start des Flusses freizugeben.

Dies ist entscheidend für die Bildung der optimalen Anzahl oder Biotin-Streptavidin-Verbindungen, die für das reversible Entwirren benötigt werden. Diese Methode kann angepasst werden, um Echtzeit-Wechselwirkungen zwischen mehreren Biomolekülen zu visualisieren und ihre Funktionen zu charakterisieren. Zum Beispiel könnte man die Thrombozytensteckerbildung besser verstehen, indem man VWF visualisiert, das sich unter hoher Schere entwirrt und seine Bindung mit dem Thrombozytenadhäsionsmolekül GPIb-alpha mit dieser Methode.