High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay
10. März 2020
Der Sämlingsfluttest erleichtert die schnelle Überprüfung von Wildtomaten-Beitritten auf die Resistenz gegen das Pseudomonas syringae Bakterium. Dieser Assay, der in Verbindung mit dem bakteriellen Wachstumstest verwendet wird, kann bei der weiteren Charakterisierung der zugrunde liegenden Resistenz gegen das Bakterium helfen und kann verwendet werden, um Kartierungspopulationen zu untersuchen, um die genetische Grundlage des Widerstands zu bestimmen.
Dieses Protokoll mit hohem Durchsatz ermöglicht ein schnelles Screening von Tomatensämlingen aus wilden Zuwanderungen zum bakteriellen Erreger Pseudomonas syringae. Der Sämlingsfluttest minimiert den Bedarf an Pflanzenwachstumszeit und Wachstumskammer, ermöglicht einen schnellen Umschlag von Pflanzen und ermöglicht die Prüfung großer Probengrößen. Dieser Test ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um widerstanden in wilden Beitritten und anderen Linien mit komplexen genetischen Hintergründen zu überprüfen.
Das Protokoll enthält spezifische Anweisungen für die Flutinnoculation von zwei Pseudomonas syringae Stämmen. Es ist jedoch vielseitig und kann modifiziert werden, um wirtResistenz gegen andere bakterielle Krankheitserreger zu erkennen. Demonstriert wird das Verfahren von Yana Hasan, einer Forschungsspezialistin in meinem Labor.
Beginnen Sie mit dem Anbau der Tomatensämlinge. Tomatensamen in ein 2,2 Milliliter Mikrozentrifugenrohr geben und zwei Milliliter 50%Bleichlösung hinzufügen. Das Rohr 25 Minuten lang einsansanigen und die Bleichlösung mit einer Pipette entfernen.
Fügen Sie zwei Milliliter ultrareines Wasser hinzu und waschen Sie die Samen, indem Sie die Röhre fünfmal invertieren. Die Flüssigkeit aus dem Rohr ansaugen und die Wäsche noch viermal wiederholen. Nach der letzten Wäsche zwei Milliliter reines Wasser hinzufügen und die Samen in eine sterile Petrischale gießen.
Sterilisieren Sie Zangen, indem Sie sie in Ethanol entzünden, dann verwenden Sie sie, um fünf bis sieben Samen auf eine 100 mal 25 Milliliter Platte mit 0,5 XMS plus 0,8 Prozent Agar-Medien zu übertragen. Versiegeln Sie die Ränder der Platte mit chirurgischem Klebeband. Stellen Sie sicher, dass die Platten flach und verdeckt gestapelt sind.
Die sterilisierten Samen bei vier Grad Celsius im Dunkeln mindestens drei Tage lang streuen, um die Keimung zu synchronisieren. Nach drei Tagen die Platten vertikal so ausrichten, dass die Wurzeln entlang der Oberfläche der Platte nach unten wachsen und die Samenlinie horizontal ausgerichtet ist. Übertragen Sie die Samen in eine Wachstumskammer, die auf 22 Grad Celsius mit einem 16-stündigen hellen, 8-stündigen dunklen Zyklus eingestellt ist.
Wachsen Sie die Sämlinge für zehn Tage in der Kammer, an diesem Punkt werden sie in der Regel vollständig entstandene und erweiterte Kotyledonen und entstehende erste wahre Blätter zeigen. Streichen Sie frische Bakterien auf einen geeigneten KB-Agar mit einem flachen, sterilen Zahnstocher. Für PstT1, inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius für 48 Stunden vor der Verwendung der Bakterien im Hochwasserexperiment.
Um das Inokulum vorzubereiten, setzen Sie die Bakterien aseptisch in sterilem, zehn Millimolaren Magnesiumchlorid auf eine optische Dichte von 0,1 aus. Machen Sie dann zwei serielle Verdünnungen, um eine Arbeitskonzentration mit einem OD600 von 0075 zu erhalten. Bereiten Sie auch eine ein bis zehn Verdünnung des nichtionischen Organosilikon-Tensid-Copolymers in zehn Millimolar-Magnesiumchlorid vor.
Wirbel nieren und fügen Sie es zu den Bakterien, wirbeln die Röhre zu mischen. Die Platten mit den zehn Tage alten Sämlingen aus der Wachstumskammer in den Biosicherheitsschrank geben und das Operationsband entfernen. Dann sechs Milliliter Inokulum auf jede Platte übertragen.
Die Sämlinge vorsichtig mit einer Pipettenspitze in das Inokulum schieben und einen Timer für drei Minuten starten. Halten Sie eine Platte in jeder Hand und kippen Sie die Vorderseite der Platte nach unten, um die Kotyledonen und Blätter der Sämlinge zu untertauchen. Wischen Sie die InokulumSeite zur Seite fünf bis sieben Mal, dann kippen Sie die Platten zurück, um die Wurzeln mit dem Inokulum zu bedecken.
Neigen Sie die Platten erneut nach unten und wiederholen Sie den Zyklus für insgesamt drei Minuten. Gießen Sie das Inokulum von den Platten, setzen Sie sie auf eine flache Oberfläche, und gießen Sie alle Restinokulum für ein zweites Mal. Die Platten umwickeln und wieder in die Wachstumskammer legen.
Moneymaker-PtoR und Moneymaker-PtoS-Sorten wurden sieben bis zehn Tage nach dem Hochwasser mit PSTDC3000 überflutet und phänotypisiert. Moneymaker-PtoR Sämlinge tragen den PtoPRF-Gencluster und waren resistent gegen den PSTDC3000. Während nahezu isogene Moneymaker-PtoS-Sämlinge, die die PSTDC3000-Effektoren AVRPto oder AVRPto-B nicht erkennen können, innerhalb von sieben Tagen nach Überschwemmungen schnell starben.
Zehn Tage alte Sämlinge wurden mit PstT1 überflutet und mindestens zehn Tage nach dem Hochwasser phänotypisiert. Anfällige Beitritte waren tot, hatten braune apikale Meristems und es fehlte an neuem Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigten resistente Sämlinge ein hohes Maß an neuem grünem Wachstum und überlebten eine Infektion mit PstT1.
Bakterielle Wachstumstests wurden durchgeführt, um die PstT1-Resistenz und Solanum NeoRici LA1329 quantitativ zu bestätigen. Es gab einen Unterschied von 1,7 Log im Bakterienwachstum zwischen resistentem und anfälligem LA1329 und einem 1,6-Log-Unterschied zwischen resistentem LA1329 und Moneymaker-PtoS, der mit den phänotypischen Ergebnissen korrelierte. Bei der Durchführung dieses Assays sind die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, die aufmerksamkeiter Aufmerksamkeit auf die aseptische Technik während des gesamten Protokolls zu richten und sicherzustellen, dass alle Sämlinge auf der Platte gründlich überflutet werden.
Achten Sie darauf, infiziertes Pflanzengewebe und Bakterien zu autoklavieren und Materialien in Übereinstimmung mit den entsprechenden Vorschriften zu entsorgen.
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Übersicht
Der Keimlingsfluttest ermöglicht eine schnelle Untersuchung wilder Tomatenzugänge auf Resistenz gegen das Bakterium Pseudomonas syringae. Dieses Hochdurchsatzverfahren minimiert die Pflanzenwachstumszeit und erlaubt die effiziente Prüfung großer Stichprobengrößen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenpathologie
- Genetik
- Mikrobiologie
Hintergrund
- Der Keimlingsfluttest ist zur Untersuchung von Tomatenkeimlingen konzipiert.
- Pseudomonas syringae ist ein bedeutender bakterieller Pathogen, der Tomaten befällt.
- Dieser Test kann für andere bakterielle Pathogene angepasst werden.
- Er unterstützt die Identifizierung genetischer Resistenz in wilden Tomatenzugängen.
Zweck der Studie
- Wildtomatenzugänge auf Resistenz gegenüber Pseudomonas syringae testen.
- Die genetische Grundlage der Resistenz in Kartierungspopulationen charakterisieren.
- Eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung großer Stichprobengrößen bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Bewässerungsinokulation von Tomatensämlingen mit Stämmen von Pseudomonas syringae.
- Beurteilung des bakteriellen Wachstums in Sämlingen.
- Vergleich der Resistenzniveaus zwischen verschiedenen Zugängen.
- Nutzung von Wachstumskammerbedingungen zur Optimierung des Pflanzenwachstums.
Hauptergebnisse
- Der Test identifiziert wirksam resistente Tomatenzugänge.
- Er ermöglicht eine schnelle Durchführung und Untersuchung großer Stichprobengrößen.
- Nachgewiesene Vielseitigkeit bei der Detektion von Resistenz gegenüber verschiedenen bakteriellen Pathogenen.
- Erleichtert weitere genetische Analysen von Resistenzmerkmalen.
Schlussfolgerungen
- Der Keimlingsfluttest ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Tomatenresistenz.
- Er kann für breitere Anwendungen in der Pflanzenpathologie angepasst werden.
- Diese Methode verbessert die Effizienz der Resistenzprüfung in der Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die schnelle Identifizierung von Pathogenresistenzen in Pflanzensystemen unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium bei der Entwicklung von Agrochemikalien und Biopestiziden. Der Keimlingsfluttest ermöglicht ein Hochdurchsatz-Phänotypisierungsscreening von wildem Keimmaterial und beschleunigt so die Entdeckung von Resistenzmerkmalen mit Vorhersagewert für Pflanzenschutzstrategien. Dieser Ansatz verringert biologische Risiken, indem Resistenzmechanismen vor ressourcenintensiven Feldversuchen funktional validiert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht Mechanismen der Wirt-Pathogen-Interaktion, um Resistenzwege bei der Tomate aufzuklären.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung genetischer Loci unter Verwendung diskreter Überlebensphänotypen oder quantitativer Wachstumsparameter.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Resistenzkandidaten durch Korrelation phänotypischer Ergebnisse mit Bakterienwachstumsassays.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare Resistenzphänotypen in zehntägigen Sämlingen und ermöglicht so die großskalige Bewertung von Keimstoffen.
- Operativer Wert: Standardisiert Inokulations- und Überflutungsverfahren, um eine konsistente Pathogenexposition über alle Proben hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Verringert die Wachstumszeit und den Platzbedarf im Wachstumskammer, wodurch eine schnelle Durchlaufzeit und die Prüfung vielfältiger Zugänge ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Verbindet Phänotypen der Keimlingsresistenz mit feldrelevanten Ergebnissen durch Korrelation mit Daten zur bakteriellen Proliferation.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Unterscheidet Effektor-vermittelte Anfälligkeit (z. B. Erkennung von AvrPto) von breitbandiger Resistenz unter Verwendung nahezu isogener Linien.
- Präklinische Kontinuität: Bietet einen skalierbaren Primärscreen, der die nachgeschaltete genetische Kartierung und Phänotyp-Validierung unterstützt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für den Entdeckungsprozess von der Keimstoff-Screening bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen und ermöglicht die frühe Erkennung von Resistenzmerkmalen, bevor eine genetische Kartierung oder Feldvalidierung erfolgt.
- Entdeckungsbiologie: Untersucht die Auswirkungen des Wirtsgenotyps auf das Überleben des Pathogens und die Keimlingsvitalität nach kontrollierter Infektion durch Überschwemmung.
- Screening: Liefert quantitative (Messung des Neuwachstums) und qualitative (Überleben/Tod) Ergebnisse zur Bewertung der Resistenz.
- Analytik: Ermöglicht die Korrelation von phänotypischer Resistenz mit Unterschieden im bakteriellen Wachstum (z. B. 1,6–1,7 log-Reduktion), um Treffer zu validieren.
- Translationale Forschung: Verbindet Keimlingsassays mit der Validierung von Resistenzgenen durch den Vergleich nahezu isogener Linien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anwendbar auf mehrere Pseudomonas syringae-Stämme und andere bakterielle Pathogene mit minimalen Protokollanpassungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem Resistenzphänotypen mit definierten genetischen Hintergründen verknüpft werden (z. B. Vorhandensein/Abwesenheit von Pto/Prf).
- Operationaler Wert: Erhöht die Durchsatzkapazität durch verkürzten Wachstumszyklus und standardisierte Flutinokulation.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Abbruch bei der Weiterentwicklung von Resistenzmerkmalen, indem frühzeitige phänotypische und quantitative Bestätigung bereitgestellt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung wilder Zugänge basierend auf validierter Resistenzstärke und genetischer Zugänglichkeit.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in aseptischer Technik, im Umgang mit Krankheitserregern und im Pflanzenanbau unter kontrollierten Bedingungen.
- Benötigt einen Sicherheitswerkbank, Wachstumskammern mit präzisen Licht-/Temperaturzyklen und die Spektrophotometrie zur Standardisierung des Inokulums.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung zwischen den Teams hinsichtlich des Zeitpunkts der Überflutung, der Neigungszyklen und des Inokulumvolumens, um die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten zu gewährleisten.
- Die Anpassung an neue Pathogenstämme erfordert eine Optimierung der bakteriellen OD600 und der Tensidkonzentration, bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Keimlingsviabilität.
- Die Genauigkeit der phänotypischen Bewertung hängt von konsistenten Inkubationszeiträumen nach der Überflutung und einer objektiven Beurteilung des neuen grünen Wachstums ab.
