Name: Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung homogener Glycoconjugate-Impfstoffe durch unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie. Diese Methode ermöglicht die gezielte Kupplung von Kohlenhydrat-Antigenen an Trägerproteine für die Impfstoffentwicklung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.C. würdigt die finanzielle Unterstützung durch La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), insbesondere ein Promotionsstipendium an Die T.V. Wir würdigen auch Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankreich) für seine wertvollen technischen Ratschläge.

1. Synthese der UAA: Propargyllysin (PrK)
<ol><li>Synthese von Nα-Boc-Propargyl-Lysin18<ol>
<li>500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) in einer Mischung aus wässrigen 1 M NaOH (5 ml) und THF (5 ml) in einem Kolben auflösen und den Kolben mit einem Siliziumseptum befestigen.</li>
		<li>Kühlen Sie den Kolben in einem Eisbad ab und fügen Sie dann 158 L Propargylchloroforat (1,62 mmol) tropfenweise (über einen Zeitraum von 2-3 min) mit einer Mikrospritze unter Rühren hinzu.</li>
		<li>Erwärmen Sie die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur und rühren Sie 10 h weiter.</li>
		<li>Abkühlen von Lösungen von 50 ml Diethylether, 50 ml wässriger 1 M Salzsäure und 60 ml Ethylacetat in einem Eisbad.</li>
		<li>Kühlen Sie das rohe Reaktionsgemisch in einem Eisbad und gießen Sie es in einen Trenntrichter. Extrahieren Sie die Mischung mit 50 ml Diethylether. Entsorgen Sie die organische Schicht.</li>
		<li>Vorsichtig wässrig 1 M Salzsäure in die wässrige Phase im Trenntrichter geben. Dann extrahieren Sie die wässrige Schicht zweimal mit 30 ml Ethylacetat. Überprüfen Sie das Vorhandensein von N-Boc-Propargyl-Lysin in der organischen Phase durch TLC mit CH2Cl2-methanol (9:1) als Eluent. </li>
		<li>Trocknen Sie die kombinierten organischen Schichten über MgSO4, filtern Sie die Festphase ab und konzentrieren Sie das Filtrat unter reduziertem Druck auf einen Rotationsverdampfer.</li>
		<li>Lösen Sie eine Probe des rohölöligen Nα-Boc-Propargyl-Lysin in deuteriertem Chloroform (CDCl3) und kontrollieren Sie seine Identität durch 1H NMR. VORSICHT: Die Extraktion kann zu einer Druckbildung führen. Lösen Sie häufig Druckaufbau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthese der unnatürlichen Aminosäure Propargyl-L-Lysin (PrK)<ol>
<li>N α-Boc-Propargyl-Lysin in einem runden Bodenkolben einführen, der mit einem Septum ausgestattet ist.</li>
		<li>4 ml wasserfreies Dichlormethan (CH2Cl2) in den Kolben unter Argon geben, um den N-α-Boc-Propargyl-Lysinaufzulösen.</li>
		<li>4 ml Trifluoressigsäure (TFA) tropfenweise unter Rühren mit einer Spritze hinzufügen.</li>
		<li>Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 1 h bei RT. Überwachen Sie die Reaktion von TLC mit CH2Cl2-methanol (9:1) als Eluent.</li>
		<li>Konzentrieren Sie das Reaktionsgemisch unter reduziertem Druck.</li>
		<li>Den Rohresten den Rthylether hinzufügen und bei 4 °C für 1 h inkubieren, um den PrK auszufällen. Wenn der PrK nicht vollständig ausgefällt wird, trituieren Sie bei höherer Skala, um ihn auszufällen und die Inkubationszeit bei Bedarf zu verlängern.</li>
		<li>Filtern Sie den PrK in Form eines weißen Festkörpers auf einem Fritted-Glas.</li>
		<li>Lösen Sie ein Aliquot des PrK in D2O auf. Führen Sie dann NMR-Analysen durch, um ihre Identität und Reinheit zu kontrollieren.</li>
		<li>Zur weiteren Verwendung die unnatürliche Aminosäure PrK in destilliertem Wasser in einer Endkonzentration von 100 mM auflösen und bei -20 °C als 1 ml Aliquots lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Herstellung des durch PrK modifizierten rekombinanten Proteins
<ol><li>Plasmid-Präparation<ol>
<li>Konstruieren Sie ein Expressionplasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH), das das Ziel-Reife-Pneumokokken-Oberflächenadhesin-A-Gen (pET24d-mPsaA-WT) enthält, gefolgt von einer Proteasesequenz des Tobacco Etch Virus (TEV), indem die Proteasesequenz zwischen bamHI und XhoI-Restriktionsstellen der PET24-Plasmid-Plasmen-Prämonie kloniert wird. Dies wird ein His6 Tag am C-Terminus des Proteins einführen. Ersetzen Sie das Codon von Lysin-32 durch das Bernsteincodon (TAG) mit konventioneller, ortsgerichteter Mutagenese-Technik.</li>
		<li>Konstruieren Sie ein zweites Expressionsplasmid (pEVOL-MmPylRS), das zwei Kopien des Gens enthält, das für die Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase aus Methanosarcina mazei (MmPylRS) und das Gen kodiert für den entsprechenden tRNAPyr, wie zuvor beschrieben19. Verwenden Sie diesen speziell entwickelten Plasmidvektor pEVOL für die effiziente Integration von UAAs. HINWEIS: Die detaillierten Plasmid-Informationen sind in der Ergänzenden Akte 1beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Ko-Transformation von Plasmiden in den Expressionsstamm<ol>
<li>Tauen Sie eine 100 L aliquot der chemisch kompetenten Escherichia coli BL21(DE3) auf Eis für 5 min.</li>
		<li>Fügen Sie 1 l von jedem Plasmid (jeweils 50-100 ng) in die Zellen und inkubieren für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Übertragen Sie das 1,5 ml Mikrorohr mit den aufgetauten, kompetenten Zellen bei 42 °C bei 45 s und bewegen Sie es dann für 2 min wieder auf Eis.</li>
		<li>Fügen Sie 900 l LB-Medium hinzu und brüten Sie unter Schütteln für 1 h bei 37 °C, um eine antibiotische Expression zu ermöglichen. Dann die Bakterien auf LB-Agar mit 25 g/ml Kanamycin und 30 g/ml Chloramphenicol aufteilen. Bakterienwachstum über Nacht bei 37 °C zulassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Expression von Proteinen, die mit PrK modifiziert wurden<ol>
<li>Inokulieren Sie eine einzelne kotransformierte Kolonie in 5 ml LB-Medium mit Antibiotika (25 g/ml Kanamycin und 30 g/ml Chloramphenicol). Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln inkubieren.</li>
		<li>Die Primärkultur (5 ml) in 500 ml Autoinduktionsmedium mit Antibiotika, 0,02 % L-Arabinose und 1 mM der unnatürlichen Aminosäure PrK verdünnen und bei 37 °C für 24 h mit Schütteln inkubieren. Schließen Sie eine negative Kontrolle ein, indem Sie die Kultur ohne PrK parallel und eine positive Kontrolle durchführen, indem Sie die Kultur eines Klons ausführen, der das Wt-Protein enthält.</li>
		<li>Aliquot 5 ml aus dem 500 ml Kulturmedium und Zentrifuge für 10 min bei 5.000 x g. Den Überstand entsorgen und bei -20 °C einfrieren. Erntezellen aus den restlichen 495 ml durch Zentrifugation für 10 min bei 5.000 x g. Den Überstand entsorgen und bei -20 °C einfrieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren von Rohzellextrakten aus den 5 ml Kulturproben nach SDS-PAGE und Western Blot-Analyse<ol>
<li>5 ml Zellpellets in 250 l Lysepuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM Imidazol, 0,2 mM PMSF) wieder aufsetzen und in ein 1,5 ml Mikrorohr übertragen.</li>
		<li>Lyse Zellen durch Einfrieren der Rohre in flüssigen Stickstoff, auftauen in einem 42 °C Bad und Wirbel nxte bei hoher Geschwindigkeit für 30 s. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.</li>
		<li>Zentrifugenproben bei 17.000 x g für 10 min, um Zellablagerungen zu beseitigen.</li>
		<li>Nehmen Sie 10 l des Überstandes und fügen Sie 5 l Wasser und 5 l Ladepuffer (Bromphenolblau, SDS, β-Mercaptoethanol) hinzu. Die Proben 5 min bei 100 °C erhitzen und SDS-PAGE- und Western Blot-Analysen durchführen.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinreinigung durch Gravitationsfluss-Bench-Affinitätschromatographie mit Nickel-NTA-Perlen<ol>
<li>Die Zellpellets (aus der 495 ml-Kultur) in 20 ml Lysepuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM Imidazol, 0,2 mM PMSF) wieder aufsetzen.</li>
		<li>Fügen Sie 5 l DNase I (1 mg/ml) und 500 l Lysozym (50 mg/ml) in die Suspension ein und lassen Sie die Lyse durch Inkubation der Suspension bei 37 °C während 30 min.</li>
		<li>Beschallen Sie die Zellen während 5 min (Zyklen von 5 s-5 s, Amplitude 50%) und entfernen Sie dann die Zellablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 min, gefolgt von Filtration auf 0,45 m Filter.</li>
		<li>Ni-NTA-Harz in die Suspension geben (500 l für 500 ml Zellkultur) und bei 4 °C für 1 h sanft mischen.</li>
		<li>Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und sammeln Sie den ungebundenen Bruch.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz mit 10 ml Waschpuffer mit 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol. Waschen Sie das Harz ein zweites Mal mit 5 ml Waschpuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol). Sammeln Sie die Waschfraktionen.</li>
		<li>Elute das mit seiner Tätlichkeit versehene Protein mit 1 ml Elutionspuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM Imidazol). Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal und sammeln Sie alle Elutionsfraktionen.</li>
		<li>Analysieren Sie das rohe Lysat sowie die 7 Reinigungsfraktionen per SDS-PAGE auf einem 12% Acrylamidgel.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Fraktionen, die reines His-tagged-Protein enthalten, und dialysieren Sie es gegen 1 L TEV-Proteasepuffer (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) über Nacht mit einer Dialysemembran (Cut-off MW 6000-8000 Da). Messen Sie die Konzentration des Proteins bei 280 nm mit einem molaren Aussterbekoeffizienten von 37 360 cm-1-M-1 und einem Molekulargewicht von 34,14 kDa für mPsaA.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Entfernung des Histidin-Tags durch TEV-Proteaseverdauung
<ol><li>Die Proteinprobe in ein 50 ml-Rohr einsammeln und DEN TEV-Puffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) bei einer Konzentration von 2 mg/ml hinzufügen. HINWEIS: Die Konzentration kann je nach früheren Ergebnissen variieren. Die von uns getesteten Proteinkonzentrationen liegen in einem typischen Bereich von 2-3 mg/ml.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l TEV-Protease hinzu (hinzufügen Sie 1 l mit 10 Einheiten TEV-Protease für 20 g Protein zu verdauen).</li>
	<li>Fügen Sie 50 l von 0,1 M Dithiothreitol (DTT) hinzu.</li>
	<li>Komplett mit TEV-Puffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) bis 5 ml.</li>
	<li>Über Nacht bei 4 °C mit langsamem Schütteln inkubieren. HINWEIS: Wenn die Verdauung nicht abgeschlossen ist, fügen Sie mehr TEV-Protease hinzu, brüten Sie länger oder bei höheren Temperaturen bis zu 30 °C.</li>
	<li>Dialyse das verdaute Protein, um EDTA bei 4 °C über Nacht mit einer Dialysemembran (Cut-off 6000-8000 Da) gegen Phosphatpuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM Imidazol) zu entfernen.</li>
	<li>Um die TEV-Protease und das unverdaute Protein zu eliminieren, die Mischung mit Ni-NTA-Perlen inkubieren und bei 4 °C sanft 1 h mischen.</li>
	<li>Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule. Sammeln Sie die ungebundene Fraktion und waschen Sie die Säule mit 5 ml Waschpuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol) HINWEIS: Das Protein von Interesse sollte in den ungebundenen und Waschfraktionen zurückgewonnen werden.</li>
	<li>Elute die TEV-Protease und das unverdaute Protein durch Zugabe von 5 ml Elutionspuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM Imidazol) auf der Säule. Überprüfen Sie die Fraktionen auf Proteingehalte bei 280 nm und durch SDS-PAGE-Analyse.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Effizienz der Verdauung, indem Sie verdaute Proben auf eine SDS-SEITE mit dem unverdautem Protein als Kontrolle laden.</li>
	<li>Dialysieren Sie das verdaute Protein gegen 1 L Klickpuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) bei 4 °C über Nacht mit einer Dialysemembran (Cut-off 6000-8000 Da), um Imidazol zu entfernen sowie den Puffer auszutauschen, und messen Sie die Konzentration des Proteins bei 280 nm mit molarem Extinktionskoeffizient und Molekulargewicht von mPsaA (37 360 cm-1M-1 und MW 34,14 kDa).</li>
</ol>4. Bewertung der unnatürlichen Aminosäure Propargyl-Lysin Zugänglichkeit und Funktionalität für Klickchemie
HINWEIS: Konjugieren Sie die mPsaA mit 6-Hexachlor-Fluorescein-Azid mit dem Von Presolski et al.20 beschriebenen Protokoll für Klickchemie.
<ol><li>Nehmen Sie 432,5 l PrK-mutiertes Protein in einer Konzentration von 57,8 m in ein 2 ml Mikrorohr. HINWEIS: Eine Mindestkonzentration von 2 M Alkyn ist akzeptabel. Wenn die Proteinkonzentration niedriger ist, konzentrieren Sie sie mit einem Zentrifugalkonzentrator oder bevorzugen Sie das Gleichgewicht der Reaktion durch Erhöhung des Azid-Alkyn-Molaren-Verhältnisses.</li>
	<li>Fügen Sie 10 l von 5 mM 6-Hexachlor-Fluorescein-Azid hinzu und fügen Sie dann einen Vormix von 2,5 l CuSO4-Lösung bei 20 mM und 7,5 l Tris(Benzyltriazolylmethyl)amin (THPTA) bei 50 mM (Lagerlösungskonzentrationen) hinzu.<ol>
<li>Fügen Sie 25 l wässriges 100 mM Aminoguanidinhydrochlorid hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 25 l von 20 mg/ml eine extemporisch zubereitete wässrige Lösung von Natriumascorbat hinzu.</li>
		<li>Schließen Sie das Rohr, mischen Sie durch mehrmalses Invertieren und inkubieren bei Raumtemperatur für 2 h.</li>
		<li>Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 l von 0,5 M EDTA hinzufügen.</li>
		<li>Nehmen Sie 15 l des Reaktionsgemisches und legen Sie es ein Mikrorohr, fügen Sie 5 l Ladepuffer (Bromphenolblau, SDS, β-Mercaptoethanol) hinzu, erhitzen Sie das Gemisch bei 100 °C für 5 min und laden Sie es dann in ein 12% Acrylamid-Gel. Visualisieren Sie nach der Migration das fluoreszierende Konjugat auf dem Gel unter UV-Licht bei 312 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Konjugation von mPsaA mit einem azido-funktionalisierten Kohlenhydratantigen (Pn14TS-N3) durch Klick Chemie
<ol><li>Kupplung<ol>
<li>Nehmen Sie 432,5 l PrK-mutiertes Protein bei 57,8 m in ein 2 ml Mikrorohr.</li>
		<li>Fügen Sie 10 l von 5 mM Pn14TS-N321 in Wasser hinzu, und fügen Sie dann einen Vormix von 2,5 l CuSO4-Lösung bei 20 mM und 7,5 l THPTA bei 50 mM hinzu. HINWEIS: Die Synthese von Pn14TS-N3, einem Tetrasaccharid, das den Streptococcus pneumoniae Serotyp 14 kapselförmiges Polysaccharid imitiert, wurde in Referenz 21 beschrieben. Theoretisch kann jedes Kohlenhydratantigen verwendet werden, das eine Azidfunktion enthält.</li>
		<li>Fügen Sie 25 l von 100 mM Aminoguanidinhydrochlorid hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 25 l von 20 mg/ml extemporisch zubereitete wässrige Lösung von Natriumascorbat hinzu.</li>
		<li>Schließen Sie das Rohr, mischen Sie durch mehrmalses Invertieren und inkubieren Sie bei RT während 2 h.</li>
		<li>Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 l von 0,5 M EDTA hinzufügen.</li>
		<li>Nehmen Sie 15 L Proben und analysieren Sie mit SDS-PAGE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelfiltrationsreinigung des Glykonokjugatts<ol>
<li>Reinigen Sie das Glykonojugate, indem Sie es auf eine sterische Ausschlussagarosesäule (15 x 600 Bettabmessungen, 3.000-70.000 Fraktionierungsbereich) auftragen, gleichgläs mit 100 mM PBS-Puffer, pH 7,3 bei einem 0,8 ml/min-Durchfluss mit Detektion bei 280 nm.</li>
		<li>Sammeln Sie die Fraktionen, die das Glykonojugate enthalten. HINWEIS: Bei längerer Lagerung das Glykonojugate gegen 1 LH2O zweimal für 2 h dialysieren und dann bei 4 °C mit Dialysemembran (Cut-off Mw 6000-8000 Da) über Nacht, dann gefriertrocken und das Glykonojugate bei -80 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoconjugate+vaccines%3A+Principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li>
<li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li>
<li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines%3A+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li>
<li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li>
<li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16(2019).</li>
<li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li>
<li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li>
<li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li>
<li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li>
<li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li>
<li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li>
<li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2%3A+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+imaging+and+biology%3A+MIB%3A+the+official+publication+of+the+Academy+of+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li>
<li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li>
<li>WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).</li>
<li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li>
<li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals%3A+Biological+Considerations+and+Impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li>
<li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression%3A+Development+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%3A+A+European+Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li>
<li>Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein%2FPsaA+as+a+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%3A+Official+Journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li>
<li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li>
<li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+%28PsaA%29+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li>
<li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li>
<li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li>
<li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li>
<li>Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li>
<li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li>
<li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die standortgesteuerte Mutagenese ist eine einfache Strategie, um spezifische Aminosäuren an einer definierten Position eines Proteins zu integrieren, das kaum verwendet wird, um Glykonojugate-Impfstoffe7,8,14herzustellen. Die klassische Mutagenese auf Basis des 20 natürlichen Aminosäureansatzes ist hocheffizient, da keine Modifikation des Übersetzungsrechners erforderlich ist. Cysteinmutationen sind in der Regel darauf ausgeric...

Glycoconjugate-Impfstoffe sind wesentliche Bestandteile des Impfstoffarsenals, das für die prophylaktische Behandlung von Infektionskrankheiten zur Verfügung steht. Sie sind sicher, gut verträglich und effizient in einer breiten Altersgruppe, einschließlich Kleinkindern. Sie bieten den optimalen Schutz gegen Infektionen, die durch gekapselte Bakterien wie Meningokokken, Pneumokokken oder Haemophilus influenzae Typ b1verursacht werden. Glycococonjugate-Impfstoffe bestehen aus gereinigten bakteriellen Polysacchariden, die die Kapseln von Bakterien oder synthetischen Oligosacchariden bilden, die diese oberflächenausgedrückten Polysaccharide2imitieren, die kovalent mit einem Trägerprotein verbunden sind. Das Vorhandensein eines Trägerproteins ist wichtig, um schützende humorale Immunantworten zu fördern, die gegen die antigene Determinante gerichtet sind, die durch die Kohlenhydrat-Antigene 3 ausgedrücktwird. Abgesehen von einer sorgfältigen Selektion und Produktion des Kohlenhydratantigens sind die Merkmale, von denen bekannt ist, dass sie einen Einfluss auf die Wirksamkeit eines Glykonojugate-Impfstoffs ausüben,: die Art des Trägerproteins, die Konjugationschemie (einschließlich der Art und der Länge des Linkers, wenn sie verwendet werden) oder das Saccharid-Protein-Verhältnis3. Offensichtlich sind die Positionen, an denen das Saccharid mit dem Protein konjugiert wird, sowie die Anzahl der Konnektivitätspunkte für die Immunogenität relevant. Bis heute wurden diese beiden Parameter kaum untersucht, da die Herstellung der Glykonokjugate weitgehend empirisch bleibt. Ihre Synthese beruht in der Regel auf der Verwendung von Amin- oder Carbonsäurefunktionen von Lysin bzw. Aspartidazu/Glutaminsäure-Seitenkettenrückständen, die in der Trägerproteinsequenz vorhanden sind. Dies führt nicht zu einer einzigen, sondern zu einer heterogenen Mischung von Glykonokjugaten.
Das Spielen auf die Reaktivität, Zugänglichkeit oder Verteilung der Aminosäurerückstände im Protein führt zu stärker definierten Glykonokonjugaten, die zuverlässiger sind, um die Wirkung von Saccharid/Protein-Konnektivität zu dokumentieren4. Ein Schritt in Richtung dieses Ziels kann durch den Einsatz der Protein-Glykan-Kopplungstechnologie erreicht werden, einem rekombinanten Verfahren, das die Herstellung von kontrollierten Glykonojugat-Impfstoffen in Zellfabriken5,6ermöglicht. Die Glykosylierung erfolgt jedoch ausschließlich bei einem Asparaginrückstand innerhalb von D/EXNYS/T-Sequonen (wobei X aus den 20 natürlichen Aminosäuren besteht), die nicht natürlich auf den Trägerproteinen vorhanden sind.
Standortselektive Mutagenese und insbesondere die Einbeziehung von Cysteins zur Ausnutzung ihrer hochgradig selektiven Reaktivität erscheint als Alternative7,8. Die Herstellung von Trägerproteinen, die UAAs in ihrer Sequenz enthalten, kann noch mehr Flexibilität für die homogene Glykonojugat-Impfstoffzubereitung bieten. Mehr als 100 UAAs wurden entwickelt und in verschiedene Proteine9,10integriert. Viele von ihnen enthalten bioorthogonale Funktionen, die in der Regel verwendet werden, um post-translationale Modifikationendurchzuführen 11 oder biophysikalische Sonden12 oder Medikamente13 zu transplantieren, die aber ideale Griffe für die weitere Konjugation mit Kohlenhydratantigenen sind. Erfolgreiche Beispiele wurden von Biotech14 mit zellfreier Proteinsynthese15 behauptet, aber die Herstellung von Glykonojugate-Impfstoffen nach dieser Strategie wartet immer noch darauf, populär zu werden.
Die Anwendung der In-vivo-Strategie für die Herstellung von mutiertem Trägerprotein erfordert eine modifizierte translationale Maschinerie, die ein bestimmtes Codon, eine tRNA zur Erkennung des Codons und eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) umfasst, die speziell die Übertragung der UAA auf die tRNA katalysiert (Abbildung 1)16. Die Pyrrolysin Bernstein Stop Codon Unterdrückung ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um UAA zu integrieren, insbesondere das Propargyl-Lysin (PrK)17. Letztere können wiederum mit azido-funktionalisierten Kohlenhydrathapten reagieren, um vollständig definierte, homogene Glycococonjugate zu liefern. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir, wie man das Propargyl-L-Lysin, ein UAA mit einem Alkyngriff, synthetisiert, wie man es während seiner Übersetzung in ein Zielprotein in ein Bakterium einbaut und schließlich, wie man die Konjugation zwischen dem modifizierten Protein und einem Hapten, der eine Azidfunktion trägt, mittels Klickchemie durchführt.

<table><tbody><tr><td>AIM (autoinduktiv medium)</td><td>Formedium</td><td>AIMLB0210</td><td>Festes Pulver</td></tr><tr><td>Boc-Lys-OH</td><td>Alfa-Aesar</td><td>H63859</td><td>Festes Pulver</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>Merck Novagen</td><td>69450</td><td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &lambda; (DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&lambda; S)</td></tr><tr><td>Dialysemembran</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAseI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter 0,45 &micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose-Lysozym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Harz</td><td>Machery Nagel</td><td>Protino</td><td>Ni-NTA-Kügelchen in Suspension zu 20 % Ethanol</td></tr><tr><td>Pall Zentrifugalgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td><td>diese Studie</td><td></td><td>entspricht pET24d-mPsaA-WT, jedoch mit einer K32TAG-Mutation in der mPsaA-Gen</td></tr><tr><td>pET24d-mPsaA-WT</td><td>in dieser Studie</td><td></td><td>pET24d-Plasmid mit dem Wt mPsaA-Gen, das zwischen den Restriktionsstellen BamHI und XhoI kloniert wurde, mit einer TEV-Proteasesequenz, gefolgt von einem His6-Tag am C-terminalen Ende des mPsaA-Gens und mit dem Kanamycin-Resistenzgen</td></tr><tr><td>pEVOL-Plasmidgeschenk</td><td>von Edward Lemke EMBL (ref 19)</td><td></td><td>Plasmid mit p15A-Ursprung, zwei Kopien von MmPylRS (eine unter GlnS-Promotor und eine unter pAra-Promotor), eine Kopie der tRNACUA unter dem ProK-Promotor, das Chloramphenicol-Resistenzgen</td></tr><tr><td>Propargylchloroformiat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>460923</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB120-220</td><td></td></tr></tbody></table>

homogenes glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche aminosäure-inkorporation und click-chemie für impfstoffzwecke

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetische Code-Erweiterung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um unnatürliche Aminosäuren (UAAs) in Proteine einzuführen, um ihre Eigenschaften zu verändern, um neue Proteinfunktionen zu untersuchen oder zu schaffen oder um Zugang zu Proteinkonjugaten zu haben. Stop Codon Suppression, insbesondere Bernstein Codon Unterdrückung, hat sich als die beliebteste Methode zur genetischen Einführung von UAAs an definierten Positionen. Diese Methode wird hierin auf die Herstellung eines Trägerproteins angewendet, das eine UAA enthält, die eine bioorthogonale funktionelle Gruppe beherbergt. Dieser reaktive Griff kann als nächstes verwendet werden, um ein synthetisches Oligosaccharid-Hapten gezielt und effizient zu transplantieren, um einen homogenen Glykonojugate-Impfstoff bereitzustellen. Das Protokoll beschränkt sich auf die Synthese von Glykonokjugaten in einem 1:1 Kohlenhydrat-Hapten-/Trägerproteinverhältnis, ist aber für zahlreiche Paare biorthogonaler funktioneller Gruppen geeignet. Die Homogenität von Glycococonjuggate-Impfstoffen ist ein wichtiges Kriterium, um eine vollständige physikalisch-chemische Charakterisierung zu gewährleisten und damit immer anspruchsvollere Empfehlungen der Arzneimittelregulierungsbehörde zu erfüllen, ein Kriterium, das durch klassische Konjugationsstrategien nicht erfüllt wird. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll eine feinabgestimmte Abstimmung der Struktur des tatsächlichen Konjugatimpfstoffs, wodurch Instrumente zur Bewältigung von Struktur-Immunogenitäts-Beziehungen entstehen.

In diesem Projekt wurde ein homogener Glykonojugat-Impfstoff mit der Bernstein-Stop-Codon-Unterdrückungsstrategie zur Einführung einer UAA an einem definierten Standort hergestellt (Abbildung 1). Pneumokokken-Oberflächenadhesin A wurde als Trägerprotein-Moiety ausgewählt. Dieses Protein ist hochkonserviert und wird durch alle Stämme von Streptococcus pneumoniae22ausgedrückt. Es ist hoch immunogen und wurde zuvor als Träger in ...

Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung eines homogenen Glykonojugat-Impfstoffs durch die Kombination von nicht-kanonischer Aminosäure-Inkorporation und Klickchemie. Genetische Code-Erweiterung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um unnatürliche Aminosäuren in Proteine zu integrieren, um ihre Eigenschaften zu ändern, um neue Proteinfunktionen zu untersuchen oder zu schaffen oder um Zugang zu Proteinkonjugaten zu haben. Eine Codon-Unterdrückungsmethode hat sich als die beliebteste Methode zur Integration unnatürlicher Aminosäuren an verschiedenen Positionen herausgestellt.Diese Methode wird hier auf die Herstellung eines Proteinträgers angewendet, der eine unnatürliche Aminosäure enthält, die eine bioorthogonale funktionelle Gruppe enthält. Dieser reaktive Griff kann als nächstes verwendet werden, um ein synthetisches Oligosaccharid-Hapten gezielt und effizient zu transplantieren, um einen homogenen Glykonojugate-Impfstoff bereitzustellen. Das Propargyllysin, PrK, wird in zwei Schritten von kommerziellem Boc-Lysin synthetisiert.Im ersten Schritt wird die ungeschützte Aminogruppe des Boc-Lysins in Propargylchloroforat umgewandelt. In einem zweiten Schritt wird die Alpha-Aminogruppe entschützt. Um das N(alpha)Boc-Propargyl-Lysin zu synthetisieren, lösen Sie zunächst 500 Milligramm Boc-Lysin in der Mischung aus fünf Millilitern wässriger Mol-NaOH und fünf Milliliter THF in einem Kolben auf und passen den Kolben mit einem Siliziumseptum an.Kühlen Sie den Kolben in einem Eisbad ab und warten Sie, bis das Pulver gelöst ist. Dann fügen Sie das Propargylchloroformate tropfenweise über einen Zeitraum von zwei bis drei Minuten unter Rühren hinzu. Das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur erwärmen und 10 Stunden rühren.Abkühlen von Lösungen aus Diethylether, wässrige 1 Molsalzsäure und Ethylacetat. Kühlen Sie die rohe Reaktionsmischung in einem Eisbad ab. Gießen Sie die Mischung in einen trennenden Trichter.Eine Mischung mit fünfzig Millilitern Diethylether extrahieren. Extraktion kann zu einer Anhäufung von Druck führen, stellen Sie sicher, dass Sie druckaufbau häufig loslassen. Sammeln Sie die wässrige Phase und entsorgen Sie die organische Schicht.Fügen Sie vorsichtig, fünfzig Milliliter einer Molsalzsäure in die wässrige Phase im Trenntrichter. Dann extrahieren Sie die wässrige Schicht zweimal mit dreißig Milliliter Ethylacetat. Sammeln Sie die organische Phase, Überprüfen Sie das Vorhandensein Ihrer Verbindung durch TLC.In diesem Stadium sollte es in der organischen Phase sein. Trocknen Sie die kombinierten organischen Schichten über Magnesiumsulfat. Filtern Sie die Festphase ab.Und konzentrieren Sie das Filtrat unter reduziertem Druck auf einen Rotationsverdampfer. Die Probe des rohölöligen N(alpha)Boc-Propargyl-Lysins in deuteriertem Chloroform auflösen und seine Identität durch NMR kontrollieren. Um das Propargyl-L-Lysin zu synthetisieren, führen Sie das N(alpha)Boc-Propargyl-Lysin in einen runden Knopfkolben ein, der mit einem Septum ausgestattet ist.Vier Milliliter wasserfreies Dichlormethan unter Argon in den Kolben geben. Tropfenweise vier Milliliter Trifluoressigsäure unter Rühren hinzufügen. Ersetzen Sie das Siliziumseptum durch einen Glasdeckel, um zu vermeiden, dass TFA das Siliziumseptum beschädigt.Rühren Sie das Reaktionsgemisch für eine Stunde bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie den De-Schutz des Boc-PrK durch TLC. Konzentrieren Sie das Reaktionsgemisch unter reduziertem Druck.Den Rohresten mit Derthylether ergänzen. Filtern Sie das Propargyl-L-Lysin in Form eines weißen Festkörpers auf einem Fritglas. Lösen Sie ein Aliquot des Propargyl-L-Lysins in Deuteriumoxid auf und führen Sie dann eine NMR-Analyse durch, um ihre Identität und Reinheit zu kontrollieren.Propargyl-L-Lysin wird dann in destilliertem Wasser in der Endkonzentration von hundert Millimolar gelöst und bei minus 20 Grad in einem Milliliter Aliquots gelagert. Um Plasmide in den Expressionsstamm zu transformieren, tauen Sie fünf Minuten lang ein hundert Mikroliter Aliquot des chemisch kompetenten E.Coli BL21 auf Eis auf. Fügen Sie einen Mikroliter von jedem Plasmid oder fünfzig bis hundert Nanogramm von jedem in die Zellen und inkubieren Sie sie für 30 Minuten auf Eis.Inkubieren Sie die kompetenten Zellen bei 42 Grad, während 45 Sekunden. Dann legen Sie sie für zwei Minuten wieder auf Eis. Fügen Sie neunhundert Mikroliter LB Medium und inkubieren unter Schütteln für eine Stunde bei 37 Grad, um Antibiotika-Expression zu ermöglichen.Dann die transformierten Bakterien auf LB Agar mit Antibiotika plattieren. Lassen Sie Bakterien über Nacht bei 37 Grad wachsen. Um mit PrK modifizierte Proteine auszudrücken, impfen Sie eine einzige kotransformierte Kolonie in fünf MilliliterN LB-Medium mit Antibiotika.Über Nacht bei 37 Grad mit Schütteln inkubieren. Am nächsten Tag mit den fünf Millilitern Primärkultur in fünfhundert Millilitern Autoinduktionsmedium mit Antibiotika, 0,02% L-Arabinose und einem Millimolar PrK verdünnen und 24 Stunden lang unter Schütteln bei 37 Grad brüten. Schließen Sie eine negative Kontrolle ein, indem Sie die Kultur ohne PrK und die positive Kontrolle durchführen, indem Sie die Kultur eines Klons ausführen, der das Wildtyp-Proteingen enthält.Ernten Sie Zellen aus der Nachtkultur durch Zentrifugation bei 5.000 x g während 10 Minuten. Den Überstand entsorgen und bei minus 20 Grad einfrieren. Zur Reinigung des Proteins durch Gravitations-Flow-Bench-Affinitätschromatographie setzen Sie die Zellpellets in zwanzig Milliliter Lysepuffer aus.Fügen Sie DNase I und Lysozym hinzu und lassen Sie die Lyse durch Inkubieren der Suspension bei 37 Grad während 30 Minuten. Beschallen Sie die Zellen im Eis während fünf Minuten, dann entfernen Sie die Zellablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g während 30 Minuten. Filtrieren Sie das Lysat mit 0,45 Mikrometer Filter Fügen Sie Ni-NTA Harz zur Suspension hinzu.Eine Stunde lang sanft bei vier Grad gemischt. Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und sammeln Sie den ungebundenen Bruch. Waschen Sie das Harz mit zehn Millilitern und dann fünf Milliliter Waschpuffer.Sammeln Sie die Waschfraktionen. Elute das His-tagged Protein mit einem Millimeter Elutionspuffer und wiederholen Sie diesen Schritt viermal und sammeln Sie alle zusätzlichen Fraktionen. Kombinieren Sie die Fraktionen, die reine Histidin-getaggte Proteine enthalten, und dialysieren Sie sie über Nacht in einem Liter TEV-Proteasepuffer mit Dialysemembran.Sammeln Sie die Proteinprobe in eine 50-Milliliter-Röhre und fügen Sie den TEV-Puffer hinzu, um eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter in einem Endvolumen von einem Milliliter zu erhalten. Fügen Sie hundert Mikroliter TEV-Protease hinzu. Fügen Sie 50 Mikroliter 0,1 Mol DTT.Komplett mit TEV-Puffer bis zu fünf Milliliter. Über Nacht bei vier Grad inkubieren, mit langsamem Schütteln. Um EDTA zu entfernen, dialysieren Sie das Protein bei vier Grad über Nacht mit Dialysemembran und Phosphatpuffer mit fünf Millimolar Imidazol.Um TEV-Protease und unverdaute Proteine zu eliminieren, brüten Sie die Mischung mit Ni-NTA-Perlen und mischen Sie sanft für eine Stunde bei vier Grad. Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule. Die ungebundene Fraktion wurde gesammelt.Die TEV-Protease und unverdaute Proteine bleiben an die Perlen gebunden und das verdaute Protein wird eluiert. Waschen Sie die Säule mit fünf Milliliter Waschpuffer und sammeln Sie auch die Waschfraktionen. Dialyse das verdaute Protein gegen einen Liter Klickpuffer bei vier Grad über Nacht mit Dialysemembran, um Imidazol zu entfernen sowie den Puffer auszutauschen.Und messen Sie die Konzentration des Proteins bei 280 Nanometern. Um das mPsaA mit 6-Hexachlor-Fluorescein-Azid oder einem antidoten-funktionalisierten Kohlenhydrat-Antigen zu konjugieren, setzen Sie das PrK-mutierte Protein mit einer Konzentration von 57,8 Mikromolaren in eine Zwei-Milliliter-Mikroröhre. Fügen Sie 10 Mikroliter von fünf Millimolar-Azid-Verbindung, dann fügen Sie eine Vormischung von Kupfersulfat-Lösung und THPTA.Aminoguanidinhydrochlorid hinzufügen. Extemporan zubereitete wässrige Lösung von Natriumascorbat hinzufügen. Schließen Sie das Rohr, mischen Sie, indem Sie mehrmals invertieren und bei Raumtemperatur für zwei Stunden inkubieren.Beenden Sie die Reaktion, indem Sie EDTA hinzufügen. Überprüfen Sie die Konjugation auf der SDS-Seite. Nach der Migration visualisieren Sie das Gel auf UV-Licht bei 312 Nanometern für das Konjugat mit Fluorescein.Oder färben Sie das Gel mit Coomassie Blue, um das Konjugat mit dem Kohlenhydrat-Antigen zu visualisieren. Als Zugabe des Haptens sollte eine Veränderung des Molekulargewichts induzieren. Reinigen Sie das Glykonojugate, indem Sie es auf eine mit PBS gleichgestellte Gelfiltrationssäule auftragen.Sammeln Sie die Fraktionen, die die Glykonokjugate enthalten. Für eine längere Lagerung das Glykonojugate gegen das destillierte Wasser dialysieren, dann gefrieren und trocknen und das Glykonojugate bei minus 80 Grad lagern. Die PrK wurde an Position 32 eingeführt, um ein Lysin in der Nähe des N-Terminus der PsaA zu ersetzen.Die Wirksamkeit der mPsaA-Produktion wurde durch SDS-Seite und Western-Blot-Analyse mit Anti-Histidin-Tag-Antikörper überprüft. Das Vorhandensein eines Vollblutproteins deutet stark auf die erfolgreiche Einbeziehung des PrK hin. Die Intensität ist jedoch geringer als bei Wildtyp mPsaA.Die mPsaA(K32PrK)wurde auf Ni-NTA Perlen gereinigt. Mit einer typischen Ausbeute von acht Milligramm und der Aufnahme des PrK-Rückstandes wurde schließlich durch Massenspektrometrie bestätigt. Das Histidin-Tag wurde bei proteolytischer Spaltung mit der TEV-Protease entfernt.Mit dem mPsaA(K32PrK)wurde die Reaktivität des Alkyns mit einem Azido-funktionalisierten Fluorescein bewertet und weiter verwendet, um ein synthetisches Oligosaccharid-Antigen zu konjugieren. Experimente wurden im Vergleich zu Wildtyp mPsaA als Kontrolle durchgeführt. Schließlich wurde das Glykoonjugate durch Gelfiltration gereinigt und seine Identität durch Massenspektrometrie bestätigt.In diesem Projekt wurden homogene Glykonojugat-Impfstoffe mit hilfe der Bernstein-Stop-Codon-Unterdrückungstechnologie hergestellt, um eine unnatürliche Aminosäure unter definierten Stellen zu integrieren. Die Homogenität des Glycoconjugate-Impfstoffs ist ein wichtiges Kriterium, um eine vollständige physikalisch-chemische Charakterisierung zu gewährleisten. Und damit immer anspruchsvollere Empfehlungen der Drogenagenturen zu befriedigen.Dieses Kriterium wird mit der klassischen reinen Konjugationsmethode nicht erfüllt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll eine fein abgestimmte Abstimmung der Struktur des Glykonojugat-Impfstoffs. Es entsteht ein beispielloses Instrument, um die Beziehung zwischen homogenität und der Struktur eines Glykonokjugates zu untersuchen.

homogeneous-glycoconjugate-produced-combined-unnatural-amino-acid

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Artikel wird ein hoher Durchsatz Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden und ihre Befestigung an der Oberfläche der Nanopartikel Polyanhydrid zur weiteren Verwendung bei der Ausrichtung der spezifische Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert wird.

Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker...

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Ein modularer Ansatz für die Synthese von N- Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Einbeziehung einer Cyclopropen-Derivat von Lysin in Antikörper ermöglicht die ortsspezifische, schnelle und effiziente Verknüpfung von kurz-tragenden Moleküle, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate zu generieren.

Durch eine schnelle Bioorthogonal Reaktion Konjugate genetischen Codierung einer nicht-kanonische Aminosäure für die Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff

Hier wird eine detaillierte Methode zur Beschreibung der Reinigung, Umfaltung und Charakterisierung selbstassemblierender Protein-Nanopartikel (SAPNs) für die Impfstoffentwicklung beschrieben.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

Wir beschreiben ein Protokoll für die chemische Konjugation des Modellantigens Ovalbumin zu einem endozytoserezeptorspezifischen Antikörper für das in vivo dendritische Zell-Targeting. Das Protokoll umfasst die Reinigung des Antikörpers, die chemische Konjugation des Antigens sowie die Reinigung des Konjugats und die Überprüfung der effizienten Konjugation.

Chemische Konjugation eines gereinigten DEC-205-gerichteten Antikörpers mit Protein in voller Länge für das Targeting von dendritischen Zellen der Maus in vitro und in vivo

Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers bestimmt seine klinische Leistung, so dass die industriellen und akademischen Bemühungen zur Kontrolle der Glykosylierung bestehen bleiben. Da typische Glykoengineering-Kampagnen zeit- und arbeitsintensiv sind, würde sich die Erstellung eines schnellen Protokolls zur Charakterisierung der Auswirkungen von Glykosylierungsgenen mittels transienter Silencing als nützlich erweisen.

Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

Erfahren Sie die Herstellung homogener Glycoconjugate-Impfstoffe durch unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie. Diese Methode ermöglicht die gezielte Kupplung von Kohlenhydrat-Antigenen an Trägerproteine für die Impfstoffentwicklung.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke (Video) | JoVE Journal

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Weitere Videos entdecken