Name: Induzieren hairy Roots von Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Induktion haariger Wurzeln in Tartary-Buchweizen durch Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation. Diese kostengünstige Methode ermöglicht genomische Studien und lässt sich auf andere Dikotyledonen anpassen.

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Diese Arbeit wurde von den Grundlagenforschungsfonds der zentralen öffentlichen Wohlfahrtsforschungsinstitute ZXKT17002 unterstützt.

Die in dieser Studie verwendete TB wurde bt18 genannt, die aus der Rasse "JinQiao No.2" stammt, die vom Research Center of Small Miscellaneous Grain of Shanxi Academy of Agricultural Science angebaut wurde. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.
HINWEIS: Betreiben Sie Explanten-bezogene Manipulationen schnell, und halten Sie die Petrischalen nach Möglichkeit geschlossen, um Welken und Kontaminationen zu vermeiden. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Explant-Inkubationen unter der Bedingung einer 14-h-Licht- und einer 10-h-Dunkelphotoperiode bei 25 °C durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Explanten- oder Bakterienoperationen unter aseptischen Bedingungen in einer laminaren Strömungshaube durchgeführt. Alle Medienzutaten für A. rhizogenes und in vitro Pflanzenkulturen sind in Tabelle 1enthalten. Nach der Einstellung des pH-Werts wurden alle Medien bei 120 °C für 20 min autoklaviert. Verfestigte Medien wurden hergestellt, indem 25 ml Medium in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gefüllt und verfestigt werden konnten.
VORSICHT: Legen Sie alle genetisch veränderten Bakterien und Pflanzen in den entsprechenden Abfallbehälter. Betreiben Sie alle gefährlichen Chemikalien in einem Rauchschrank und deponieren Sie sie im Gefahrstoffbehälter.
1. Herstellung von TB-Expflanzen
<ol><li>Herstellung von TB-Samen<ol>
<li>Wählen Sie plump und unbeschädigte TB-Samen(Abbildung 1A1), die bei einer Temperatur von weniger als 20 °C für nicht mehr als 2 Jahre konserviert wurden.</li>
		<li>Die Samen ca. 20 min in Wasser einweichen, damit die Samenschicht leicht abgeschält werden kann (Abbildung 1A2). Verwenden Sie bei Bedarf eine Schere, um einen Schlitz auf den Samen zu schneiden, um das Peeling zu erleichtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sterilisation von TB-Samen<ol>
<li>100–200 geschälte Samen in einen 100 ml sterilisierten konischen Kolben geben.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Samen mit 75% Ethanol für 30 s.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Ethanol durch 5% Natriumhypochlorit und desinfizieren Sie es 15 min. HINWEIS: Die Desinfektion mit Quecksilberbichlorid in einer Konzentration von 1 g/L für 8 min kann als alternativer Sterilisator verwendet werden, um Natriumhypochlorit in jedem Fall einer unzureichenden Sterilisation zu ersetzen. VORSICHT: Quecksilberbichlorid ist gefährlich und kein umweltfreundliches Material. Betreiben Sie es im umlaufenden Schrank und legen Sie es in den Behälter für gefährliche Abfälle, wenn Quecksilberbichlorid in jedem Fall verwendet wird.</li>
		<li>Gießen Sie das Natriumhypochlorit aus.</li>
		<li>Waschen Sie die Samen mit sterilem entionisiertem Wasser 5 mal.</li>
		<li>Die Samen mit einem sterilen bibulösen Papier trocknen lassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von TB-Sämlingen<ol>
<li>Bereiten Sie 50 ml Murashige und Skoog (MS) Basalmedium (1962) ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 7 g/L Agarpulver (MSSA) (Tabelle 1) in einer 300 ml Pflanzengewebekulturflasche vor.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert vor dem Autoklavieren auf 5,8 ein.</li>
		<li>Verteilen Sie 10 Samen gleichmäßig pro Flasche MSSA Medium.</li>
		<li>Die Samen in einem Kulturraum bei 25 °C bei 1 °C unter dem Lichtzustand für 7-10 Tage keimen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung steriler Expflanzen<ol>
<li>Wählen Sie robuste Sämlinge von TB (Abbildung 1C), wenn die 2 Stücke von Kotyledonen entfaltet werden.</li>
		<li>Schneiden Sie die Sämlinge von den Wurzeln ab (Abbildung 1C Rot-Dash-Pfeilspitzen),um den Kontakt mit dem Medium zu vermeiden.</li>
		<li>Legen Sie sie in eine sterile Petrischale.</li>
		<li>Die Hypocotyle in 0,8–1 cm große Segmente schneiden und die Kotyledonen in ca. 0,5 cm stücken scheren.</li>
		<li>Präkultur diese Explants auf MSSA Medium unter der Lichtbedingung für 24 h.</li>
		<li>Übertragen Sie sie in einen 100 ml sterilisierten konischen Kolben, die nun für eine Infektion bereit sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von A. rhizogenes für die Transformation
HINWEIS: Der A. rhizogenes-Stamm ACCC10060 wurde freundlicherweise vom Institut für Medizinische Pflanzenentwicklung zur Verfügung gestellt und bei 80 °C konserviert. A. rhizogenes wurde mit dem binären Vektor pK7GWIWG2D (II) transformiert, der eine T-DNA mit dem b4-Gen, das ein GFP als Indikatorgen begleitet, und dem Kan-Resistenzgen als wählbarem Marker beherbergt. Das Gen b4 ist ein Mitglied der Transkriptionsfaktor bHLH Familie, die noch nicht veröffentlicht wurde. Um das Potenzial von TB-Haarwurzeln zu bewerten, wurde A. rhizogenes mit dem binären Vektor pK7WG2D transformiert, der das MYB116-Gen enthält, um seine Wirkung auf die Produktion von sekundären Metaboliten wie Flavonoiden auf der Ebene der Genexpression und durch metabolische Analysen zu untersuchen. Aktivierte A. rhizogenes sollten gleichzeitig mit den Expflanzen gut vorbereitet sein.
<ol><li>Aktivierung von A. rhizogenes
	<ol>
<li>Tau A. rhizogenes auf Eis</li>
		<li>Tauchen Sie die Bakterien und linie sie gleichmäßig auf Hefe Mannitol Medium (YEB) ergänzt mit 15 g/L Agar Pulver, 50 mg/L Rifampicin, und 50 mg/L Spectinomycin (YEBARS, pH 7.0).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Bakterien bei 28 °C für 12-16 h.</li>
		<li>Wählen Sie eine monoklonale Kolonie und kulturen Sie sie in einer anderen Petrischale in der oben beschriebenen Weise.</li>
		<li>Wählen Sie monoklonale Kolonien und kulturen Sie sie in einem 100 ml sterilisierten konischen Kolben mit 20 ml YEB-Medium, ergänzt mit 50 mg/L Rifampicin und 50 mg/L-Spektinomycin (YEBRS, pH 7,0) bei 28 °C und 200 U/min für 16–18 h, bis der OD600-Wert 2,0 erreicht.</li>
		<li>In einem weiteren 100-ml-Konuskolben, der 20 ml YEBRS-Medium bei 28 °C und 200 U/min bei 4-5 h enthält, bis der OD600-Wert etwa 0,5 erreicht ist, 2%–4% der oben genannten Kultur inkubieren (Abbildung 1D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Infektion und Screening von TB-Expflanzen
HINWEIS: Das Ziel dieses Protokolls ist es, genetisch transformierte haarige Wurzeln zu erhalten. Die Wildtypwurzeln wurden als Negativkontrolle verwendet, um die transgene Expression zu bewerten. In diesem Protokoll wurde A. rhizogenes mit dem binären Vektor entweder pK7WG2D transformiert, der das Gen von FtMYB116 oder pK7GWIWG2D (II) mit dem Gen b4 im Voraus trägt.
<ol><li>Resuspension von A. rhizogenes
	<ol>
<li>Übertragen Sie die in Schritt 2.1.6 erhaltene Kultur in ein 50-ml sterilisiertes Zentrifugalrohr.</li>
		<li>Drehen Sie bei 4.000 x g für 10 min bei 20 °C.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das bakterielle Pellet mit MS-Medium, ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 300 M Acetosyringon (AS) (MSSAS, pH 5.8) auf OD600 bei 0,2, wieder ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infektion von Expflanzen<ol>
<li>Infundieren Sie die in Schritt 3.1.3 erhaltene bakterielle Suspension in einen konischen Kolben, der die in Schritt 1.4.6 hergestellten Exaten für 10 min enthält (Abbildung 1E).</li>
		<li>Nehmen Sie die Explants heraus und bposten Sie sie mit einem sterilen bibulösen Papier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kokultur von Expflanzen mit A. rhizogenes
<ol><li>Legen Sie ein steriles Filterpapier mit 9 cm Durchmesser auf das MS-Medium, das mit 7 g/L Agarpulver verfestigt wird, ergänzt mit 30 g/L Saccharose und 100 m AS (MSSAAS-Medium, pH 5,2).</li>
	<li>Überlagern Sie die Expflanzen auf dem Filterpapier bei 25 °C für 3 Tage im Dunkeln (Abbildung 1F).</li>
</ol>5. Induktion und selektive Kultur
<ol><li>Platzieren Sie etwa 20 infizierte Explanten auf dem MSSA-Medium, ergänzt durch 500 mg/L Cefotaxim und 50 mg/L Kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Abbildung 1G).</li>
	<li>Inkubieren Sie sie vertikal unter der Lichtbedingung bei 25 °C bei 1 °C. Die haarigen Wurzeln treten etwa 1 Woche nach der Inkubation auf(Abbildung 1H Schwarz-Dash-Pfeilspitzen zeigen das Auftreten haariger Wurzeln an). HINWEIS: Ersetzen Sie MSSACK Medium bei Bedarf alle 15 Tage.</li>
</ol>6. Subkulierende TB haarige Wurzeln
HINWEIS: Dieses Verfahren zielt darauf ab, kräftige haarige Wurzeln zu ernten. Beobachten Sie regelmäßig das Wachstum haariger Wurzeln während der Vermehrung, und entfernen Sie die kontaminierten und inaktivierten in einer rechtzeitigen Weise. Wiederholen Sie bei Bedarf die folgenden Schritte, um haarigere Wurzeln zu propagieren. Es dauert etwa 10 bis 14 Tage von der Subkulesiierung bis zur Ernte.
<ol><li>Wählen Sie die haarigen Wurzeln, die weißes Aussehen und schnelles Wachstum zeigen.</li>
	<li>Schneiden Sie sie in Stücke von 2-3 cm.</li>
	<li>Sie werden eindeutig auf einer sauberen Bank nummerieren.</li>
	<li>Subkultur sie in einem 100 ml sterilisierten konischen Kolben mit 5 ml MS-Medium, ergänzt durch 30 g/L Saccharose und 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5,8) mit einer Drehgeschwindigkeit von 80 U/min bei 25 °C im Dunkeln, bis sie sich bis zum Boden des Kolbens überbreiten (Abbildung 1I).</li>
</ol>7. Identifizierung von transformierten haarigen Wurzeln und Konservierung
HINWEIS: Transformierte haarige Wurzeln können anhand der Aspekte der Morphologie und des Genspiegels identifiziert werden. Die Identifizierung kann auch entsprechend dem haarigen Wurzelgenom und dem Widerstand durchgeführt werden, die in diesem Protokoll nicht abgedeckt sind. Dieses Verfahren konzentriert sich in erster Linie auf die Identifizierung von Reportergenunden und Zielgenen.
<ol><li>Entfernen Sie tawny und kontaminierte haarige Wurzeln und wählen Sie diejenigen mit weißem Aussehen.</li>
	<li>Bewerten Sie, ob unter einem blau/lichtdualen ultravioletten Transilluminator eine grüne Fluoreszenz vorhanden ist.</li>
	<li>Wählen Sie die haarigen Wurzeln aus, die ein starkes Fluoreszenzsignal in den nummerierten Röhren aufweisen, oder wickeln Sie sie mit einem markierten Tinfoil, nachdem Sie sie mit einem saugfähigen Papier ausgetrocknet haben.</li>
	<li>Lyophilisieren Sie sie in flüssigem Stickstoff, gefolgt von der Lagerung der gesamten Ernte bei 80 °C für weitere Untersuchungen.</li>
	<li>Genidentifikation<ol>
<li>Trituieren Sie 0,1 g der haarigen Wurzeln zu feinem Pulver in flüssigem Stickstoff.</li>
		<li>Bereiten Sie die genomische DNA unabhängiger transgener TB-Linien mit der modifizierten Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Methode25 nach Anweisung des Herstellers des pflanzlichen genomischen DNA-Kits vor.</li>
		<li>Führen Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit 100 ng genomischer DNA-Vorlage und Primern aus, die in Tabelle 2aufgeführt sind.</li>
		<li>Führen Sie den Amplifikationszyklus wie folgt durch: Vordenaturierung bei 94 °C für 5 min, Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Primerglühen bei 55 °C für 30 s und Grundverlängerung bei 72 °C für 30 s. Nach 36 Zyklen und einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 min, analysieren Sie die Amplifikationsprodukte auf 1% Agarose-Gelen.</li>
		<li>Färben Sie die Gele mit Nukleinsäurefärbung und visualisieren Sie sie unter UV-Licht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

TB wurde in mehreren Studien im Zusammenhang mit sekundären Metaboliten auf genetischen und metabolischen Ebenen1,2,5,27,28verwendet. Haarige Wurzelkultur, als eine einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion, spielt eine zentrale Rolle in metabolischen Engineering29 und kann verwendet werden, um Stoffwechselwege durch Einfügen de...

Tartary Buchweizen (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) ist eine Art von Dikotyledon aus der Gattung Fagopyrum und der Familie Polygonaceae1. Als eine Art von homologen Lebensmitteln in der chinesischen Medizin hat TB aufgrund ihrer ausgeprägten chemischen Zusammensetzung und ihrer vielfältigen Bioaktivitäten gegen Krankheiten großes Interesse erhalten. TB ist in erster Linie reich an Kohlenhydraten, Proteinen, Vitaminen und Carotinoiden sowie an Polyphenolen wie Phenolsäuren und Flavonoiden1. Verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten von Flavonoiden, einschließlich antioxidative, antihypertensive2, und entzündungshemmende sowie Anti-Krebs und antidiabetische Eigenschaften wurden gezeigt3.
Agrobacterium rhizogenes ist ein Bodenbakterium, das zur Entwicklung von haarigen Wurzelerkrankungen in mehreren höheren Pflanzen, insbesondere Dikotyledonen, beiträgt, indem es Wundstellen4,5infiziert. Dieser Prozess wird durch die Übertragung der T-DNA in das wurzelinduzierende (Ri) Plasmid5,6 eingeleitet und wird häufig von der Integration und Expression eines exogenen Gens aus dem Ri-Plasmid und den nachfolgenden Schritten zur Erzeugung des haarigen Wurzelphäpusten7begleitet. A. rhizogenes-vermittelte transgene Haarwurzeln, als ein leistungsfähiges Werkzeug auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie, wurden aufgrund ihrer stabilen und hohen Produktivität und der einfachen Beschaffung in kurzer Zeit am häufigsten eingesetzt. Darüber hinaus zeichnen sich behaarte Wurzeln, die von A. rhizogenes induziert werden, effizient durch ihre plagiotrope Wurzelentwicklung und ein stark verzweigtes Wachstum in einem hormonfreien Medium8aus. Sie können in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, einschließlich der künstlichen Samenproduktion, der Wurzelknötchenforschung und bei der Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Organismen wie Mykorrhizapilzen, Nematoden und Wurzelregern7,9. Darüber hinaus wurden haarige Wurzeltransformationskulturen ausgiebig als experimentelles System verwendet, um die biochemischen Wege und chemische Signalisierung zu untersuchen und pflanzliche sekundäre Metaboliten zu produzieren, die als Pharmazeutika, Kosmetika und Lebensmittelzusatzstoffe8,10verwendet werden. Die wertvollen sekundären Metaboliten, einschließlich Indole-Alkaloide, Aconite, Tropanalkaloide, Terpenoide und Flavonoide, synthetisiert in wildartigen haarigen Wurzeln wurden seit mehreren Jahrzehnten in zahlreichen Arten untersucht, wie Ginsenosid in Panax Ginseng11, Coumarine in Ammi majus12, und Phenolverbindungen in TB2,13.
Haarige Wurzeln wurden mit A. rhizogenes in 79 Pflanzenarten aus 27 Familien14hergestellt. Zum Beispiel, A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeltransformation wurde in Sojabohnen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, und Chicorée (Cichorium intybus L.) berichtet 20. TB haarige Wurzeltransformation wurde auch untersucht2. Es gibt nur wenige detaillierte Protokolle zur Entwicklung haariger Wurzeln, die von A. rhizogenes vermittelt werden, die entweder einen binären Vektor tragen oder nicht. Zum Beispiel führten Sandra et al.21 eine Methode zur Herstellung transgener Kartoffelhaarwurzeln ein, die in Wildtrieben getragen werden. Die voll entwickelten haarigen Wurzeln konnten 5-6 Wochen nach der Injektion von A. rhizogenes visualisiert werden, die das gus-Reporter-Gen in die Stamminternoden von Kartoffelpflanzen tragen. Eine andere Studie hatte auch berichtet, dass ein transgenes haariges Wurzelsystem, das von A. rhizogenes induziert wurde, das gusA-Reportergen in Jute(Corchorus capsularis L.) beherbergte. 22. Darüber hinaus erhielten Supaart et al.23 transgene Tabakhaarwurzeln mit A. rhizogenes, die mit dem Expressionsvektor pBI121 transformiert wurden, der das Gen von1-Tetrahydrocannabinolic acid (THCA) Synthase trug, um THCA zu produzieren.
Ein Schrittweise-Prozess für eine effektive Generierung haariger Wurzeltransformation, insbesondere bei TB, wurde jedoch relativ weniger demonstriert. In dieser Studie haben wir ein detailliertes Protokoll mit A. rhizogenes beschrieben, das das Reportergen (GFP), einen selektiven Marker (Kan) und ein Gen von Interesse (b4, ein aus unserer Gruppe identifiziertes, aber unveröffentlichtes Gen aus der grundlegenden Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie verwendet, um eine haarige Wurzelgenetische Transformation bei TB zu erzeugen. Das Experiment dauerte 5-6 Wochen, von der Inokulation von Samen bis zur Erzeugung von haarigen Wurzeln, die die Explantation, Infektion, Kokultivierung, Subkulierung und anschließende Vermehrung beinhalteten. Darüber hinaus wurde A. rhizogenes, das ein binäres Plasmid mit dem TB-Transgen des Myeloblastose-Transkriptionsfaktors 116 (FtMYB116) enthält, verwendet, um festzustellen, ob FtMYB116 die Ansammlung von Flavonoiden, insbesondere Rutin, bei TB auf Gen- und Metabolzenebene durch die haarige TB-Wurzeltransformation fördern kann. FtMYB116, ein lichtinduzierter Transkriptionsfaktor, reguliert die Synthese von Rutin unter verschiedenen Lichtbedingungen5. Chalcone-Synthase (CHS), Flavanon-3-Hydroxylase (F3H), Flavonoid-3'-Hydroxylase (F3'H), und Flavonol-Synthase (FLS)24 sind Schlüsselenzyme, die am Stoffwechselweg der Rutin-Biosynthese beteiligt sind. Daher zeigt diese Studie die Überexpression von FtMYB116 bei TB haarigen Wurzeln und die Expression von wichtigen Enzymgenen sowie den Gehalt an Rutin und anderen Flavonoiden wie Quercetin.

<table><tbody><tr><td>2 * Taq PCR MasterMix</td><td>Aidlab, China</td><td>PC0901</td><td></td></tr><tr><td>Agarpulver</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific, US</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>AS</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>A8110</td><td>Verdünnt in DMSO, 100 mM</td></tr><tr><td>binäre</td><td>Vektoren ThermoFisher Wissenschaftlich (Invitrogen), US</td> <td>/</td> <td>pK7WG2D / pK7GWIWG2D (II)</td></tr> <tr><td>Cefotaxim, Natrium</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>C8240</td><td>In Wasser verdünnt, 200 mg / ml</td></tr><tr><td>CF15RXII Hochgeschwindigkeits-Mikro</td><td>Hitachi, Japan</td><td>Nr. 90560201</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Petrischale</td><td>Guanghua Fabrik für medizinische Instrumente, Yangzhou, China</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>DYY-6C Elektrophoreseapparatur</td><td>Bjliuyi, Peking China</td><td>ECS002301</td><td></td></tr><tr><td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td><td>Aidlab, China</td><td>RN38</td><td></td></tr><tr><td>ELGA purelab untra bioscience</td><td>ELGA LabWater, UK</td><td>82665JK1819</td><td></td></tr><tr><td>Epoch Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>biotek, US</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP/LR Reaktionsenzym</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen), US</td><td>11789100/11791110</td><td></td></tr><tr><td>HYG-C Mehrfunktionsschüttler</td><td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kan</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>K8020</td><td>In Wasser verdünnt, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>MLS-3750 Autoklav-Sterilisator</td><td>Sanyo, Japan</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MS Salze mit Vitaminen</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio Life Wissenschaft, Peking, China</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Andere Chemikalien nicht angegeben</td><td>Beijing Chemical Works, China</td><td></td><td>Ethanol, Quecksilberbichlorid usw.</td></tr><tr><td>PHS-3C pH-Messgerät</td><td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td><td>a008</td><td></td></tr><tr><td>Pflanzengenomisches DNA-Kit</td><td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td><td>DP305</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>R8010</td><td>Verdünnt in DMSO, 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>S8040</td><td>In Wasser verdünnt, 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>S8270</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA-Marker</td><td>TransGen Biotech, Peking, China</td><td>BM101-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Durchmesser 9 cm Filterpapier</td><td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt Pulver</td><td>Solarbio Life Science, Peking, China</td><td>Nr. LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

induzieren hairy roots von agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buchweizen (fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Tartary Buchweizen (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] besitzt verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten, weil es reichlich sekundäre Metaboliten wie Flavonoide enthält, insbesondere Rutin. Agrobacterium rhizogenes wurden nach und nach weltweit verwendet, um haarige Wurzeln in Heilpflanzen zu induzieren, um Genfunktionen zu untersuchen und die Ausbeute von sekundären Metaboliten zu erhöhen. In dieser Studie haben wir eine detaillierte Methode beschrieben, um A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln bei TB zu erzeugen. Cotyledons und hypokotyledonäre Achse bei 7-10 Tagen wurden als Explanten ausgewählt und mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, die zufällige haarige Wurzeln induzierten, die nach 1 Woche erschienen. Die erzeugte haarige Wurzeltransformation wurde anhand von Morphologie, Resistenzselektion (Kanamycin) und Reportergenexpression (grünes fluoreszierendes Protein) identifiziert. Anschließend wurden die transformierten haarigen Wurzeln nach Bedarf selbst propagiert. In der Zwischenzeit wurde ein Myeloblastose (MYB) Transkriptionsfaktor, FtMYB116, mit den A. rhizogenes-vermittelten haarigen Wurzeln in das TB-Genom umgewandelt, um die Rolle von FtMYB116 bei der Synthese von Flavonoiden zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Flavonoid-bezogenen Genen und die Ausbeute von Flavonoid-Verbindungen (Rutin und Quercetin) signifikant (p < 0.01) von FtMYB116gefördert wurden, was darauf hindeutet, dass A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln als wirksames alternatives Werkzeug zur Untersuchung von Genfunktionen und der Produktion von sekundären Metaboliten verwendet werden können. Das in dieser Studie beschriebene detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung haariger Wurzeln kann nach der Anpassung für jede genetische Transformation oder andere Heilpflanzen übernommen werden.

Agrobacterium rhizogenes-vermittelte TB haarige Wurzeltransformation Diese Studie beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll, das eingerichtet wurde, um genetisch transformierte haarige Wurzeln mit A. rhizogeneszu erhalten. Es dauerte etwa 5-6 Wochen von der Impfung von TB-Samen bis zur Ernte der identifizierten haarigen Wurzeln, und einige wichtige Schritte sind in Abbildung 1 (A-H) dargestellt. Kurz gesagt, sterilisierte Schalensamen...

Wir beschreiben eine Methode zur Induktion haariger Wurzeln von Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum). Dies kann verwendet werden, um Genfunktionen und die Produktion von sekundären Metaboliten in Tartary Buchweizen zu untersuchen, für jede genetische Transformation angenommen werden, oder für andere Heilpflanzen nach Verbesserung verwendet werden.

Induzieren hairy Roots von Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Mit diesem Protokoll zeigen wir zum ersten Mal den Schrittweiseprozess zur Induktion haariger Wurzeln in tartärem Buchweizen. Diese Technik ist einfach und kostengünstig für den Einstieg in die Genomik und Mikrobiomik für herbbucher und andere Pflanzen. Obwohl diese detaillierte Methode für tartary Buchweizen eingerichtet ist, kann es auf andere Dicot-Pflanzen mit einigen Modifikationen angewendet werden.Obwohl diese Methode einfach durchzuführen ist, hat sie viele detaillierte Schritte. Visuelle Demonstration kann Forschern helfen, eine effizientere haarige Wurzelinduktion zu erreichen. Demonstriert wird das Verfahren von Guangtao Qian, einem Master-Studenten aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Auswahl von prallen und unbeschädigten tartären Buchweizensamen und dem Einweichen der Samen in 28 Grad Celsius Wasser für ca. 20 Minuten. Wenn die Samenschicht leicht entfernt werden kann, legen Sie 100 bis 200 geschälte Samen 30 Sekunden lang in einen sterilisierten 100-Milliliter-Konuskolben mit 75 % Ethanol. Am Ende der Sterilisation das Ethanol durch 5% Natriumhypochlorit ersetzen.Nach 15 Minuten das Natriumhypochlorit dekantieren und die Samen fünfmal mit sterilem entionisiertem Wasser waschen. Dann die Samen mit einem Stück sterilem bibulösem Papier trocknen. Um herb Buchweizen-Sämlinge zu erhalten, fügen Sie 10 Samen pro Flasche zu einzelnen 300 Milliliter Pflanzengewebe Kulturflaschen mit 50 Milliliter MSSA Medium.Dann keimen die Samen in einem Kulturraum bei 25, plus oder minus 1 Grad Celsius bei Licht. Nach 7 bis 10 Tagen robuste Sämlinge mit zwei Stücken entfalteter Kotyledonen auswählen und die Sämlinge von den Wurzeln schneiden. Die Sämlinge in eine sterile Petrischale geben und die Hypocotyle in 0,8 bis 1 Zentimeter große Segmente schneiden.Die Kotyledonen in etwa 0,5 Zentimeter große Stücke verdecken und die resultierenden Explanten unter Lichtbedingungen 24 Stunden lang vorkultieren. Am nächsten Tag die Expflanzen in einen sterilisierten 100 Milliliter Konuskolben übertragen. Um A.rhizogenes zu aktivieren, tauen Sie die Kultur auf Eis auf, bevor Sie die Bakterien gleichmäßig auf YEB-Festmedium mit Antibiotika für eine 12- bis 16-stündige Inkubation bei 28 Grad Celsius plattieren.Am nächsten Morgen, wählen Sie eine monoklonale Kolonie für Kultur in einer neuen Petrischale, wie gerade gezeigt. Nach einer weiteren 12- bis 16-stündigen Inkubation impfen Sie die resultierenden monoklonalen Kolonien in einem sterilisierten 100 Milliliter konischen Kolben, der 20 Milliliter YEB-Festmedium mit Antibiotika bei 28 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute enthält, bis die optische Dichte bei 600 2,0 erreicht. Dann übertragen Sie 2-4% der bakteriellen Zellkultur in einen neuen 100 Milliliter konischen Kolben mit 20 Milliliter frischem YEB-Festmedium mit Antibiotika bei 28 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute für 4 bis 5 Stunden, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 erreicht.Um eine haarige Wurzeltransformation zu induzieren, übertragen Sie die A.rhizogenes-Kultur in eine sterile 50 Milliliter konische Röhre und sammeln die Bakterien durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in MSSAS-Medium auf eine optische Dichte von ca. 0,2 aus und infundieren Sie die Suspension in den Kolben von Exmodulen. Nach 10 Minuten die Explants aus dem Kolben entfernen und mit einem Stück sterilem bibulösem Papier bestreichen.Dann legen Sie ein steriles Stück Filterpapier mit 9 Zentimeterdurchmesser auf eine Schüssel mit MSSAAS-Medium und überlagern Sie die Expflanzen auf dem Filterpapier für eine dreitägige Inkubation bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation ca. 20 infizierte Explanten auf MSSACK-Mittel übertragen und die Pflanzen unter Lichtbedingungen bei 25, plus oder minus 1 Grad Celsius vertikal bebrüten. Nach 10 bis 14 Tagen Kultur, wählen Sie die haarigen Wurzeln, die ein weißes Aussehen und schnelles Wachstum zeigen und schneiden Sie die Wurzeln in zwei bis drei Zentimeter Stücke.Zählt klar die Wurzeln auf einer sauberen Bank. Subkultur die Wurzelstücke in einem sterilisierten 100 Milliliter konischen Kolben mit MSSK Medium bei 25 Grad Celsius und 80 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln, bis sie sich bis zum Boden des Kolbens überbreiten. Um die haarigen Wurzeln zu identifizieren, entfernen Sie alle tawny und kontaminiertbehaarten Wurzeln und wählen Sie diejenigen mit einem weißen Aussehen.Wenn ein Reportergen verwendet wurde, überprüfen Sie die Wurzeln auf Fluoreszenz unter einem blauen oder leichten Dual-Ultraviolett-Transilluminator und wählen Sie die haarigen Wurzeln aus, die ein starkes fluoreszierendes Signal aufweisen. Dann trocknen Sie die Wurzeln mit saugfähigem Papier und wickeln Sie sie in markierte Aluminiumfolie für die sofortige Analyse. Für die langfristige Lagerung, lyophilisieren Sie die Wurzeln in flüssigem Stickstoff und legen Sie die Wurzeln bei minus 80 Grad Celsius bis zu ihrer Untersuchung.Nach der genetischen Transformation und Kultur, wie gezeigt, werden die haarigen Wurzeln eine flauschige weiße Farbe und eine plagiotrope Weise in den Wundstellen der Expflanzen aufweisen und eine stark verzweigte und verzahnte Matrix bilden. Ein Reportergen kann verwendet werden, um die Differenzierung der transgenen haarigen Wurzeln unter einer blauen oder leichten dualen ultravioletten Transillumination oder die Identifizierung eines Zielgens von Interesse zu erleichtern. Hierwird wird die relative Expression eines lichtinduzierten Transkriptionsfaktors in den transgenen Linien von tartären Buchweizenhaarwurzeln gezeigt.Insbesondere wird die Biosynthese von Rutin und Quercetin auch auf metabolischer Ebene als Reaktion auf den induzierten Transkriptionsfaktor Überexpression gefördert. Darüber hinaus ist die relative Genexpression von Flavenoid-Synthesesignalgenen in allen drei transgenen Linien bemerkenswert höher als die in der Kontrollgruppe gemessenen, was auf eine erfolgreiche haarige Wurzeltransformation in herbaren Buchweizenexplanten hindeutet. Das ist Infektion der Samen, Selektion der Expflanzen, und die Konzentration der Bakterien direkt beeinflussen den Erfolg der haarigen Wurzelinduktion.Wir können die Genexpression, DNA-Protein- oder Proteinproteinreaktionen oder die Massenproduktion von sekundären Metaboliten bewerten, um sekundäre Metaboliten der Transkriptionsregulation zu untersuchen. Die konstruierten Bakterien sind gefährlich für Mensch und Umwelt. Achten Sie darauf, die Bakterien richtig zu behandeln, zu bedienen und zu entsorgen.

inducing-hairy-roots-agrobacterium-rhizogenes-mediated-transformation

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Aufgrund seiner vielseitigen Anwendung als Modellart in verschiedenen Forschungsbereichen besteht ein Bedarf an einem genetischen Transformationswerkzeug für den Schmalblättrigen Wegerich (Plantago lanceolata).  In dieser Arbeit wird unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation ein Protokoll vorgestellt, das zu stabilen transgenen Linien mit einer Transformationseffizienz von 20% führt.

Agrobacterium tumefaciens-vermittelte genetische Transformation des Spitzwegerichs

Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Hier stellen wir das detaillierte Protokoll einer einstufigen Transformationsmethode zur Verfügung, die durch Agrobacterium tumefaciens zur Herstellung von Mischpflanzen vermittelt wird.

Eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Herstellung von Kompositpflanzen durch Agrobacterium rhizogenes-basierte Haarwurzeltransformation

Das Protokoll beschreibt die Induktion der Haarwurzel unter Verwendung von primären Arabidopsis-Blütenstandsstämmen und Brassica napus-Hypokotylen . Die Haarwurzeln können kultiviert und als Explantate zur Regeneration transgener Pflanzen verwendet werden.

Haarwurzeltransformation und -regeneration bei Arabidopsis thaliana und Brassica napus

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Die Oogenese von Drosophila ist weiterhin außerordentlich nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Proliferation und Vererbung. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Markierung der replizierenden mitochondrialen DNA (mtDNA) in adulten Eierstöcken von Drosophila mit 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU), das die Aufdeckung von Mechanismen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Vererbung erleichtert, die bisher umstritten waren.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Gen-Deletionsmutanten, die durch homologe Rekombination erzeugt werden, sind der Goldstandard für Genfunktionsstudien. Die OSCAR-Methode (Ein-Schritt-Konstruktion von Agrobacterium-Recombination-ready-Plasmiden) zur schnellen Erzeugung von Deletionskonstrukten wird beschrieben. Agrobacterium vermittelte Pilz-Transformation folgt. Schließlich wird eine PCR-basierte Bestätigungsmethode für Gendeletionen in Pilz-Transformanten vorgestellt.

Rapid Deletion Produktion in Pilzen über<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Vermittelte Transformation von OSCAR Deletion Constructs

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Erfahren Sie die Induktion haariger Wurzeln in Tartary-Buchweizen durch Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation. Diese kostengünstige Methode ermöglicht genomische Studien und lässt sich auf andere Dikotyledonen anpassen.

Induzieren hairy Roots von Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum)

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