Name: Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Erfahren Sie die In-situ-Perfusionstechnik für untere Bauchorgane und Hinterbeine bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht gezielte Studien zur Arzneimittelabgabe und Immuninteraktionen in vivo.

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Die Studie wurde durch das NIH-Stipendium CA194058 an DS, Skaggs School of Pharmacy ADR Seed Grant Program (DS) unterstützt; National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), das Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), die Fundamental Research Funds for the Central Universities, das Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado genehmigt.
1. Vorheizen des Perfusionssystems
<ol><li>Bereiten Sie das Perfusionssystem vor der Operation vor, indem Sie ein 37 °C zirkulierendes Wasserbad für alle wasserummantelten Komponenten (Perfusatenreservoir, feuchte Kammer und Deckel) starten, wie in einer benutzerdefinierten Konfiguration in Abbildung 1Adargestellt. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch sauber ist und ersetzen Sie ihn bei Bedarf. Um das Perfusatenvolumen zu begrenzen, verwenden Sie eine Blasenfalle in einer feuchten Kammer als Perfusatenreservoir (Abbildung 1B-6).</li>
</ol>2. Gefäßkatheterisierung
<ol><li>Induzieren Sie anästhesie in einer 8-10 Wochen alten BALB/c-Maus mit einer Isofluran-Veterinäranästhesiemaschine mit 3-5% Isofluran und Sauerstoffdurchfluss rate bei 0,3 l/min. Als Alternative verwenden Sie Ketamin/Xylazin oder jede andere Art der intraperitonealen Anästhesie. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie mit 2 Methoden: Zehen-Pinch und Hornhautreflex.</li>
	<li>Eine 4-0 Seidennaht mit Nadel in doppelt destilliertem Wasser vorbefeuchten.</li>
	<li>Legen Sie die anästhesierte Maus in eine Supine-Position auf einem Styropor-Brett mit dem Kopf zum Chirurgen und immobilisieren Forelimbs und Hinterbeine mit Klebeband. Wischen Sie den Bauch mit Isopropylalkohol ab und schneiden Sie den Bauch entlang der Mittellinie mit einer Schere in eine "T"-Form. Stoppen Sie das Bluten um den Rand des Schnittes durch Elektrokoagulation (kauterisierend).</li>
	<li>Drücken Sie den Magen, Jejunum und Dickdarm auf die rechte Seite des Bauches, um die Bauchaorta, Vena cava, und gemeinsame Ilias und Iliolumbar Arterien und Venen zu offenbaren.</li>
	<li>Unter einem Dissektionsmikroskop finden und ligagen Sie die Iliolumbar-Arterie/Vene im Männchen, und Eierstockarterie/Vene und die Iliolumbar-Arterie/Vene beim Weibchen mit 4-0 Seidennähten(Abbildung 2 gelbe Linien).</li>
	<li>Unter einem Seziermikroskop zwei 4-0 Seidennähte unter der Bauchaorta und der unteren Vena cava (ca. 1 cm über Iliasarterie und Vene, 1 mm auseinander, Abbildung 2) schleifen und einen lockeren Knoten in der Naht machen, die den Iliasgefäßen am nächsten ist (Abbildung 2, weiß gepunktete Linie). Alternativ kann für diesen Knoten eine 6-0 Seidennaht verwendet werden.</li>
	<li>Unter einem Seziermikroskop, horizontal ausrichten und dehnen sowohl die untere Vena cava und die Bauchaorta mit Porte-Aiguille. Verwenden Sie einen 24 G geflügelten geschirmten I.V. Katheter, um die Bauchaorta zu durchstechen, drücken Sie die Taste, um den Nadelkern zurückzuziehen und setzen Sie den Katheter etwa 5 mm in das Gefäß ein.<ol>
<li>Wiederholen Sie das gleiche Verfahren mit dem unteren Vena cava und binden Sie Knoten beider Nähte um die katheterisierten Gefäße. HINWEIS: Die Nadel kann leicht durch das Blutgefäß punktieren; halten Sie daher die Gefäße gestreckt und Nadel parallel zum Gefäß. Ziehen Sie den Nadelkern zurück, sobald die Nadel etwa 1 mm in das Gefäß eindringt. Die Bauchaorta ist unter der unteren Vena cava und viel dünner und elastischer, da sie in Bindegewebe eingehüllt ist. Daher kann die Aorta am Katheter "festhalten" und sollte daher vor der Vena cava katheterisiert werden, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass der Katheter ausrutscht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tragen Sie Sofortkleber auf, um die Katheter auf die Erector Spinae zu immobilisieren, ersetzen Sie die Bauchorgane, und beenden Sie die Operation unter Beibehaltung der Anästhesie. HINWEIS: Organe, die nicht vollständig in die Bauchhöhle ersetzt werden können, müssen während des Perfusionsprozesses regelmäßig mit Perfusionsmedium befeuchtet werden.</li>
</ol>3. Einrichten des Perfusionssystems
<ol><li>Übertragen Sie die Maus in die wasserummantelte Feuchtkammer, die auf einem Siliziumpad auf 37 °C vorgewärmt ist, und schimbaren Sie die Katheterflügel mit 19 G Nadeln auf das Pad.</li>
	<li>Füllen Sie das Ende des arteriellen Katheters (Einlass) mit einem vorgewärmten Perfusionspuffer (Ringers Laktatlösung ergänzt durch 5% BSA), und verbinden Sie dann das Katheterende mit dem Einlassperfusionsschlauch über einen Schraubverbinder(Abbildung 1B, roter Pfeil). HINWEIS: Halten Sie den Stecker mit hämostatischen Zangen und immobilisieren Sie die Schläuche mit Klebeband, um eine Verschiebung der Katheter zu vermeiden.</li>
	<li>Stellen Sie den peristaltischen Durchfluss auf 0,6 ml/min ein und halten Sie den Perfusionsabfluss(Abbildung 1B, blauer Pfeil) für 5-10 min offen, um das Blut durch den Venenkatheter auszuwaschen. Es wird einige Gerinnsel im Auslasskatheter geben; Spülen Sie die Gerinnsel mit Perfusatenpuffer, bevor Sie den Perfusionskreislauf schließen.</li>
	<li>Schließen Sie das Ende des Venenkatheters mit dem Auslassschlauch über einen Schraubanschluss an, um die Schaltung zu schließen (Abbildung 1B). Führen Sie an2 dieser Stelle CO2-Gas-Euthanasie durch und überprüfen Sie durch Brustpunktion oder eine andere Methode.</li>
	<li>Bedecken Sie die feuchte Kammer mit dem erwärmten Deckel. Überprüfen Sie regelmäßig den Perfusate-Pegel, und fügen Sie bei Bedarf weitere hinzu. Die Perfusion kann bis zu 2 Stunden lang durchgeführt werden. HINWEIS: 5 ml Perfusat werden benötigt, um das geschlossene Perfusionssystem einzurichten. Wenn es keine Leckaden oder Ödeme gibt, verringert sich das Volumen von Perfusate um weniger als 1 ml und ein zusätzlicher Puffer wird nicht benötigt. Um Ödeme zu vermeiden, die durch peripheren zirkulierenden Thrombus induziert werden, kann der Perfusionspuffer, der 0,002% Heparin enthält, in den ersten 10 Minuten der Perfusion verwendet werden, sollte jedoch in Puffer ohne Heparin geändert werden, um das Auslaufen am Rand der Einschnitte zu vermeiden.</li>
	<li>Falls erforderlich, fügen Sie jederzeit ein Reagenz der Wahl in das Perfusionsreservoir oder den Injektionsanschluss ein (Abbildung 1B-5). Zum Beispiel können 10 l von 10 mg/ml Hoechst33342 in die Perfusate aufgenommen werden, um die Zellkerne 2 h vor dem Ende der Perfusion zu färben, oder 50 l von 1 mg/ml DyLight 649-lectin, um die vaskulären Endothelzellen 30 min vor dem Ende der Perfusion zu färben. HINWEIS: Wenn Sie versuchen, Knochenmark mit Hoechst-Lösung zu färben, müssen Mäuse 30 Minuten vor der Operation vorinjiziert werden.</li>
	<li>Nach perfusion mit fluoreszierenden Reagenzien weitere 10 Minuten mit Perfusionspuffer auswaschen, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren.</li>
</ol>4. Analyse von durchgeflossenen Organen
<ol><li>Sammeln Sie Organe wie Hoden, Prostata, Blase, Oberschenkelknochen, Muskel und Haut (z. B. Füße). Ein Stück Orgel ca. 1 mm3 verbrauchen und zwischen zwei Glasrutschen abflachen.<ol>
<li>Studie unter invertiertem fluoreszierendem Konfokalmikroskop mit DAPI/Cy5-Anregungs- und Emissionsfiltern (Anregungslaser : DAPI, 405 nm; Cy5.640 nm). Verwenden Sie mindestens 200x Vergrößerungsobjektiv mit einer 0,45 numerischen Blende.</li>
		<li>Alternativ können Sie die Organe mit 4% Formaldehydlösung für 24 h fixieren und Hämatoxylin-Eosin-Färbung19durchführen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um ein Knochenfenster für intakte Knochenmarkbeobachtung zu erstellen, immobilisieren Sie beide Enden des Oberschenkelknochens oder Tibia und kratzen Sie den kortikalen Knochen mit der seitlichen Kante einer 19 G Nadel weg, um das Periost freizulegen; achten Sie darauf, eine dünne Schicht Restknochen zu halten. Legen Sie den Knochen auf einen Deckelzettel mit dem Fenster zum Glas und das Bild mit invertiertem fluoreszierendem konfokaren Mikroskop mit DAPI- und Cy5-Kanälen, wie oben beschrieben. Die Zellen und das Gefäßnetz in der Knochenmarkhöhle können leicht beobachtet werden.</li>
</ol>

<ol><li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+year+follow-up+of+lung+transplantations+using+initially+rejected+donor+lungs+after+reconditioning+using+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).</li>
<li>Kabagambe, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Ex+vivo+Hypothermic+and+Normothermic+Perfusion+for+Assessment+of+High-risk+Deceased+Donor+Human+Kidneys+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation.</a> Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).</li>
<li>Knaak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+subnormothermic+ex+vivo+liver+perfusion+for+the+storage%2C+assessment%2C+and+repair+of+marginal+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51419(2014).</li>
<li>Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+in+the+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis in the perfused rat liver.</a> Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).</li>
<li>Nielsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+increases+water+permeability+of+kidney+collecting+duct+by+inducing+translocation+of+aquaporin-CD+water+channels+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li>
<li>Schreiter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+perfusion+system+emulating+in+vivo+conditions+in+noncirrhotic+and+cirrhotic+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscous+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors%3A+effect+of+hematocrit+on+intratumor+blood+viscosity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity.</a> Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).</li>
<li>Duyverman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+tumor+perfusion+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An isolated tumor perfusion model in mice.</a> Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).</li>
<li>Sears, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+a+tumor-containing+colon+with+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody.</a> J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).</li>
<li>Duda, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+cells+facilitate+lung+metastasis+by+bringing+their+own+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).</li>
<li>Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+reduces+the+interstitial+fluid+pressure+in+a+human+colon+adenocarcinoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft.</a> Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors+perfused+ex+vivo%3A+effects+of+tumor+size+and+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure.</a> Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).</li>
<li>Zhang, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Maintenance+of+Primary+Human+Multiple+Myeloma+Cells+through+the+Optimization+of+the+Osteoblastic+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+flow+chamber+for+engineering+bone+marrow+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function.</a> Biomaterials. 146, 60-71 (2017).</li>
<li>Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+isolated+limb+infusion+model+for+investigation+of+drug+delivery+kinetics+to+solid+tumors+by+thermosensitive+liposomes+and+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia.</a> Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).</li>
<li>Tietjen, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+targeting+to+the+endothelium+during+normothermic+machine+perfusion+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys.</a> Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).</li>
<li>Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+human+skin+flap+model%3A+A+missing+link+in+skin+penetration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986(2008).</li>
<li>Hekman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Dual-Modality+Imaging+in+Renal+Cell+Carcinoma%3A+An+Ex+vivo+Kidney+Perfusion+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study.</a> Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).</li>
<li>Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+the+study+of+tumor+metabolism+by+nuclear+magnetic+resonance%3A+characterization+of+the+phosphorus-31+spectrum+of+the+isolated+perfused+Morris+hepatoma+7777%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777.</a> Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der beschriebene Kreislauf kann verwendet werden, um verschiedene Forschungsfragen zu untersuchen, zum Beispiel die Rolle verschiedener Serumkomponenten und Gewebebarrieren bei der Medikamentenabgabe oder Immun- und Stammzellhandel. Verschiedene Arzneimittelabgabesysteme (z.B. Liposomen und Nanopartikel) können dem Perfusate hinzugefügt werden, um die Rolle physiologischer und biochemischer Faktoren bei der Abgabe zu verstehen. Die Dauer der Perfusion kann variieren, abhängig von dem untersuchten Gewebe, wissenschaftlich...

Isolierte Organperfusion wurde ursprünglich entwickelt, um Organphysiologie für Transplantation1,2,3zu studieren und ermöglichte das Verständnis der Funktionen der Organe ohne Störungen durch andere Körpersysteme. Zum Beispiel, isolierte Nieren- und Herzperfusion war immens nützlich für das Verständnis der Grundprinzipien der Hämodynamik und Der Wirkung von vasoaktiven Wirkstoffen, während Leberperfusion war wichtig, um die metabolische Funktion zu verstehen, einschließlich Desarzneimittelstoffwechsel in gesundem und krankem Gewebe4,5,6,7. Darüber hinaus waren Perfusionsstudien entscheidend für das Verständnis der Lebensfähigkeit und Funktion von Organen, die für die Transplantation bestimmt sind. In Cancer Researchearch wurde die isolierte Tumorperfusion von mehreren Gruppen mit Maus, Ratte und frisch resektierten menschlichen Gewebenbeschrieben 8,9. Bei einer isolierten Tumorperfusion wurde der Tumor in das Eierstockfettpad implantiert, um das Wachstum von Tumoren zu erzwingen, die Blutgefäße aus der mesentery arterienden10versorgen. Die Jain-Gruppe führte bahnbrechende Studien mit isolierter Perfusion von Darmadenokarzinomen durch, um Tumorhämodynamik und Metastasen8,11,12,13zu verstehen. Weitere innovative Ex-vivo-Setups sind ein 96-Well-Platten-basiertes Perfusionsgerät zur Kultur der primären menschlichen Multiple-Myelom-Zellen14 und eine modulare Durchflusskammer für die technische Knochenmarkarchitektur und Funktionsforschung15.
Neben Physiologie- und Pathologiestudien wurde die Organperfusion verwendet, um die Grundprinzipien der Medikamentenabgabe zu untersuchen. So beschrieb eine Gruppe die isolierte Rattengliederperfusion und untersuchte die Anhäufung von Liposomen bei implantierten Sarkomen16, während eine andere Gruppe eine sezierte menschliche Nierenperfusion durchführte, um die endotheliale Ausrichtung von Nanopartikeln zu untersuchen17. Ternullo et al. verwendeten eine isolierte perfundierte menschliche Hautklappe als nah in vivoHautarzneimittelPenetrationsmodell 18.
Trotz dieser Fortschritte bei der Durchblutung großer Organe und Gewebe, gab es keine Berichte über In-situ-Perfusionsmodelle bei Mäusen, die: a) Bypass-Clearance-Organe wie Leber, Milz und Nieren; b) Beckenorgane, Haut, Muskel, Fortpflanzungsorgane (männlich), Blase, Prostata und Knochenmark. Aufgrund der geringen Größe dieser Organe und der zuliefernden Vaskulatur war eine Ex-vivo-Kanülierung und der Aufbau eines Perfusionskreislaufs nicht möglich. Die Maus ist das wichtigste Tiermodell in der Krebs- und Immunologieforschung und der Medikamentenabgabe. Die Fähigkeit, kleine Mausorgane zu durchdringen, würde es ermöglichen, interessante Fragen bezüglich der Medikamentenabgabe an diese Organe zu beantworten, einschließlich zu Tumoren, die in das Becken implantiert wurden (Blase, Prostata, Eierstock, Knochenmark), sowie Studien über grundlegende Physiologie und Immunologie von Erkrankungen dieser Organe. Um diesen Mangel zu beheben, haben wir bei Mäusen einen In-situ-Perfusionskreislauf entwickelt, der möglicherweise Gewebeverletzungen vermeiden kann und sich viel besser für die funktionelle Forschung eignet als isolierte Organperfusion.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5x-90x Stereo-Zoom-Mikroskop auf Galgenstativ mit LED-Licht</td><td>Amscope</td><td>SKU: SM-3BZ-80S</td><td></td></tr><tr><td>Kohlendioxid, USP</td><td>Airgas Gesundheitswesen</td><td>19087-5283</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>NIKON</td><td>ECLIPSE Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Einweg-Kauterstift mit</td><td>Hochtemperatur-FIAB</td><td>F7244</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtkammer-Blasenfalle (Teil 6 in Abbildung 1)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733692</td><td>Kundenspezifisch als Perfisatbehälter; ermöglichte auch die Perfusion mit konstantem Druck</td></tr><tr><td>Feuchte Kammerabdeckung mit Quarzfenster (Teil 3 in Abbildung 1)</td><td>Harvard-Gerät</td><td>733524</td><td>Halten der Temperatur der Kammer</td></tr><tr><td>Feuchte Kammer mit Metallrohr-Wärmetauscher</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732901</td><td>Wasserummantelte Feuchtkammer mit Deckel zur Aufrechterhaltung der Perfusat- und Maustemperatur</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar-Nadelhalter mit Nahtschneidern</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>125014</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffkomprimiert, USP</td><td>Airgas Healthcare</td><td>C2649150AE06</td><td></td></tr><tr><td>Rollenpumpe (Teil 4 in Abbildung 1)</td><td>Harvard-Gerät</td><td>730113</td><td>Abgabe von Perfusat an die Kanüle in der Feuchtkammer</td></tr><tr><td>SCP plugsys Servosteuerung F/Perfusion (Teil 1 in Abbildung 1)</td><td>Harvard Apparat</td><td>732806</td><td>Steuerung der Purfusionsgeschwindigkeit</td></tr><tr><td>Silikonpad</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauchsatz (Pfeile in Abbildung 1)</td><td>Harvard Apparat (TYGON)</td><td>733456</td><td></td></tr><tr><td>Student Standard Pattern Pinzette</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische</td> <td>SchereFine Science Tools (FST)</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>Tisch für Feuchtkammer</td><td>Harvard Apparat</td><td>734198</td><td></td></tr><tr><td>Thermozirkulator (Teil 2 in Abbildung 1)</td><td>Harvard Apparat</td><td>724927</td><td>zirkulierendes Wasserbad für alle wasserummantelten Komponenten</td></tr><tr><td>Dreiwegehahn (Teil 5 in Abbildung 1)</td><td>Cole-Palmer</td><td>30600-02</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiegerät für Veterinärmedizin</td><td>Highland</td><td>HME109<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>19-G BD PrecisionGlide Nadel</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Zum Immobilisieren der Insyte Autoguard Winged Nadel und zum Kratzen des kortikalen Knochens</td></tr><tr><td>4-0 Seidennähte</td><td>Keebomed-Hopemedical</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Seidennähte</td><td>Keebomed-Hopemedical</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Filter ( 0,2 &Mikro; m)</td><td>ThermoFisher</td><td>42225-CA</td><td>Filter für 5% BSA-RINGER" S</td></tr><tr><td>Permanentmarker</td><td>Staedtler</td><td>342-9</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (10 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2E</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (60 mL)</td><td>BD</td><td>309653</td><td>Filter für 5% BSA-RINGER" S</td></tr><tr><td>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Evansblau ( w/v ) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,5)</td><td>Sigma</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>10% gepuffertes Formalin</td><td>velleyvet</td><td>36692</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse ( 8-10 Wochen alt )</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baxter Viaflex Laktat Ringer's Lösung</td><td>EMRN Medical Supplies Inc.</td><td>JB2324</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Thermo Fisher</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylatkleber</td><td>Krazy Kleber</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DyLight-649-lektin</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>ZB1214</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (70% (vol/vol))</td><td>Pharmco</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Enterprises Limited</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

etablierung von in situ closed circuit perfusion von unteren bauchorganen und hinterbeinen bei mäusen

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Ex-vivo-Perfusion ist ein wichtiges physiologisches Werkzeug, um die Funktion isolierter Organe (z. B. Leber, Nieren) zu untersuchen. Gleichzeitig ist die Ex-vivo-Perfusion von Knochen, Blase, Haut, Prostata und Fortpflanzungsorganen aufgrund der geringen Größe der Mausorgane eine Herausforderung oder nicht machbar. Hier berichten wir zum ersten Mal von einem In-situ-Unterkörper-Perfusionskreislauf bei Mäusen, der die oben genannten Gewebe umfasst, aber die wichtigsten Clearance-Organe (Niere, Leber und Milz) umgeht. Der Kreislauf wird durch Konserven der Abdominalaorta und der unteren Vena cava über der Iliasarterie und Vene und kauterisierenden peripheren Blutgefäßen hergestellt. Die Perfusion erfolgt über eine peristaltische Pumpe mit Perfusatenstrom, der bis zu 2 h gehalten wird. Die In-situ-Färbung mit fluoreszierendem Lektin und der Hoechst-Lösung bestätigte, dass die Mikrovaskulatur erfolgreich durchdrungen wurde. Dieses Mausmodell kann ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung pathologischer Prozesse sowie Mechanismen der Medikamentenabgabe, Migration/Metastasierung zirkulierender Tumorzellen in/aus dem Tumor und Wechselwirkungen des Immunsystems mit durchsetzten Organen und Geweben sein.

Wir richten ein geschlossenes Leitungsperfusionssystem durch Konkavulation der Bauchaorta und der unteren Vena cava von 8-10 Wochen alten Mäusen ein, während das Volumen des Perfusionspuffers weniger als 10 ml bleibt. Abbildung 3A zeigt konfokale Bilder nach dem Durchdringenden von Geweben mit Ringer-Lösung, die Hoechst 33342 und DyLight 649-lectin enthält. Muskel-, Knochenmark-, Hoden-, Blasen-, Prostata- und Fußhaut zeigen eine effiziente Kern- und Gefäßfärbung. Abbild...

Ein Protokoll wird für die In-situ-Perfusion des Unterkörpers der Maus beschrieben, einschließlich der Blase, der Prostata, der Geschlechtsorgane, des Knochens, des Muskels und der Fußhaut.

Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Fragen über die Medikamentenabgabe und Immuninteraktionen innerhalb der organe in unserem Kreislauf enthalten zu beantworten. Diese Technik ermöglicht die Durchblutung von Organen, die mit herkömmlichen Ex-vivo-Methoden nicht durchdringen können, während die Hauptclearance-Organe vermieden werden. Bevor Sie mit der Operation beginnen, stellen Sie ein zirkulierendes Wasserbad und alle wasserummantelten Komponenten auf 37 Grad Celsius.Bestätigen Sie, dass der Schlauch gereinigt ist, und verwenden Sie eine Blasenfalle in einer feuchten Kammer als Perfusate-Reservoir, um das Perfusate-Volumen zu begrenzen. Um die Katheterisierung Verfahren durchzuführen, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex, in einer acht bis zehn Wochen alten männlichen anästhesierten Glühbirne siehe Maus. Und legen Sie die Maus in die Supine-Position auf einem Styroporbrett, mit dem Kopf bei sechs Uhr.Immobilisieren Sie die Gliedmaßen der Tiere mit Klebeband, und wischen Sie den Bauch mit Isopropylalkohol ab. Machen Sie einen T-förmigen Schnitt im Bauch, mit Elektrokoagulation, um Blutungen um den Rand des Schnittes zu stoppen. Schieben Sie den Magen, Jejunum und Dickdarm auf die rechte Seite des Bauches, um die Bauchaorta, Vena cava und gemeinsame Ilias- und Iliolumbararterien und Venen zu offenbaren.Unter einem Seziermikroskop die Ovarial- und Iliolumbararterien und Venen mit 4-O-Seidennähten lokalisieren und ligagen. Schleifen Sie zwei 4-O-Seidennähte unter der Bauchaorta und der unteren Vena cava etwa einen Zentimeter über der Iliasarterie und Vene, einen Millimeter voneinander entfernt. Dann ein loses Nicken in der Naht am nächsten an den Iliasgefäßen.Verwenden Sie einen Nadelhalter, um horizontal auszurichten und sowohl die untere Vena cava als auch die Bauchaorta zu dehnen. Und, halten die Gefäße gestreckt, verwenden Sie einen 24-Spur geflügelten Schild IV Katheter, um die Bauchaorta zu punktieren. Sobald die Nadel etwa einen Millimeter in das Gefäß eindringt, drücken Sie den Knopf, um den Nadelkern zurückzuziehen, und legen Sie den Katheter etwa fünf Millimeter in das Gefäß ein.Legen Sie einen Katheter fünf Millimeter in die untere Vena cava, in der gleichen Weise. Und binden Sie beide Nähte um die katheterisierten Gefäße. Dann instant glue anwenden, um die Katheter auf den Erector Spin a zu immobilisieren, und ersetzen Sie die Bauchorgane.Um das Perfusionssystem einzurichten, legen Sie die Maus auf ein Silikonpad in die wasserummantelte Feuchtkammer und immobilisieren Sie die Katheterflügel mit 19-Spur-Nadeln zum Pad. Füllen Sie den arteriellen Kathetereinlass mit vorgewärmten Perfusionspuffer. Verwenden Sie hämostatische Zangen und einen Schraubverbinder, um den Kathetereinlass an den Schläuchen zu befestigen und den Einlassperfusionsschlauch mit Klebeband zu immobilisieren.Stellen Sie den peristaltischen Durchfluss auf 0,6 Milliliter pro Minute ein und halten Sie den Perfusionsabfluss fünf bis zehn Minuten lang offen, um das Blut durch den Venenkatheter zu waschen. Einige Gerinnsel werden im Auslasskatheter vorhanden sein, die Gerinnsel mit Perfusatepuffer ausspülen und eine Schraube am Stecker verwenden, um am Ende des Venenkatheters an den Auslassschläuchen zu befestigen, um den Stromkreis zu schließen. Dann bedecken Sie die feuchte Kammer mit einem vorgewärmten Deckel für bis zu zwei Stunden Perfusion, periodisch auf den Grad der Perfusate überprüfen.Hier werden konfokale Bilder nach Perfusion mit Ringerlösung mit Hoechst 33342 und DyLight-649 lectin gezeigt. Muskel, Knochenmark, Hoden, Blase, Prostata und Fußhaut weisen typischerweise eine effiziente Kern- und Gefäßfärbung auf. Hämatoxylin und Eosin Färbung dieser Gewebe nach drei Stunden normaler thermischer Perfusion, zeigt eine erfolgreiche Spülung der Organe, ohne offensichtliche Gewebeverletzung.Dieses Modell kann verwendet werden, um Drogenaufnahmewege zu verstehen, in der physiologischen irrelevanten Umgebung. Zum Beispiel, um die Rolle von Serumkomponenten bei der Arzneimittelakkumulation zu verstehen. Wir verwenden das System, um den Mechanismus der Liposomenakkumulation in der Haut zu verstehen.

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