Name: Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken mit dem Gliding Kinesin Motility Assay. Diese Methode ermöglicht die selbstständige Assemblierung durch molekulare Motoren.

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Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-) unterstützt. Kinesinsynthese und Fluoreszenzmikroskopie wurden im Rahmen eines Nutzerprojekts (ZIM) am Center for Integrated Nanotechnologies durchgeführt, einer Office of Science User Facility, die für das Office of Science des US-Energieministeriums (DOE) betrieben wird.

1. Herstellung von Stamm-Mikrotubuli-Lösungen
ACHTUNG: Schutzbrille, Handschuhe und ein Laborkittel sollten während des gesamten Protokolls immer getragen werden.
<ol><li>5x BRB80-Puffer vorbereiten: 24,19 g PIPES (Piperazin-N,N′-bis[2-Ethansulfonsäure]) und 0,38 g EGTA (Ethylenglykol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure) in eine 1 L Glasflasche geben. Fügen Sie 1 ml 1 M MgCl2 hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 6,9 ein. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um die Lösung auf ein Endvolumen von 500 ml zu bringen.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM Vorrat an GTP-Lösung vor: Wiegen Sie 52 mg GTP und suspendieren Sie in 1 ml destilliertem Wasser. 100 mM Lösung in 20 μL Aliquots teilen und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie die GPEM-Lösung vor: Mischen Sie 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-Lösung, 100 μL 100% Glycerin und 600 μL deionisiertes Wasser. GPEM-Lösung in 100 μL Aliquots teilen und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Herstellen einer Mikrotubulilösung durch Rekonstitution von Durchstechflaschen mit handelsüblichem, lyophilisiertem Tubulin (je eine Durchstechflasche mit biotinyliertem, fluoreszierend markiert und unmarkiert) in kalter (4 °C) GPEM-Lösung auf eine Stammkonzentration von 5 mg/ml.</li>
	<li>Führen Sie eine Mikrotubulipolymerisation durch, indem Sie 4 μL biotinyliertes Tubulin, 4 μL fluoreszenzmarkiertes Tubulin und 24 μL unmarkiertes Tubulin (alle bei 5 mg/ml-Konzentrationen) mischen, um ein Verhältnis von 1:1:6 bei einem Endvolumen von 32 ml zu erhalten. Halten Sie es auf Eis. Das Tubulingemisch in 2 μL Aliquots teilen und bei -80 °C lagern, bis es benötigt wird. HINWEIS: Eine effiziente Polymerisation erfordert, dass die Tubulinkonzentration gleich oder höher als die kritische Konzentration (5 mg/ml)14 ist. Hier wird die Auswahl des Tubulinverhältnisses für eine ausreichende Konzentration von biotinyliertem Tubulin optimiert, um Streptavidin und GUVs effizient zu binden, sowie eine ausreichende Konzentration an fluoreszierendem Tubulin für die mikroskopische Charakterisierung.</li>
</ol>2. Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)
<ol><li>Agarose-Filmvorbereitung HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Greene et al.15 übernommen.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 1% ige w/v-Lösung vor, indem Sie 1 g Agarose in 100 ml entionisiertem Wasser in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mischen. Verwenden Sie eine Standardmikrowelle, um die Agaroselösung für 1–2 min zu erhitzen. HINWEIS: Die Lösung wird durchscheinend, sobald die Agarose vollständig aufgelöst ist. Lassen Sie die Lösung vor Gebrauch auf 65–75 °C abkühlen.</li>
		<li>Verwenden Sie eine geschnittene 1.000 μL Pipettenspitze, um 300–400 μL Agaroselösung auf ein 25 mm x 25 mm großes Glasdeckglas zu pipettieren. Während Sie den Rand des Deckglases mit behandschuhten Fingern halten, verwenden Sie eine weitere 1.000 μL Pipettenspitze, um die geschmolzene Agarose gleichmäßig über das Deckglas zu verteilen. HINWEIS: Die Beibehaltung der Agarose bei 65–75 °C ermöglicht eine effiziente Verteilung auf der Deckglasoberfläche.</li>
		<li>Trocknen Sie die mit Agarose beschichteten Deckgläser in einem 37 °C Inkubator für mindestens 2 h, woraufhin die Agarose transparent wird. Lagern Sie die Deckgläser, indem Sie die mit Agarose beschichtete Oberfläche nach oben auf eine saubere Oberfläche wie fusselfreies Papier oder Wachsfolie bei Raumtemperatur (RT) legen.</li>
	</ol></li>
	<li>Lipidformulierung<ol>
<li>In Chloroform gelöste Lipide aus einem Gefrierschrank von -20 °C entnehmen und in einen chemischen Rauch geben, bis sie RT erreichen.</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen des Lipidbestands jeder Komponente Lipid, die für die Formulierung benötigt wird, unter Verwendung der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq1.jpg"> Dabei gilt: V-Lipid ist das zu verwendende Lipidvolumen, mol % ist der molare Prozentsatz der Lipidkomponente, n ist die Gesamtzahl der Mol Lipid, die in der Formulierung verwendet werden, und M ist die Konzentration des Lipids in molaren Einheiten. HINWEIS: Wenn beispielsweise eine Formulierung verwendet wird, die 45 Mol-% 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) mit einer Stammlösungskonzentration von 12,72 mM und 1 Mikromol Gesamtlipiden in der Formulierung enthält, wäre das Volumen des in der Formulierung verwendeten DOPC-Stammes: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq2.jpg">
</li>
		<li>Mischen Sie die Lipide im berechneten Verhältnis in einem Glasfläschchen im chemischen Abzug.</li>
		<li>Pipette 30 μL Lipidlösung auf die mit Agarosebeschichteten Deckgläser auf einer vorgewärmten Heizplatte, die über dem Schmelzpunkt der gesättigten Lipidkomponente der Formulierung eingestellt ist (z. B. 50 °C Heizplatte für ein Lipid mit T m von 40 °C).</li>
		<li>Verteilen Sie die Lösung über den Agarosefilm in einer kreisförmigen Bewegung mit dem langen Rand einer 18-G-Nadel, bis das Chloroform verdampft ist und sich eine gleichmäßige Lipidschicht gebildet hat. Halten Sie den Rand des Deckglases mit behandschuhten Fingern, während Sie diesen Schritt ausführen. HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass die Agaroseschicht nicht mit der Nadel beschädigt wird.</li>
		<li>Legen Sie das Deckglas mit Agaroseschicht und Lipidfilm in eine mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale, die Folienseite nach oben zeigt, und legen Sie die Petrischale mindestens 2 Stunden lang in einen Vakuum-Exsikkator, um das Restlösungsmittel zu entfernen.</li>
	</ol></li>
	<li>In der Zwischenzeit stellen Sie 560 mM Saccharoselösung bereit, indem Sie 1,92 g Saccharose mit 10 ml entionisiertem Wasser mischen. HINWEIS: Die Konzentration der Saccharoselösung hängt von der Osmolarität des Puffers ab, in dem GUVs verdünnt werden. Typischerweise sollte die Osmolarität der Saccharoselösung nicht mehr als 10 % größer sein als der Puffer, in dem die GUVs verdünnt werden, insbesondere der Motilitätspuffer (siehe Schritt 3.11).</li>
	<li>GUV-Bildung<ol>
<li>Kleben Sie eine mit dem Lipidfilm beschichtete Klebekammer auf das Abdeckglas, indem Sie die Klebekammer vorsichtig auf den lipidbeschichteten Deckglas drücken, wobei der Lipidfilm nach oben zeigt, um sicherzustellen, dass eine dichte Abdichtung gebildet wird.</li>
		<li>400 μL 560 mM Saccharoselösung (hergestellt in Schritt 2.3) in die Kammer geben.</li>
		<li>Legen Sie den Deckglas in die Feuchtigkeitskammer und schließen Sie den Deckel.</li>
		<li>Legen Sie die Feuchtigkeitskammer auf eine vorgewärmte Heizplatte, die über dem Schmelzpunkt der gesättigten Lipidkomponente der Formulierung liegt.</li>
		<li>Lassen Sie die Vesikel für ≥1 h vor der Genesung bilden. HINWEIS: Die Vesikelbildung kann mit einer Fluoreszenzmikroskopie mit einer 40-fachen Luftobjektivlinse überprüft werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereitung von Motilitätsassay-Beständen und Reagenzien
<ol><li>Vorbereitung des Kaseinbestandes<ol>
<li>Fügen Sie 3 g trockenes Casein in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu, fügen Sie dann 30 ml 1x BRB80 hinzu und drehen Sie, bis die Lösung viskos wird. Zentrieren Sie das Röhrchen bei 15.000 x g für 30 min.</li>
		<li>Den Überstand in ein weiteres 50 mL konisches Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen. Filtern Sie die Lösung durch einen 1-μm-Spritzenfilter und sammeln Sie die Lösung in einer 50 ml konischen Durchstechflasche. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-μm-Filter und sammeln Sie die Lösung in einer 50 ml konischen Durchstechflasche.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration, indem Sie die Absorption bei 280 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer und einer Quarzküvette messen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Kaseinkonzentration in mg/ml nach folgender Formel: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq3.jpg">
</li>
		<li>Verdünnen Sie die Lösung auf 20 mg/ml in 1x BRB80, teilen Sie sie in 100 μL Aliquots und lagern Sie sie bei -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie Glucoseoxidase (2 mg / ml) Stammlösung her, indem Sie 2 mg Glucoseoxidase mit 1 ml 1x BRB80 mischen. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie Katalase (0,8 mg / ml) Stammlösung vor, indem Sie 0,8 mg Katalase mit 1 ml 1x BRB80 mischen. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 M Glucoselösung vor, indem Sie 0,3 g D-Glucose in 1 ml deionisiertem Wasser suspendieren. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM DTT-Vorrat vor, indem Sie 0,015 g DTT in 1 ml deionisiertem Wasser suspendieren. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM Mg-ATP-Vorrat vor, indem Sie 0,055 g Dinatrium-ATP in 1 ml Lösung von 100 mMMgCl 2 suspendieren. In 100 μL Aliquots dividieren und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie die 100 mM Mg-AMP-PNP-Lösung vor, indem Sie 0,055 g AMP-PNP in einer 1 ml Lösung von 100 mMMgCl 2 suspendieren, dann in 100 μL Aliquots teilen und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM Trolox-Lösung vor, indem Sie 25,03 mg Trolox zu 1 ml Methanol hinzufügen und bei -20 ° C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 mg/ml Streptavidinlösung vor, indem Sie 1 mg Streptavidin zu 100 μL BRB80 hinzufügen, dann in 2 μL Aliquots teilen und bei -80ۛ °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie BRB90CAT vor, indem Sie 200 μL 5x BRB80, 20 μL Kaseinlösung, 10 μL MgATP-Lösung, 10 μL Trolox, 5 μL Paclitaxellösung und 765 μL DI-Wasser mischen. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie die Motilitätslösung vor, indem Sie 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-Glucoselösung, 2 μL Glucoseoxidaselösung, 2 μL DTT-Lösung und 2 μL Katalaselösung mischen. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Eine 1 μM Kinesinlösung wird durch Verdünnen der Stammkinesinlösung in BRB80CAT (z. B. 2 μL 50 mM Kinesinlösung in 98 μL BRB80CAT) hergestellt und bei 4 °C gelagert.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10 μg/ml Mikrotubulilösung vor, indem Sie 10 μL stabilisierte Mikrotubuli in 90 μL Raumtemperatur BRB80CAT verdünnen. Speichern bei RT.</li>
	<li>Es wird eine 10 μg/ml Streptavidinlösung durch Zugabe von 0,1 μL 10 mg/ml Streptavidinlösung in 99,9 μL Motilitätslösung hergestellt. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 12-fache GUV-Lösung vor, indem Sie 5 μL GUV-Material in 55 μL Motilitätslösung verdünnen. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Polymerisation von Tubulin in Mikrotubuli<ol>
<li>Ein zuvor hergestelltes 2 μL Aliquot Tubulin wird aus dem Gefrierschrank von -80 °C (hergestellt in Schritt 1.5) gesammelt und für 30 min in ein 37 °C warmes Wasserbad gegeben.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 2 mM Paclitaxel-Lösung vor, indem Sie 1,71 mg Paclitaxel in 1 ml wasserfreies DMSO hinzufügen, in 10 μL Aliquots teilen und bei -20 ° C lagern.</li>
		<li>BRB80T frisch zubereiten, indem Sie 99,5 μL 1x BRB80 mit 0,5 μL 2 mM Paclitaxel mischen.  100 μL BRB80T auf 37 °C im Wasserbad warm.</li>
		<li>Nach 30 min die 100 μL BRB80T in das Tubulinaliquot geben, um die Mikrotubuli zu stabilisieren. Speichern bei RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Gleitmotilitätsassay (GMA)
<ol><li>Bereiten Sie eine Durchflusskammer vor, indem Sie zwei Streifen aus doppelseitigem Klebeband, die durch 5 mm getrennt sind, auf einen Glasschieber legen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis jeder Streifen drei Bandschichten umfasst.</li>
	<li>Legen Sie ein Deckglas auf das Band und drücken Sie es dann vorsichtig mit einer Pinzette oder einem Stift auf die Deckglas-/Bandschnittstelle, um eine ausreichende Haftung zu gewährleisten. HINWEIS: Der Kanal sollte 5 mm breit, 25 mm lang und 300 mm hoch sein.</li>
	<li>30 μL 1 mm Kinesinlösung (hergestellt in Schritt 3.12) in die Durchflusszelle pipettieren und 5 min inkubieren lassen. HINWEIS: Das Casein bildet eine Doppelschicht auf der Oberfläche des Deckglases / Glasobjektträgers und erleichtert die Befestigung des Kinesin-Schwanzes an der Oberfläche.</li>
	<li>Pipette 30 μL 10 μg/ml Mikrotubulielösung (hergestellt in Schritt 3.13) in die Durchflusszelle, wobei ein Labortuch verwendet wird, das sanft gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals gedrückt wird, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. 5 min inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie die Durchflusszelle 1x–3x mit 1x Motilitätslösung bei RT (vorbereitet in Schritt 3.11). HINWEIS: Die Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Luftobjektiv kann an dieser Stelle verwendet werden, um die Mikrotubuli-Befestigung und -Motilität zu bestätigen. Mikrotubuli erscheinen als fluoreszierende Filamente (Dutzende von Mikrometern Länge), die sich mit ~0,5 μm/s über die Oberfläche bewegen (gleiten) (Abbildung 1).</li>
	<li>Pipette 30 μL 10 μg/ml Streptavidinlösung (hergestellt in Schritt 3.14) in die Durchflusszelle unter Verwendung eines Labortuchs, das vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals gedrückt wird, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. 10 min inkubieren</li>
	<li>Fließen Sie 30 μL 12x GUV-Lösung (hergestellt in Schritt 3.15) in den Durchfluss mit einem Labortuch, das vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals gedrückt wird, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. 30 min inkubieren</li>
	<li>Geben Sie 2 μL 100 mM AMP-PNP-Lösung (hergestellt in Schritt 3.7), um die Motilität zu stoppen, und verschließen Sie dann die Kammer mit Dichtmittel.</li>
</ol>5. Charakterisierung des LNT-Netzwerks
<ol><li>Übertragen Sie die Durchflusskammer zur Bildgebung auf ein inverses Mikroskop.</li>
	<li>Wählen Sie den geeigneten Filtersatz basierend auf den Wellenlängen der verwendeten fluoreszierenden Lipide oder Tubuline. Wenn Sie beispielsweise Texas Red-markierte Lipide verwenden, verwenden Sie einen 560 nm/25 nm Anregungsfilter und einen 607 nm/36 nm Emissionsfilter.</li>
	<li>Verwenden Sie ein 100-faches Ölobjektiv, um auf die Oberfläche des Deckglases zu fokussieren.</li>
	<li>Stellen Sie die LNT-Netzwerke mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie dar. HINWEIS: LNTs sind lineare Strukturen, die aus den größeren Vesikeln extrudieren. LNTs viel kleiner als GUVs und haben schwächere Fluoreszenzsignale. Daher müssen die Belichtung und der Kontrast entsprechend den Bild-LNTs angepasst werden. Diese Anpassungen führen auch zu einer Überbelichtung der GUVs, und daher wird empfohlen, die Lamellen- und Phasentrennung in GUVs unabhängig voneinander zu charakterisieren.</li>
	<li>Fokussieren Sie das Mikroskop auf ein interessantes Netzwerk und nehmen Sie ein Standard- oder Kachelbild auf.</li>
	<li>Passen Sie die Belichtungszeit und die Neutraldichtefilter an, um die LNTs abzubilden und die gesättigte Belichtung der GUVs zu minimieren. Erfassen Sie Bilder sowohl in roten als auch in grünen Kanälen. HINWEIS: Hier ermöglicht der rote Kanal die Visualisierung der Texas-Red-Lipide, während der grüne Kanal die Visualisierung der Mikrotubuli (z. B. Oregon Green-Lipide und HiLyte488-Farbstoffe) ermöglicht.</li>
	<li>Erstellen Sie ein zusammengesetztes Bild, indem Sie den roten und den grünen Kanal überlagern (Abbildung 1).</li>
	<li>Charakterisierung von LNT-Netzwerken durch Messung der LNT-Länge<ol>
<li>Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Bildanalysesoftware wie ImageJ.</li>
		<li>Kalibrieren Sie die Skala für das Mikroskop mithilfe der eingestellten Skalierungsfunktion, geben Sie die Pixel auf den Umrechnungsfaktor mm ein und klicken Sie auf OK. HINWEIS: Der Umrechnungsfaktor hängt vom Mikroskop, dem Objektivobjektiv und der Kamera ab und kann mit einem Objektträger zur Kalibrierung des Mikroskops ermittelt werden. Sie wird im Allgemeinen in Pixel/mm ausgedrückt.</li>
		<li>Verwenden Sie das Multipoint-Linienwerkzeug , um die Länge der Nanoröhrchen ausgehend vom Eltern-GUV zu messen. Halten Sie Strg + M gedrückt, um die Länge zu messen.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Messung der Längen einzelner Rohre fort, indem Sie die obigen Schritte ausführen. Das Bildverarbeitungswerkzeug speichert jede neue Messung im Ergebnisfenster.</li>
		<li>Halten Sie Strg + D gedrückt, nachdem Sie jede Linie gezeichnet haben, um zu verfolgen, welche Rohre gemessen wurden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messung der LNT-Dicke (Abbildung 2)<ol>
<li>Öffnen Sie das Bild in ImageJ, und wählen Sie unter der Registerkarte Bild die Funktion Schwellenwert aus.</li>
		<li>Klicken Sie auf Übernehmen, um den Schwellenwert anzuwenden.</li>
		<li>Zeichnen Sie ein Rechteck bekannter Länge über das gewünschte Rohr (schwarze Pixel haben einen Wert von 0 und rote Pixel haben einen Wert von 255).</li>
		<li>Messen Sie die integrierte Dichte der Fläche.</li>
		<li>Teilen Sie die Dichte durch die Länge (in Pixel) der LNT, um die Dicke (in Pixel) zu erhalten. HINWEIS: Die Dickenmessungen können nur dann über Bilder hinweg verglichen werden, wenn die Bildeinstellungen und der Schwellenwert identisch eingestellt sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmung der Lipidpartitionierung in Knoten von LNTs (Abbildung 3)<ol>
<li>Öffnen Sie das Bild in ImageJ.</li>
		<li>Verwenden Sie das Linienwerkzeug , um eine Linie über den gewünschten Knoten zu zeichnen.</li>
		<li>Messen Sie die Knotenintensität sowohl im Oregon Green- als auch im Texas Red-Kanal.</li>
		<li>Verschieben Sie die Linie zum LNT und messen Sie die LNT-Intensität sowohl im Oregon Green- als auch im Texas Red-Kanal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+of+Chemistry+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li>
</ol>

Sandia National Laboratories ist ein Multimissionslabor, das von National Technology & Engineering Solutions of Sandia, LLC., einer hundertprozentigen Tochtergesellschaft von Honeywell International, Inc., für die National Nuclear Security Administration des US-amerikanischen DOE unter Vertrag DE-NA-0003525 verwaltet und betrieben wird. Dieses Papier beschreibt objektive technische Ergebnisse und Analysen. Alle subjektiven Ansichten oder Meinungen, die in dem Papier zum Ausdruck gebracht werden könnten, stellen nicht unbedingt die Ansichten des US-Energieministeriums oder der Regierung der Vereinigten Staaten dar.

LNT-Netzwerke sind ein nützliches Werkzeug für In-vitro-Studien zu Membraneigenschaften und dem Transport von Biomolekülen wie Transmembranproteinen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung komplexer Lipidformulierungen zur Herstellung von LNT-Netzwerken biologisch relevantere Studien. Andere Herstellungsstudien haben entweder 1) einfache Lipidformulierungen und mehrfeldrige Vesikel oder 2) umständlichere Motilitätstechniken verwendet, um Netzwerke aus GUVs herzustellen, die aus komplexen Lipidformulierungen bestehen. D...

Die Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken (LNT) ist von zunehmendem Interesse für die In-vitro-Untersuchung von Nichtgleichgewichtslipidstrukturen 1,2,3. Zellen verwenden Lipidtubuli für den diffusiven Transport der Proteine4 und Nukleinsäuren5 sowie für die Zell-zu-Zell-Kommunikation 6,7. Das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat sind besonders interessant, da diese membrangebundenen Organellen die primären Orte für die Lipid- und Proteinsynthese sowie den Transport dieser integralen Biomoleküle innerhalb des Zytoplasmas einer Zellesind 8,9. Die Membranen dieser Organellen bestehen aus mehreren Lipidspezies, einschließlich Sphingolipiden, Cholesterin und Phospholipiden10, die letztendlich dazu beitragen, ihre Funktionalität zu definieren. Um diese Organellen genauer zu replizieren und zu untersuchen, müssen daher in vitro LNTs aus Vesikeln mit immer komplexeren Lipidformulierungen hergestellt werden11.
Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) werden häufig zur Untersuchung des Lipidmembranverhaltens verwendet, da sie zuverlässig mit komplexen Formulierungen synthetisiert werden können, die Cholesterin, Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylinositol (PI) 12,13 enthalten. Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Herstellung von LNTs aus GUVs mit unterschiedlichen Lipidformulierungen unter Verwendung des Gleitmotilitätsassays (GMA), bei dem LNTs auf der Grundlage der Arbeit von Kinesin-Motoren und Mikrotubuli-Filamenten, die auf GUVs wirken, extrudiert werden. In diesem System treiben Kinesin-Motorproteine, die an einer Oberfläche adsorbiert werden, biotinylierte Mikrotubuli an und wandeln chemische Energie aus der Hydrolyse von ATP in nützliche Arbeit um (insbesondere die Extrusion von LNTs aus biotinylierten Vesikeln)11. Das resultierende LNT-Netzwerk bietet eine Modellplattform, um die Auswirkungen der Unterschiede in den Lipidphasen auf Veränderungen in der LNT-Morphologie zu untersuchen.
Kurz gesagt, Kinesin-Motorproteine werden in einer caseinhaltigen Lösung in eine Strömungskammer eingebracht, die die Adsorption der Motoren auf die Glasoberfläche der Kammer ermöglicht. Als nächstes fließen biotinylierte Mikrotubuli in einer ATP-haltigen Lösung durch die Kammer und dürfen an die Kinesin-Motoren binden und die Motilität beginnen. Eine Streptavidinlösung wird dann in die Kammer eingeführt und lässt nicht-kovalent an die Mikrotubuli binden. Schließlich werden GUVs, die ein biotinyliertes Lipid enthalten, in die Kammer eingeführt und binden an die Streptavidin-beschichteten Mikrotubuli, extrudieren dann LNTs, um im Laufe von 15-30 min großräumige Netzwerke zu bilden. Diese Methode erzeugt große, verzweigte LNT-Netzwerke unter Verwendung von Standardlaborgeräten und Reagenzien zu niedrigen Kosten11.

<table><tbody><tr><td>100x/1.4 Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur</td><td>Olympus</td><td>1-U2B836</td><td>Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Ölobjektiv unendlich korrigiert, RMS Gewinde Arbeitsabstand 0,12 mm</td></tr><tr><td>3,0 ND Filter</td><td>Olympus</td><td></td><td>Neutral Density Filter</td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2647</td><td>(&beta;,&gamma;-imidoadenosin 5&prime;-triphosphat)</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>Adenosin 5'-triphosphat Dinatriumsalzhydrat BioXtra</td></tr><tr><td>Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 Filterset</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000<</td><td>br/> BrightLine Pinkel Filterset, optimiert für DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 und andere ähnliche Fluorophore, beleuchtet mit LED-basierten Lichtquellen</td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090</td><td>Caseinhydrolysat für die Mikrobiologie</td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>Katalase aus Rinderleber</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>wasserfreies Chloroform enthält 0,5-1,0% Ethanol als Stabilisator</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Avanti</td><td>700000P</td><td>Cholesterin (Schafwolle, >98%) (Pulver)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>D-(+)-Glukosepulver, BioReagenz, geeignet für Zellkultur, geeignet für Insektenzellkultur, geeignet für pflanzliche Zellkultur, &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375C</td><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (in Chloroform)</td></tr><tr><td>DOPE-Biotin</td><td>Avanti</td><td>870282C</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(biotinyl) (Natriumsalz)</td></tr><tr><td>DPPC</td><td>Avanti</td><td>850355P</td><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (pulver)</td></tr><tr><td>DPPE-Biotin</td><td>Avanti</td><td>870285P</td><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(biotinyl) (Natriumsalz)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>DL-Dithiothreitol Lösung 1 M</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA, Egtazinsäure, Ethylen-bis(oxyethylenenitrilo)tetraessigsäure, Glykoletherdiamintetraessigsäure,</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td>Glukoseoxidase aus Aspergillus niger Typ II, &ge; 10.000 Einheiten/g Feststoff (ohne Zusatz von Sauerstoff)</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher</td><td>G33</td><td>Glycerol (zertifiziert ACS), Fisher Chemical</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>Guanosin 5&prime;-triphosphate sodium salt hydrate</td></tr><tr><td>IX-81 Olympus Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>IX81 Inverses Mikroskop von Olympus</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1050121000</td><td>Kalium Hydroxid</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>1,00 M Magnesiumchlorid Lösung</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 Digitalkamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS Kamera</td></tr><tr><td>Oregon Green-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>O12650</td><td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin</td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>ThermoFisher</td><td>P3456</td><td>Paclitaxel (Taxol-Äquivalent) - nur zur Verwendung in der Forschung</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-Piperazindiethansulfonsäure, Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure), Piperazin-N,N&prime;-bis(2-ethansulfonsäure)</td></tr><tr><td>Texas Red-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>T1395MP</td><td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure</td></tr><tr><td>Tubulin, Biotin</td><td>Zytoskelett</td><td>T333P</td><td>Tubulin Protein (Biotin) Schweinehirn</td></tr><tr><td>Tubulin, Hy-Lite 488</td><td>Zytoskelett</td><td>TL488M</td><td>Tubulin Protein (fluoreszierend HiLyte 488) Schweinehirn</td></tr><tr><td>Tubulin, unmarkiertes</td><td>Zytoskelett</td><td>T240</td><td>Tubulin Protein Schweinehirn</td></tr></tbody></table>

herstellung von mehrkomponenten-lipid-nanoröhrchen-netzwerken unter verwendung des gliding kinesin motility assays

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerke (LNT) stellen ein In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Transports und der Lipidbiophysik dar, das für die ubiquitären Lipidtubuli in eukaryotischen Zellen relevant ist. In-vivo-LNTs sind jedoch stark ungleichgewichtsgleiche Strukturen, die chemische Energie und molekulare Motoren erfordern, um zusammengesetzt, aufrechterhalten und reorganisiert zu werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung von in vivo LNTs komplex und besteht aus mehreren verschiedenen Lipidspezies. Typische Methoden zum Extrudieren von LNTs sind sowohl zeit- als auch arbeitsintensiv und erfordern optische Pinzetten, Mikroperlen und Mikropipetten, um Nanoröhrchen gewaltsam aus riesigen Lipidvesikeln zu ziehen. Hier wird ein Protokoll für den Gleitmotilitätsassay (GMA) vorgestellt, bei dem großflächige LNT-Netzwerke schnell aus riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) unter Verwendung von Kinesin-betriebener Mikrotubuli-Motilität erzeugt werden. Mit dieser Methode werden LNT-Netzwerke aus einer Vielzahl von Lipidformulierungen gebildet, die die Komplexität biologischer LNTs nachahmen, was sie für In-vitro-Studien der Lipidbiophysik und des membranassoziierten Transports immer nützlicher macht. Darüber hinaus ist diese Methode in der Lage, LNT-Netzwerke in kurzer Zeit (<30 min) mit gängigen Laborgeräten zuverlässig herzustellen. LNT-Netzwerkeigenschaften wie Länge, Breite und Lipidpartitionierung sind ebenfalls abstimmbar, indem die Lipidzusammensetzung der GUVs, die für die Herstellung der Netzwerke verwendet werden, geändert wird.

LNT-Netzwerke (Abbildung 4) wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls hergestellt, das die Arbeit des Kinesin-Transports von Mikrotubuli verwendet, um LNTs aus GUVs zu extrudieren. Kurz gesagt, GUVs wurden unter Verwendung von Agarosegel-Rehydratation unter Verwendung von Saccharoselösung hergestellt, und Mikrotubuli wurden in GPEM-Lösung polymerisiert und in BRB80T stabilisiert. Als nächstes wurden Kinesin-Motoren in eine Durchflusszelle eingeführt, die eine aktive Schicht von Mo...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung der Gleitkinesin-Motilität in Verbindung mit riesigen unilamellären Lipidvesikeln.

Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Dieses Protokoll ermöglicht die einfache Erzeugung von großflächigen Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken, in denen die einzelnen Nanoröhrchen ein Phasentrennungsverhalten aufweisen, das dem des Elternvesikels ähnelt. Der entscheidende Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass wir die Arbeit der molekularen Motoren kooptieren, um die Lipidnanoröhren hochgradig parallel und ohne menschliches Zutun selbst zusammenzusetzen. Um einen gleitenden Motilitätsassay einzurichten, befestigen Sie zunächst drei Sätze doppelseitiger Bandstreifen auf einem Glasobjektträger, der fünf Millimeter voneinander entfernt ist.Drücken Sie vorsichtig einen Deckzettel auf das Band und geben Sie 30 Mikroliter einer einmikromolaren Kinesinlösung in die vorbereitete Durchflusszelle. Fügen Sie nach fünf Minuten 30 Mikroliter einer 10-Mikrogramm / Milliliter-Mikrotubuli-Lösung in die Zelle hinzu und drücken Sie ein Labortuch vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. Nach einer weiteren fünfminütigen Inkubation waschen Sie die Zelle ein- bis dreimal mit 50 Mikrolitern Raumtemperatur-Motilitätslösung pro Waschgang, bevor Sie 30 Mikroliter 10-Mikrogramm / Milliliter Streptavidin-Lösung in die Durchflusszelle geben.Nach 10 Minuten 30 Mikroliter einer 10-fachen GUV-Lösung für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Dann fügen Sie zwei Mikroliter einer 100-Millimolaren AMP-PNP-Lösung hinzu und schließen Sie die Kammer mit Dichtmittel. Übertragen Sie die Durchflusskammer zur Bildgebung auf ein inverses Mikroskop und wählen Sie den entsprechenden Filtersatz aus.Verwenden Sie ein 100X-Ölobjektiv, um zuerst die Oberfläche des Deckglases zu fokussieren, bevor Sie ein Bild eines interessanten Netzwerks aufnehmen. Öffnen Sie dann das Bild in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Farbe und Komposit, um die roten und grünen Kanäle zu überlagern und ein zusammengesetztes Bild zu erstellen. Öffnen Sie nach der Bildgebung das Bild von Interesse und klicken Sie auf Analysieren und Skala einstellen, um die Skala für das Mikroskop zu kalibrieren.Geben Sie die Pixel in den Mikrometer-Umrechnungsfaktor ein und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie das Multi-Point-Line-Tool, um die Nanoröhrchen ausgehend vom übergeordneten GUV zu verfolgen, und halten Sie Control und M gedrückt, um die Länge zu messen. Das Bildverarbeitungswerkzeug speichert jede neue Messung im Ergebnisfenster. Wenn alle Röhren gemessen wurden, wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, und klicken Sie auf Anwenden, um den Schwellenwert anzuwenden.Zeichnen Sie dann ein Rechteck bekannter Länge über das gewünschte Rohr. Um die integrierte Dichte des Bereichs zu messen, klicken Sie auf Analysieren und Messen Um die Lipidpartitionierung in den flüssigen Nanoröhrenknoten zu bestimmen, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie über den interessierenden Knoten zu zeichnen und die Knotenintensität sowohl im grünen als auch im roten Kanal zu messen. In dieser repräsentativen Analyse wurden flüssige Nanoröhrchennetzwerke hergestellt, wie gezeigt wurde, um flüssigkeitsungeordnete und geordnete Phasen sowie phasengetrennte Vesikel zu erzeugen.Zum Beispiel führen Vesikel, die mit 45% gesättigtem Lipid und 55% ungesättigtem Lipid synthetisiert werden, zu Vesikeln, die sich in koexistierende flüssigkeitsungeordnete und feste Phasen trennen. Wenn jedoch Cholesterin einbezogen wird, kann dann eine Flüssigkeit-Flüssig-Koexistenz beobachtet werden, wodurch GUVs entstehen, die sich in koexistierende flüssig geordnete und flüssigkeitsungeordnete Phasen trennen. Darüber hinaus können Knoten innerhalb der phasengetrennten Gemische beobachtet werden.Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist, die geeignete Belichtungszeit und das ND-Filterset auszuwählen, um die Lipidnanoröhren visualisieren zu können, ohne die Fluorophore photobleichen zu müssen. Die Anpassung der Zusammensetzung des Phasenverhaltens der Lipidnanoröhren ermöglicht es uns, ein minimalistisches Modellsystem zu verwenden, um die Biophysik der tunnelnden Nanoröhren zu untersuchen, die Zellen verbinden.

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Forschung

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Molekulare Shuttles, bestehend aus funktionalisierten Mikrotubuli Gleiten auf der Oberfläche haften Kinesin Motorproteine ​​können als nanoskalige Nahverkehr dienen. Hier ist die Montage eines typischen Shuttle-System beschrieben.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

In diesem Video führen wir einen in vitro Motilitätsassay durch, um die Aktin-Myosin-Wechselwirkungen zu analysieren. Die Gleitbewegung von Aktinfilamenten auf immobilisierten Myosinmolekülen wird mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Der gleitende Aktinfilament-Assay: Ein In-vitro-Motilitätsassay zur Untersuchung der Translokation von Aktinfilamenten auf immobilisierten Myosinen

Ein Verfahren, um die Persistenzlänge oder Biegesteifigkeit von Biopolymeren messen beschrieben. Das Verfahren verwendet eine Kinesin-Mikrotubulus angetriebenen Gleitflug Assay experimentell die Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli und ist anpassbar an Aktin-basierten Assays Gleiteigenschaften.

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Wir berichten über eine intelligente Anwendung von Kohlenstoffnanoröhren zur kinetischen Stabilisierung von Lipidpartikeln, die selbstorganisierte Nanostrukturen in ihren Kernen enthalten. Die Herstellung von Lipidpartikeln erfordert relativ geringe Konzentrationen von Kohlenstoffnanoröhren, die ihren Einsatz in biomedizinischen Anwendungen wie der Verabreichung von Medikamenten ermöglichen.

Facile Herstellung von Intern Selbstorganisierte Lipidpartikel stabilisiert durch Kohlenstoff-Nanoröhren

Solide unterstützt, eiweißfreie, doppelte Phospholipid Bilayer Membranen (DLBM) können in komplexen und dynamischen Lipid Nanotube Netze umgewandelt werden und können als 2D Bottom-up-Modellen von dem endoplasmatischen Retikulum dienen.

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

Wir präsentieren ein Protokoll zur molekularen Shuttles zu bauen wo treiben Motorproteine Kinesin Oberfläche eingehalten Farbstoff-markierten Mikrotubuli. Schwachen Wechselwirkungen die Kinesine mit der Oberfläche ermöglicht ihre reversible Bindung. Dadurch entsteht ein Nano-System das dynamische Montage und Demontage der Komponenten unter Beibehaltung seiner Funktionalität aufweist.

Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

Ziel dieses Protokolls ist es, Ensembles molekularer Motoren auf DNA-Origami-Nanostrukturen zu bilden und die Ensemblemotilität mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zu beobachten.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Dieser Artikel stellt Protokolle für die Entwicklung und Charakterisierung abstimmbarer dreidimensionaler Verbundnetzwerke aus co-verschränkten Aktinfilamenten und Mikrotubuli vor. Verbundwerkstoffe unterliegen einer aktiven Umstrukturierung und ballistischen Bewegung, die von Myosin II- und Kinesinmotoren angetrieben wird, und werden durch die relativen Konzentrationen von Aktin, Mikrotubuli, Motorproteinen und passiven Vernetzern abgestimmt.

Rekonstitution und Charakterisierung von Aktin-Mikrotubuli-Verbundwerkstoffen mit abstimmbarer motorgetriebener Dynamik und Mechanik

Hier stellen wir Methoden zur Herstellung quasi-zweidimensionaler (2D) verschränker, vernetzter und flüssigkristalliner Aktin-Anordnungen aus gereinigten Proteinen vor.

Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

Erfahren Sie die Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken mit dem Gliding Kinesin Motility Assay. Diese Methode ermöglicht die selbstständige Assemblierung durch molekulare Motoren.

Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays

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