Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays
26. Juli 2021
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung der Gleitkinesin-Motilität in Verbindung mit riesigen unilamellären Lipidvesikeln.
Dieses Protokoll ermöglicht die einfache Erzeugung von großflächigen Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken, in denen die einzelnen Nanoröhrchen ein Phasentrennungsverhalten aufweisen, das dem des Elternvesikels ähnelt. Der entscheidende Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass wir die Arbeit der molekularen Motoren kooptieren, um die Lipidnanoröhren hochgradig parallel und ohne menschliches Zutun selbst zusammenzusetzen. Um einen gleitenden Motilitätsassay einzurichten, befestigen Sie zunächst drei Sätze doppelseitiger Bandstreifen auf einem Glasobjektträger, der fünf Millimeter voneinander entfernt ist.
Drücken Sie vorsichtig einen Deckzettel auf das Band und geben Sie 30 Mikroliter einer einmikromolaren Kinesinlösung in die vorbereitete Durchflusszelle. Fügen Sie nach fünf Minuten 30 Mikroliter einer 10-Mikrogramm / Milliliter-Mikrotubuli-Lösung in die Zelle hinzu und drücken Sie ein Labortuch vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. Nach einer weiteren fünfminütigen Inkubation waschen Sie die Zelle ein- bis dreimal mit 50 Mikrolitern Raumtemperatur-Motilitätslösung pro Waschgang, bevor Sie 30 Mikroliter 10-Mikrogramm / Milliliter Streptavidin-Lösung in die Durchflusszelle geben.
Nach 10 Minuten 30 Mikroliter einer 10-fachen GUV-Lösung für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Dann fügen Sie zwei Mikroliter einer 100-Millimolaren AMP-PNP-Lösung hinzu und schließen Sie die Kammer mit Dichtmittel. Übertragen Sie die Durchflusskammer zur Bildgebung auf ein inverses Mikroskop und wählen Sie den entsprechenden Filtersatz aus.
Verwenden Sie ein 100X-Ölobjektiv, um zuerst die Oberfläche des Deckglases zu fokussieren, bevor Sie ein Bild eines interessanten Netzwerks aufnehmen. Öffnen Sie dann das Bild in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Farbe und Komposit, um die roten und grünen Kanäle zu überlagern und ein zusammengesetztes Bild zu erstellen. Öffnen Sie nach der Bildgebung das Bild von Interesse und klicken Sie auf Analysieren und Skala einstellen, um die Skala für das Mikroskop zu kalibrieren.
Geben Sie die Pixel in den Mikrometer-Umrechnungsfaktor ein und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie das Multi-Point-Line-Tool, um die Nanoröhrchen ausgehend vom übergeordneten GUV zu verfolgen, und halten Sie Control und M gedrückt, um die Länge zu messen. Das Bildverarbeitungswerkzeug speichert jede neue Messung im Ergebnisfenster. Wenn alle Röhren gemessen wurden, wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, und klicken Sie auf Anwenden, um den Schwellenwert anzuwenden.
Zeichnen Sie dann ein Rechteck bekannter Länge über das gewünschte Rohr. Um die integrierte Dichte des Bereichs zu messen, klicken Sie auf Analysieren und Messen Um die Lipidpartitionierung in den flüssigen Nanoröhrenknoten zu bestimmen, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie über den interessierenden Knoten zu zeichnen und die Knotenintensität sowohl im grünen als auch im roten Kanal zu messen. In dieser repräsentativen Analyse wurden flüssige Nanoröhrchennetzwerke hergestellt, wie gezeigt wurde, um flüssigkeitsungeordnete und geordnete Phasen sowie phasengetrennte Vesikel zu erzeugen.
Zum Beispiel führen Vesikel, die mit 45% gesättigtem Lipid und 55% ungesättigtem Lipid synthetisiert werden, zu Vesikeln, die sich in koexistierende flüssigkeitsungeordnete und feste Phasen trennen. Wenn jedoch Cholesterin einbezogen wird, kann dann eine Flüssigkeit-Flüssig-Koexistenz beobachtet werden, wodurch GUVs entstehen, die sich in koexistierende flüssig geordnete und flüssigkeitsungeordnete Phasen trennen. Darüber hinaus können Knoten innerhalb der phasengetrennten Gemische beobachtet werden.
Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist, die geeignete Belichtungszeit und das ND-Filterset auszuwählen, um die Lipidnanoröhren visualisieren zu können, ohne die Fluorophore photobleichen zu müssen. Die Anpassung der Zusammensetzung des Phasenverhaltens der Lipidnanoröhren ermöglicht es uns, ein minimalistisches Modellsystem zu verwenden, um die Biophysik der tunnelnden Nanoröhren zu untersuchen, die Zellen verbinden.
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Übersicht
Dieses Protokoll ermöglicht die einfache Erzeugung großskaliger Lipid-Nanoröhrennetzwerke unter Verwendung der gleitenden Kinesin-Motilität. Die einzelnen Nanoröhren zeigen ein Phasenseparationsverhalten, das dem der Ausgangsvesikel ähnelt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biophysik
- Zellbiologie
Hintergrund
- Lipidnanoröhren sind wichtig für die Untersuchung von Membrandynamik.
- Kinesin-Motoren fördern die Selbstorganisation von Lipidstrukturen.
- Die Phasentrennung in Lipidsystemen kann Einblicke in zelluläre Prozesse liefern.
- Diese Methode verbessert die Skalierbarkeit der Nanorohrenherstellung.
Zweck der Studie
- Effiziente Herstellung von Lipid-Nanoröhrennetzwerken.
- Nutzung molekularer Motoren für die Selbstorganisation ohne menschliches Eingreifen.
- Untersuchung des Phasenverhaltens von Lipid-Nanoröhren.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines Gleitmotilitätsassays unter Verwendung von Kinesin und Mikrotubuli.
- Verwendung von doppelseitigem Klebeband, um eine Durchflusszelle auf einem Objektträger zu erstellen.
- Sukzessive Zugabe von Kinesin- und Mikrotubuli-Lösungen.
- Waschen und Hinzufügen von Streptavidin zur Förderung der Nanoröhrenbildung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung von Lipid-Nanoröhrennetzwerken.
- Nachweis von Phasenseparationsverhalten in den Nanoröhren.
- Hohe Skalierbarkeit der Methode aufgrund der Verwendung molekularer Motoren.
- Potentielle Anwendungen bei der Untersuchung von Membrandyamik und zellulären Prozessen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Herstellung von Lipid-Nanoröhren.
- Die Nutzung von Kinesin-Motoren ermöglicht eine effiziente Selbstassemblierung.
- Dieser Ansatz kann die Forschung in der Lipidbiologie und Membrandyamik voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Schnelle Herstellung mehrkomponentiger Lipid-Nanoröhren-Netzwerke unter Verwendung des gleitenden Kinesin-Motilitätsassays ermöglicht skalierbare, reproduzierbare In-vitro-Modelle für membranassoziierten Transport und Lipid-Biophysik. Dieser Ansatz unterstützt die frühe Entdeckungsphase, indem er abstimmbare, biologisch relevante Systeme bereitstellt, die die Komplexität zellulärer Lipidröhren nachahmen. Die Methode erhöht das Vorhersagevertrauen für mechanistische Studien und die Portfolio-Priorisierung in der forschung zu membranzielgerichteten Therapeutika.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Membrantransportmechanismen in einem kontrollierten, einstellbaren System.
- Unterstützt die funktionelle Validierung molekularer Zielstrukturen, die an Lipiddynamik und -transport beteiligt sind.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung durch Modellierung von Phasenseparation und Lipidverteilungsverhalten.
- Bietet eine Plattform für Hypothesentests zu lipidproteinspezifischen Wechselwirkungen, die für Krankheitswege relevant sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht reproduzierbare und skalierbare Herstellung von Lipid-Nanoröhrennetzwerken für nachgeschaltete Assays.
- Erlaubt die quantitative Messung von Nanoröhrenlänge, -breite und Lipidverteilung zur Standardisierung von Assays.
- Ermöglicht die schnelle Erzeugung komplexer Lipidsysteme unter Verwendung gängiger Laborgeräte.
- Unterstützt das Screening von Substanzen, die die Membranstruktur oder Transportprozesse beeinflussen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bietet ein krankheitsrelevantes Modell zur Untersuchung von Tunnelnannoröhren, die an der interzellulären Kommunikation beteiligt sind.
- Ermöglicht die Analyse des Lipidphasenverhaltens und der Partitionierung und unterstützt so die translationale Biomarker-Entdeckung.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von membranzielgerichteten Interventionen.
- Reduziert biologische Uneindeutigkeit bei der Auswahl präklinischer Modelle für membranaktive Verbindungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in die Entdeckungskette von frühen mechanistischen Studien bis hin zur präklinischen Modellentwicklung für membranassoziierte Zielstrukturen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Wegen bei der lipidvermittelten Transport- und Signalübertragung.
- Screening: Stellt assaysbereite, reproduzierbare Lipid-Nanoröhrennetzwerke mit einstellbaren Eigenschaften bereit.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen der Dimensionen von Nanoröhren und der Lipidverteilung für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus In-vitro-Studien mit krankheitsrelevanten Membranphänomenen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, skalierbare Plattform, die an verschiedene Forschungsprogramme angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Membranbiologie-Forschung.
- Operativer Wert: Vereinfacht die Herstellung, Standardisierung und Reproduzierbarkeit komplexer Lipidsysteme.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz bei portfoliospezifischen Ansätzen, die auf Membranen abzielen.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von therapeutischen Kandidaten mit membranaktiver Wirkung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Lipid-Biophysik und Fluoreszenzmikroskopie für die quantitative Analyse.
- Benötigt Standard-Laborgeräte für den Aufbau von Durchflusszellen und die Bildgebung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der Bildgebung und Messtechnik über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Einsatzmöglichkeiten bei einer Vielzahl von Lipidzusammensetzungen und Modellsystemen für unterschiedliche Forschungsanforderungen.
- Hängt von einer sorgfältigen Kontrolle der Bildgebungsparameter ab, um eine Photobleiche der Fluorophore zu vermeiden.
