Name: Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Lernen Sie eine einfache Methode zur Zeitraffer-Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa-Schwärmen unter Phagen- und Antibiotikastress. Diese kostengünstige Technik ermöglicht Echtzeit-Monitoring bakterieller Bewegungsdynamik.

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J.-L.B., A.S., und N.M.H-K. das Manuskript geschrieben und überarbeitet. Alle Autoren haben die Experimente entworfen. J.-L.B. führte die Experimente und Analysen durch. Diese Arbeit wurde durch den NIH Award K22AI112816 und R21AI139968 Stipendium an A.S. und die University of California unterstützt. N.M.H-K. wurde unterstützt von den Lundbeck Fellowships R220-2016-860 und R251-2017-1070. Die Geldgeber spielten bei der Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einzureichen, keine Rolle. Wir haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

1. Vorbereitung Schwärmender Agarplatten für P. aeruginosa Schwärmen Zeitraffer-Imaging
<ol><li>Bereiten Sie 1 L 5x M8 Mindestmedium in einer Glasflasche vor, indem Sie 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4und 2,5 g NaCl in 500 ml doppeldestilliertem Wasser (ddH2O) hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen auf 1 L mit zusätzlichem ddH2O. Autoklav ein, um flüssige Medien bei Raumtemperatur zu sterilisieren und zu lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml 1 M MgSO4 (Magnesiumsulfat) in einer Glasflasche vor, indem Sie 24,6 g MgSO4•7H2O in 50 ml ddH2O hinzufügen. Passen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit zusätzlichem ddH2O. Autoklav zur Sterilisation an. Bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml 20% Casaminosäuren in einer Glasflasche vor, indem Sie 20 g Casaminosäuren in 50 ml ddH2O hinzufügen. Passen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit zusätzlichem ddH2O. Autoklav enumnieren, um es zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml 20% Glukose in einer Glasflasche vor, indem Sie 20 g Glukose in 50 ml ddH2O hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit zusätzlichem ddH2O. Sterilisieren durch Filtration mit 0,22 m Filter. Bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Um 10 schwärmende Agarplatten herzustellen, fügen Sie 1 g Agar in 100 ml ddH2O hinzu und stellen Sie das Endvolumen auf 160 ml mit zusätzlichem ddH2O in einem 250 ml ErlenmeyerKolben ein. Sterilisieren durch Autoklavieren.<ol>
<li>Unmittelbar nach dem Autoklavieren die Agarlösung 15 min in ein 55 °C-Wasserbad geben.</li>
		<li>Entfernen Sie die Agar-Lösung aus dem Wasserbad und fügen Sie 40 ml 5x M8 minimale Medien, 200 l von 1 M MgSO4, 2 ml 20% Glukose und 5 ml 20% Casaminosäuren15. Fahren Sie unmittelbar nach dem Mischen mit Schritt 1.6 fort. HINWEIS: Die Endkonzentrationen sind 0,5% Agar, 1 mM MgSO4,0,2% Glukose und 0,5% Casaminosäuren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit einer 25 ml Pipette für gleichmäßiges Volumen 20 ml der Schwarmagarlösung pro Petrischale 10 cm Hinzufügen. HINWEIS: Ein festes Volumen der Agarlösung ist wichtig, da das Volumen die Trocknungszeit und den Feuchtigkeitsgehalt des Agars beeinflusst. Vermeiden Sie Blasen, wenn Sie die schwärmenden Agarplatten machen.</li>
	<li>Lassen Sie den Agar erstarren, indem Sie die schwärmenden Agarplatten in einem einzigen Stapel mit Deckeln auf der Bank bei Raumtemperatur auf die Bank legen. Schalten Sie den Luftentfeuchter ein, um die relative Luftfeuchtigkeit des Raumes vor dem nächsten Schritt auf 40–50% 1 h zu verringern.</li>
	<li>Trocknen Sie die schwärmenden Agarplatten für weitere 30 min mit den Deckeln in einer laminaren Durchflusshaube bei 300 ft3/min mit 40–50% relativer Luftfeuchtigkeit bei Raumtemperatur. Trocknen Sie das Innere der Deckel, indem Sie sie nach oben in die laminare Strömungshaube legen. Schwärmende Agarplatten bei 4 °C für bis zu 24 h lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie schwarze 10 cm Petrischalendeckel für die Bildgebung vor, indem Sie die Innenseite des Deckels mit Schleifpapier glätten. Legen Sie die Deckel in eine Verpackungsbox und legen Sie die Verpackung unter eine chemische Haube. Sprühen Sie die Deckel mit schwarzer Sprühfarbe in die Deckel. Lassen Sie die Deckel trocknen. HINWEIS: Schwarze Deckel können für weitere Experimente wiederverwendet werden. Es ist wichtig, dass die Deckel so lackiert sind, dass sie beim Scannen kein Licht reflektieren.</li>
</ol>2. Wachstum von P. aeruginosa und Plating Bedingungen
<ol><li>Bereiten Sie 400 ml Lysogeny-Brühe (LB) vor, indem Sie 10 g LB-Miller-Pulvermischung in 400 ml ddH2O geben. Für 2% LB-Agar Petri-Gerichte, fügen Sie eine zusätzliche 8 g Agar. Autoklav zu sterilisieren.</li>
	<li>20 ml geschmolzenes LB-Agar-Medium in Petrischalen mit 10 cm Durchmesser gießen und bei Raumtemperatur über Nacht erstarren lassen. Flüssigmedien bei Raumtemperatur und Agarplatten bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Streak P. aeruginosa auf einer LB-Agar Petrischale aus einem gefrorenen Vorrat, der bei -80 °C mit sterilen Schlaufen oder Holzstäben gelagert wird. Die Petrischale über Nacht bei 37 °C auf den Kopf stellen. LB-Agar-Platte bis zu 1 Woche bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Petrischale mit einer sterilen Schleife oder Holzstab, impfen Sie es in 2 ml LB Medium, und bebrüten die Kultur zur Sättigung über Nacht (16-18 h) bei 37 °C in einer Walzentrommel bei 100 U/min.</li>
	<li>Pipetten Sie 5 l der Nachtkultur von Schritt 2,4 mit einer P20 Pipette und Spot in der Mitte der schwärmenden Agarplatte, indem Sie sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10–45°) 2,5 cm über dem Sichtbereich nähern, bis zum ersten Stopp pfeifen und den Agar mit nur dem Flüssigkeitstropfen berühren (Abbildung 1B).<ol>
<li>Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da er den Agar beschädigt. Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über verschiedene Schwarm-Agar-Platten zu positionieren (Zusatzabbildung S1).</li>
		<li>Verwenden Sie für herkömmliche Schwarm-Assays nur den Mittelpunkt, und fahren Sie mit Schritt 2.8 fort. Für kollektive Stressreaktion Assays weiterhin Schritt 2.6 (für Phageninfektion) oder Schritt 2.7 (für Antibiotika-Stress).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bei einer Phageninfektion 30 l Nachtkultur von P. aeruginosa ab Schritt 2,4 mit 6 x l von 1 x 1012 pfu/ml Phagen DMS3vir20mischen. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.<ol>
<li>Pipette 6 l des P. aeruginosa-phagenmischung aus Schritt 2.6 mit einer P20 Pipette und Spot an 6 äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 cm Radius konzentrischen Kreis, der an der Petrischale zentriert wird, indem man sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10 bis 45°) 2,5 cm über dem Sichtbereich nähert, bis zum ersten Stopp abpfeifen und den Agar nur mit dem Flüssigkeitstropfen berührt(Abbildung 1C).</li>
		<li>Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da er den Agar beschädigt. Verwenden Sie eine Beschichtungsvorlage für Konsistenz (Ergänzende Abbildung S1). Fahren Sie mit Schritt 2.8 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mischen Sie bei Antibiotika-Behandlungen 30 l Übernachtkultur P. aeruginosa ab Schritt 2,4 mit 6 l mit 3 mg/ml Gentamycin, 10 l mit 100 mg/ml Kanamycin oder 7,5 l mit 100 mg/ml Fosfomycin. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.<ol>
<li>Pipette 6 l von Antibiotika behandelt P. aeruginosa von Schritt 2.7 mit einer P20 Pipette und Punkt an 6 äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 cm Radius konzentrischen Kreis um die Mitte der Schale, indem sie sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10 bis 45°) 2,5 cm über dem Fleckenbereich nähern, bis zum ersten Stopp pfeifen und den Agar mit nur dem Flüssigkeitstropfen berühren (Abbildung 1D).</li>
		<li>Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da er den Agar beschädigt. Verwenden Sie eine Beschichtungsvorlage für Konsistenz (Ergänzende Abbildung S1). Fahren Sie mit Schritt 2.8 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ersetzen Sie die klaren Petrischalendeckel durch schwarze Deckel aus Schritt 1.9 (Abbildung 2A).</li>
	<li>Legen Sie die Schwärme-Agar-Platten auf einen Scanner in einem Inkubator, der bei 37 °C mit einem 10-Liter-Wasserbad eingestellt ist, um die Luftfeuchtigkeit bei 75 % zu halten (Abbildung 1E, Abbildung 2B). VORSICHT: Stören Sie die gefleckten Zellen auf den schwärmenden Agarplatten nicht. Halten Sie Die Platten jederzeit nach oben gerichtet.</li>
</ol>3. Bildaufnahme mit Scanner
<ol><li>Verringern Sie die Umgebungsbeleuchtung der Petri-Schalen, indem Sie schwarzes mattes Gewebe an einem Rack 40–60 cm über dem Flachbett-Dokumentenscanner befestigen. Sichern Sie es mit Zip-Krawatten (Abbildung 2B).</li>
	<li>Der Scanner wird über eine Scansoftware und eine automatische Skriptsoftware gesteuert.<ol>
<li>Wählen Sie in der Scansoftware den Startmodus aus (Abbildung 3A). Erfassen Sie Bilder in Farbe, indem Sie Unter Bildtyp Farbe auswählen. Um die Bildqualität festzulegen, wählen Sie Unter Ziel Die Option Andere aus, und passen Sie die Auflösung auf 300 dpi an. Behalten Sie die Standardgröße für die Bilder bei, indem Sie Original für Zielgrößeauswählen. Lassen Sie alle Optionen unter Bildanpassungen auf Standardbildqualität deaktiviert. HINWEIS: Die Zielgröße ist standardmäßig auf Original festgelegt. Um andere Optionen für die Zielgröße auszuwählen, klicken Sie zuerst auf Vorschau.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie den Speicherpfad von Bildern fest, indem Sie auf das Ordnersymbol rechts neben dem Scan klicken, um die Dateispeichereinstellungen zu öffnen (Abbildung 3A).<ol>
<li>Wählen Sie das Ordnerziel zum Speichern von Bildern aus, indem Sie unter Standort andere auswählen und auf Durchsuchenklicken. Wählen Sie einen Ordner aus, um die Bilder zu speichern.</li>
		<li>Benennen Sie die Bilder im Textfeld Präfix. Legen Sie startnumber 001 fest, um mit der Namenssequenz für die Bilder zu beginnen. Legen Sie das Dateiformat auf JPEG fest, indem Sie JPEG (*.jpg) für Typ unter Bildformat auswählen und auf Optionen klicken, um Detailsanzupassen. Legen Sie die Bildformatqualität fest, indem Sie die Komprimierungsstufe auf 16, die Codierung auf Standard und das Einbetten des ICC-Profilsanpassen. Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen (Abbildung 3B).</li>
		<li>Lassen Sie die erste Option deaktiviert ("Alle Dateien mit demselben Namen überschreiben") und aktivieren Sie die 3 nächsten Optionen ("Dieses Dialogfeld vor dem nächsten Scan anzeigen", "Bildordner nach dem Scannen öffnen" und "Seite hinzufügen nach dem Scannen anzeigen"). Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen</li>
		<li>Überprüfen Sie die Bildqualität, indem Sie auf Vorschauklicken. Das Vorschaufenster wird angezeigt, und das Scan-Symbol wird funktionsfähig (Abbildung 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie die Skriptsoftware, um die Bildaufnahme zu automatisieren. Das bereitgestellte Skript klickt im Scan-Fenster auf Scannen und im Fenster Dateispeichereinstellungen in 30 Min. auf OK.<ol>
<li>Importieren des Skripts durch Klicken auf Aufgabe | Importieren und wählen Sie sowohl Single_scan.tsk als auch Idle_scanning.tsk (TSK-Dateien als Zusatzdateien 1 und 2). Siehe Abbildung 3D. HINWEIS: Single_scan.tsk klickt auf die Schaltfläche Scannen im Scan-Fenster und OK im Fenster Dateispeichern. Idle_scanning.tsk aktiviert Single_scan.tsk alle 30 Min. Man kann die Scan-Frequenz ändern, indem man die Aktivierung von Idle_scanning.tsk.</li>
		<li>Aktivieren Sie das automatische Scannen in 30 Minuten Intervallen, indem Sie sowohl den Leerlaufscan (importiert) als auch den Einzelscan (importiert)auswählen, mit der rechten Maustaste auf Idle scanning (importiert)klicken und mit der linken Maustaste auf Aktiviert klicken (Abbildung 3D, Zusatzabbildung S2). HINWEIS: Das automatische Scannen wird ausgeführt, bis der Benutzer das Skript manuell stoppt. Um das Skript zu beenden, wählen Sie Leerlaufscannen (importiert),rechts klicken Sie auf Leerlaufscannen (importiert), und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Aktiviert. Das Häkchen wird entfernt.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kompilieren von Zeitrafferbildern und Messen der Schwarmabstoßung
<ol><li>Führen Sie Filmbearbeitung und Bildanalyse mit ImageJ durch.</li>
	<li>Importieren Sie alle gescannten Bilder in ImageJ, indem Sie auf Datei | Import | Bildsequenz und wählen Sie die Bilder aus. Aktivieren Sie im Fenster Sequenzoptionen die Option In RGB konvertieren, um Bilder in Farbe zu halten. Die Anzahl der Bilder gibt die Anzahl der ausgewählten Bilder an.</li>
	<li>Halten Sie das Startbild bei 1, um mit dem ersten Bild im Ordner zu beginnen, und skalieren Sie Bilder auf 100 %, um die Originalgröße der Bilder zu erhalten. Lassen Sie den virtuellen Stapel verwenden deaktiviert. Klicken Sie auf OK, und warten Sie, bis bilder geladen werden (Abbildung 4A).</li>
	<li>Legen Sie die Videokomprimierungsstufe auf 100 fest, indem Sie auf Bearbeiten | Optionen | Eingang/Ausgang... und passen Sie die JPEG-Qualität auf 100 an.</li>
	<li>Speichern Sie die Datei als .avi, indem Sie auf Datei | Speichern als | AVI. Anpassen der Komprimierung auf JPEG und Bildrate auf 5 fps (Abbildung 4B). Speichern Sie den .avi-Zeitraffer im gewünschten Ordner.</li>
	<li>Um Schwarmabstoßungsentfernungen zu quantifizieren, öffnen Sie ein Bild am Ende der Schwarmperiode in ImageJ. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie das Bild, und wählen Sie es aus. Passen Sie die Skala an, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Skalierung fest und legen Sie Den Abstand in Pixel auf 118, Den bekannten Abstand auf 1, das Pixel-Seitenverhältnis auf 1,0 und die Längeneinheit auf cm fest (Abbildung 4C). Lassen Sie Global ungeprüft. Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Symbol Gerade und messen Sie von der Mitte der Kolonie an der Satellitenposition bis zum Rand der schwärmenden Population. Analysieren auswählen | Messen, damit ein neues Fenster mit den Maßen (Länge) angezeigt wird (Abbildung 4D). HINWEIS: Verwenden Sie "+", um näher und "-" zu zoomen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Minimierung der Variabilität in Schwärmen von Agarplatten und die Bereitstellung einer einfachen und kostengünstigen Methode, um Zeitrafferbilder von P. aeruginosa zu erfassen, die schwärmen und auf Stress reagieren. Dieses Verfahren kann durch Anpassung der Medienzusammensetzung und der Wachstumsbedingungen auf andere Bakterielle Systeme erweitert werden. Für P. aeruginosa, obwohl M9 oder FAB minimales Medium verwendet werden kann, um Schwärme<sup class="xref"...

Schwärmen ist eine kollektive Form der koordinierten bakteriellen Beweglichkeit, die Antibiotikaresistenz und Produktion von Virulenzfaktoren im Wirt1,2,3erhöht. Dieses multizelluläre Verhalten tritt auf halbfesten Oberflächen auf, die denen von Schleimschichten ähneln, die Epithelmembranen in der Lungeabdecken 4,5. Biosurfactants werden üblicherweise von Schwärmepopulationen produziert, um die Oberflächenspannung auf Oberflächen zu überwinden, und die Produktion dieser stoffe wird durch komplexe Zell-Zell-Signalsysteme reguliert, auch bekannt als Quorum-Sensing6,7,8. Viele Arten von Bakterien sind in der Lage zu schwärmen, einschließlich Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, und Escherichia coli9,10,11,12. Die von Bakterien erzeugten Schwarmmuster sind vielfältig und werden durch die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Oberflächenschicht beeinflusst, einschließlich Nährstoffzusammensetzung, Porosität und Feuchtigkeit13,14. Neben den Oberflächeneigenschaften beeinflussen Wachstumstemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit verschiedene Aspekte der Schwärmedynamik, einschließlich Schwarmrate und Muster12,13,14,15. Die Wachstumsvariablen, die das Schwärmen beeinflussen, schaffen Herausforderungen, die sich auf die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Fähigkeit zur Interpretation von Ergebnissen auswirken. Hier beschreiben wir eine einfache standardisierte Methode, um die Dynamik von Bakterienschwärmen durch Zeitraffer-Bildgebung zu überwachen. Die Methode beschreibt, wie kritische Wachstumsbedingungen gesteuert werden können, die das Fortschreiten des Schwärmens erheblich beeinflussen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Schwarmanalyse ermöglicht diese Zeitraffer-Bildgebungsmethode die gleichzeitige Verfolgung der Beweglichkeit mehrerer Schwärme während längerer Zeiträume und mit hoher Auflösung. Diese Aspekte verbessern die Tiefe der Daten, die durch die Überwachung von Schwärmen gewonnen werden können, und erleichtern die Identifizierung von Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen.
Das Schwärmen in P. aeruginosa wird durch die Herstellung und Freisetzung von Rhamnolipiden und 3-(3-Hydroxyalkanoyloxy)alkanoic Säuren in die Umgebung 66,16erleichtert. Die Einführung von Stress aus subtödlichen Konzentrationen von Antibiotika oder Infektionen durch Phagenviren wirkt sich auf die Organisation von Schwärmen aus. Insbesondere veranlassen diese Spannungen P. aeruginosa, das Quorum-Sensing-Molekül 2-Heptyl-3-hydroxy-4-chinolon, auch bekannt als Pseudomonas-Chinolonsignal (PQS)17,18,freizusetzen. In Schwarm-Assays, die zwei Populationen von Schwärmen enthalten, wehrt PQS, die von der stressinduzierten Population produziert werden, unbehandelte Schwärme ab, die in das Gebiet eindringen, das den Stress enthält (Abbildung 1). Diese kollektive Stressreaktion stellt ein Gefahrenkommunikationssignalsystem dar, das P. aeruginosa vor nahegelegenen Bedrohungen warnt18,19. Die Auswirkungen von Stress auf P. aeruginosa, die Aktivierung der kollektiven Stressreaktion und die Abstoßung von Schwärmen können mit der hier beschriebenen Zeitraffer-Bildgebungsmethode visualisiert werden. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie: (1) Agarplatten für schwärmen, (2) Kultur P. aeruginosa für zwei Arten von Assays (traditionelle Schwarm-Assays oder kollektive Stressreaktions-Assays) (Abbildung 1), (3) Zeitrafferbilder erfassen und (4) ImageJ zum Kompilieren und Analysieren der Bilder verwenden.
Kurz gesagt, P. aeruginosa aus einer Nachtkultur wird in der Mitte einer schwärmenden Agarplatte gesichtet, während P. aeruginosa, die mit Phagen infiziert oder mit Antibiotika behandelt werden, an den Satellitenpositionen gesichtet werden. Das Fortschreiten des P. aeruginosa-Schwarms wird auf einem Verbraucherdokument-Flachbettscanner überwacht, der in einem feuchtigkeitsregulierten 37 °C-Inkubator platziert wird. Der Scanner wird von einer Software gesteuert, die die Platten in regelmäßigen Abständen über die Schwarmwachstumsphase, in der Regel 16 bis 20 H, automatisch scannt. Diese Methode liefert gleichzeitige Zeitraffervideos von bis zu sechs 10 cm Schwarmplatten. Die Bilder werden in Filmen zusammengestellt und die Abstoßung von Schwärmen durch stressinduzierte Populationen wird mit frei verfügbarer ImageJ-Software quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit wird der Gewährleistung der Konsistenz und Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Schwarmexperimenten gewidmet.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar, dehydriert</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td>Für LB-Agarplatte und Schwarmagarplatte</td></tr><tr><td>Casaminosäuren</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>Für Schwarmmedien</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose. Für Schwarmmedien</td></tr><tr><td>Fosfomycin-Dinatriumsalz</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>F0889</td><td>Stammkonzentration: 200 mg/ml. Gelöst in ddH2O</td></tr><tr><td>Gentamycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>Stammkonzentration: 3 mg/ml. Gelöst in ddH2O</td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Stammkonzentration: 100 mg/ml. Gelöst in ddH2O</td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Für LB-Bouillon und LB-Agarplatten</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Für Schwarmmedien</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Für 5x M8 Medien</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Für 5x M8 Medien</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Fisher</td><td>Chemical S373</td><td>Für 5x M8 media</td></tr><tr><td>Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS27E.118</td><td>PA14 Stamm</td></tr><tr><td>DMS3vir</td><td>O'Toole lab</td><td>DMS3vir20</td><td>Bakteriophagen</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumoxid-Schleifpapier</td><td>3M</td><td>150 Fein</td><td>Für schwarze Deckel</td></tr><tr><td>Schwarzer Stoff</td><td>Joann</td><td>PRD7089</td><td>Schwarzer Stoff</td></tr><tr><td>Schwarze Sprühfarbe</td><td>Krylon</td><td>5592 Matt Schwarz</td><td>Für schwarze Deckel</td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben</td><td>Kimax</td><td>26500</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Glasvorratsflaschen</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1.000 mL</td></tr><tr><td>8 Zoll Kabelbinder</td><td>Gardner Bender</td><td>E173770</td><td>Zum Anbringen von Petrischalen aus schwarzem mattem Stoff</td></tr><tr><td>(100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 mm x 15 mm Polystyrolplatten</td></tr><tr><td>Holzstäbchen</td><td>Fisher</td><td>23-400-102</td><td>Zum Streifen und Impfen von Bakterien</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Markt Forge Industries</td><td>STM-E</td><td>Zum Sterilisieren von Reagenzien</td></tr><tr><td>25 mL Pipette</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1072-5410</td><td>Zum Pipettieren von 20 mL zum Schwärmen von Agarplatten</td></tr><tr><td>Luftentfeuchter</td><td>Frigidaire</td><td>FAD704DWD 70 Pint</td><td>Zur Aufrechterhaltung der relativen Luftfeuchtigkeit im Raum bei ca. 45%</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.52a</td><td>Software zur Bildanalyse</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Für das Wachstum von Bakterien bei 37 > C</td></tr><tr><td>Isotemp Wasserbad</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Zum Kühlen von Medien bis 55°; C</td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td>The Baker Company</td><td>SG603A</td><td>Zum Trocknen von Platten</td></tr><tr><td>P-20 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>Spotting auf schwärmenden Agarplatten</td></tr><tr><td>Pipette Controller</td><td>BrandTech</td><td>accu-jet</td><td>Zum Pipettieren von 20 mL für schwärmende Agarplatten</td></tr><tr><td>Roller Drum</td><td>New Brunswick</td><td>TC-7</td><td>Für das Wachstum von Bakterien bei 100 U/min</td></tr><tr><td>Scanner</td><td>Epson</td><td>Epson Perfection V370 Fotoscanner</td><td>für Speicherfolien</td></tr><tr><td>Scanner-Automatisierungssoftware</td><td>RoboTask Lite</td><td>v7.0.1.932</td><td>Für 30 min interne Bildgebung</td></tr><tr><td>Scanner Bilderfassungssoftware</td><td>Epson</td><td>v9.9.2.5US</td><td>Software für Speicherfolien</td></tr></tbody></table>

zeitraffer-bildgebung von bakterienschwärmen und kollektive stressreaktion

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Schwärmen ist eine Form der Oberflächenbeweglichkeit, die bei vielen Bakterienarten wie Pseudomonas aeruginosa und Escherichia colibeobachtet wird. Hier bewegen sich dichte Bakterienpopulationen im Laufe der Stunden über große Entfernungen in charakteristischen rankenförmigen Gemeinschaften. Das Schwärmen ist empfindlich gegenüber mehreren Faktoren, einschließlich mittlerer Feuchtigkeit, Feuchtigkeit und Nährstoffgehalt. Darüber hinaus wehrt die kollektive Stressreaktion, die bei P. aeruginosa beobachtet wird, die durch Antibiotika oder Bakteriophagen (Phagen) gestresst sind, Schwärme ab, sich dem Bereich zu nähern, der den Stress enthält. Die hier beschriebenen Methoden befassen sich mit der Kontrolle der kritischen Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen. Wir führen eine einfache Methode ein, um die Schwärmedynamik und die kollektive Stressreaktion mit hoher zeitlicher Auflösung mit einem Flachbett-Dokumentenscanner zu überwachen und zu beschreiben, wie eine quantitative Analyse von Schwärmen kompiliert und durchgeführt wird. Diese einfache und kostengünstige Methode ermöglicht eine präzise und gut kontrollierte Quantifizierung des Schwarms und kann auf andere Arten von plattenbasierten Wachstumstests und Bakterienarten ausgedehnt werden.

Die Schritte zum Wachstum von P. aeruginosa, Stress die Zellen, und Bild die Schwarm Agar Platten sind in Abbildung 1dargestellt . Wir haben eine einzige Kolonie von Wild-Typ P. aeruginosa UCBPP-PA14-Stamm von einer LB-Agar-Platte in 2 ml LB-Brühe über Nacht bei 37 °C geimpft und 5 l in der Mitte der schwärmenden Agarplatte gesichtet. Die Zeitraffer-Bildgebung dieser Platte zeigt das anfängliche Wachstum in Form einer Kolonie in der Mitte und dann die Ausbreitung der Ranken radial aus d...

Wir beschreiben eine einfache Methode, um hochauflösende Zeitrafferfilme von Pseudomonas aeruginosa Schwärmen zu produzieren, die mit einem Flachbett-Dokumentenscanner auf Bakteriophage (Phagen) und Antibiotikastress reagieren. Dieses Verfahren ist eine schnelle und einfache Methode zur Überwachung der Schwärmedynamik und kann angepasst werden, um die Beweglichkeit und das Wachstum anderer Bakterienarten zu untersuchen.

Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zeitrafferfilme von Pseudomonas aeruginosa Schwärmen zu produzieren und die Abstoßung von Schwarm durch Bakteriophage oder Antibiotika zu erfassen. Die Zeitrafferfilme erfassen die detaillierte Dynamik der Schwärmereaktion auf Antibiotika und Bakteriophagen und die Technik erfordert nur einen Luftentfeuchter, Computer, Inkubator und Dokumentenscanner. Um Schwärme-Agar-Platten für p.aeruginosa Schwärmezeitraffer-Bildgebung vorzubereiten, verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um jeder experimentellen Petrischale mit 10 ZentimeterDurchmesser 20 Milliliter Schwarmagarlösung hinzuzufügen.Legen Sie die Platten in einem einzigen Stapel mit Deckeln für eine Stunde bei Raumtemperatur. Schalten Sie einen Luftentfeuchter ein, um die relative Luftfeuchtigkeit des Raumes auf 40-50% zu verringern Wenn der Agar erstarrt ist, trocknen Sie die schwärmenden Agarplatten für weitere 30 Minuten in einer laminaren Durchflusshaube mit den Deckeln aus und stellen Sie sich bei 300 Kubikfuß pro Minute mit einer 40-50% relativen Luftfeuchtigkeit bei Raumtemperatur. Dann die getrockneten Schwarm-Agar-Teller bei vier Grad Celsius bis zu 24 Stunden lagern.Zum Schwärmen von Agar-Beschichtung eine P20-Pipettespitze, beladen mit fünf Mikrolitern aus einer über Nacht P.aeruginosa Kultur, in einem 10-45-Grad-Winkel 2-1/2 Zentimeter über der Mitte einer Schwarmplatte und drücken Sie den Kolben bis zum ersten Stopp, um den Agar mit nur dem Flüssigkeitstropfen zu berühren. Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über die verschiedenen Schwarm-Agarplatten zu positionieren. Um eine Phageninfektion zu melden, mischen Sie zunächst 30 Mikroliter p.aeruginosa mit sechs Mikrolitern von einem mal 10 zu den 12 Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter Phagen DMS3 vir und fügen Sie sofort sechs Mikroliter des P.aeruginosa P.aeruginosa-Phagengemischs an sechs äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 Zentimeter Radius konzentrischen Kreis hinzu, wie gezeigt.Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über verschiedene Schwarm-Agarplatten zu positionieren. Um Antibiotika-Behandlungen zu verankern, mischen Sie 30 Mikroliter von über Nacht kultivierten P.aeruginosa mit der entsprechenden Konzentration und Volumen des Antibiotikums von Interesse und fügen Sie sofort sechs Mikroliter der antibiotikabehandelten Bakterien an sechs äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 Zentimeter Radius konzentrischen Kreis um die Mitte der Schale hinzu. Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über die verschiedenen Schwarm-Agarplatten zu positionieren.Wenn alle Kulturen plattiert sind, ersetzen Sie die klaren Petrischalendeckel durch maßgefertigte schwarze Deckel. Legen Sie die schwärmenden Agarplatten vorsichtig auf einen Scanner in einem Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, mit einem 10-Liter-Wasserbad, um die Luftfeuchtigkeit bei 75% zu halten Nachdem Sie die Platten in den Scanner gelegt haben, öffnen Sie die Datei und speichern Sie die Einstellungen, um den Speicherpfad für die Bilder einzustellen und im 30-Minuten-Takt auf Scannen und OK zu klicken. Um die Bildaufnahme zu automatisieren, verwenden Sie die Skriptsoftware.Wählen Sie sowohl Leerlauf-Scannen als auch Einzelscan und Rechtsklick auf den Leerlauf-Scan, und klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf aktiviert. Importieren Sie am Ende der Inkubation alle gescannten Bilder in ImageJ. Im Fenster Sequenzoptionen gibt die Anzahl der Bilder die Anzahl der ausgewählten Bilder an.Starten Sie das Bild an einem, um mit dem ersten Bild im Ordner und den Maßstabsbildern bei 100 % zu beginnen, um die ursprüngliche Größe der Bilder zu erhalten. Klicken Sie auf verdeckt auf RGB, um die Bilder in Farbe zu halten. Lassen Sie den virtuellen Stapel deaktiviert und klicken Sie auf OK, um die Bilder zu laden.Klicken Sie auf Datei, speichern Sie als und AVI, um die Bilder in einer AVI-Datei zusammenzuführen. Passen Sie die Komprimierung auf JPEG und die Bildrate auf fünf Bilder pro Sekunde an. Speichern Sie dann den AVI-Zeitraffer im entsprechenden Speicherordner.Die Zeitraffer-Bildgebung einer einzigen Kolonie von Wild-Typ P.aeruginosa von einer LB-Agarplatte in LB-Brühe über Nacht bei 37 Grad Celsius und in der Mitte einer schwärmenden Agarplatte gesichtet zeigt ein erstes Wachstum in Form einer Kolonie in der Mitte der Platte, die sich in Ranken radial aus der Kolonie ausbreitet. Schwärme bewegen sich von der Mitte der schwärmenden Agarplatten in die Peripherie und werden durch ein Stresssignal abgewehrt, das von den Bakterien emittiert wird, die mit Phagen infiziert oder mit Gentamycin behandelt wurden. Phages oder Gentamycin, die allein an den Satellitenpositionen gesichtet werden, führen nicht dazu, dass Schwärmepopulationen diese Gebiete meiden.Verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um sicherzustellen, dass die schwärmenden Agarplatten genau 20 Milliliter enthalten. Es ist auch wichtig, die Plattentrocknungszeit an die Laborumgebung anzupassen. Unsere Technik ermöglicht es uns, die allgemeinen Schwarmmuster von Pseudomonas aeruginosa Populationen zu visualisieren.Das nächste Ziel ist die Überwachung der individuellen Zellmotilität mit Brightfield-Mikroskopie.

time-lapse-imaging-bacterial-swarms-collective-stress

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Recording Multizelluläre Behavior in Myxococcus xanthus Biofilme mit Zeitraffer-Microcinematography

Quelle: Bru, J., et al., Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Analyse des Schwarmverhaltens von Pseudomonas aeruginosa , indem das Bakterienwachstum von einer zentralen Kultur zu Satellitenspots beobachtet wird, die dieselbe Kultur mit einem Antibiotikum mischen, unter Verwendung eines Agarplatten-Setups und Zeitraffer-Bildgebung.

Schwarmverhalten von Pseudomonas aeruginosa unter Antibiotikabelastung

Quelle: Bru, J., et.al. Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und der kollektiven Stressreaktion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt, wie das Schwarmvermeidungsverhalten bei Pseudomonas aeruginosa mit Hilfe eines Schwarmagarplatten-Assays visualisiert und gemessen werden kann. Es zeigt den Aufbau für die Zeitraffer-Bildgebung unter kontrollierten Bedingungen und erklärt, wie Antibiotika-induzierte Stresssignale die Bewegung von Bakterien umleiten, was durch Bildanalyse quantifiziert...

Bildgebung und Quantifizierung von Schwarmvermeidungsreaktionen auf Antibiotikastress bei Pseudomonas aeruginosa

Quelle: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt einen Schwarm-Assay mit Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, um die Oberflächenmotilität auf weichem Agar zu beobachten. Die Zeitraffer-Bildgebung erfasst die koordinierte Expansion und Rankenbildung und hebt die bakterielle Oberflächenmotilität hervor.

Schwarm-Assay zur Visualisierung der bakteriellen Oberflächenmotilität

Quelle: Cayron, J., et al. Multiskalige Analyse des Bakterienwachstums unter Stressbehandlungen. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt, wie eine mikrofluidische Platte für die Abbildung von Bakterienzellen unter Stressbedingungen vorbereitet und verwendet wird. Es wird der Prozess der Einführung einer Bakterienkultur und eines stressinduzierenden antibiotischen Mediums beschrieben, gefolgt von der Zellbeladung und dem mikroskopischen Aufbau. Mit Hilfe der Zeitraffer-Bildgebung im...

Mikroskopische Analyse des Bakterienwachstums unter Stress mit Hilfe von mikrofluidischen Kammern

Quelle: Guo, S., et al. Quantifizierung der Motilität des bakteriellen Oberflächenschwarms auf Induktorgradientenplatten. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die Verwendung einer doppellagigen Gradientenschwarmplatte, um das Schwarmverhalten von Bakterien unter unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen zu untersuchen. Eine Platte mit einem gradientenbildenden Inhibitor in der unteren Schicht wird mit Bakterien beimpft und inkubiert. In regelmäßigen Abständen werden Bilder aufgenommen, um...

Beurteilung des Bakterienschwarms mit einer Gradientenhemmerplatte

ScanLag ist eine Hochdurchsatzmethode zur Messung der Wachstumsverzögerung, d. h. der Verzögerungszeit, sowie der Wachstumsrate von Kolonien für Tausende von Zellen parallel. Das Screening mit ScanLag ermöglicht die Unterscheidung zwischen langer Verzögerungszeit und langsamem Wachstum auf der Ebene einer einzelnen Variante.

ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit

Dieses Protokoll ermöglicht eine zeitaufgelöste Beschreibung des bakteriellen Wachstums unter Stressbedingungen auf der Einzelzell- und Zellpopulationsebene.

Mehrskalenanalyse des Bakterienwachstums unter Stressbehandlungen

Hefewachstumsphänotypen werden präzise durch hochparallele Zeitraffer-Bildgebung von immobilisierten Zellen gemessen, die zu Mikrokolonien heranwachsen. Gleichzeitig können Stresstoleranz, Proteinexpression und Proteinlokalisierung überwacht werden, wodurch integrierte Datensätze generiert werden, um zu untersuchen, wie ökologische und genetische Unterschiede sowie die Genexpressionsheterogenität unter isogenen Zellen das Wachstum modulieren.

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Beurteilung des Überlebens von Antibiotika für Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus zur Verfügung, indem wir Plasmide in P. aeruginosa und S. aureus transformieren, um Reporterstämme zu erzeugen und phänotypische Varianten, wie z.B. Persistere, durch Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen.

Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie: Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus : Heterogene Phänotypen

Lernen Sie eine einfache Methode zur Zeitraffer-Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa-Schwärmen unter Phagen- und Antibiotikastress. Diese kostengünstige Technik ermöglicht Echtzeit-Monitoring bakterieller Bewegungsdynamik.

Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion

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