Name: Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung mehrschichtiger GelMA-Bioinks zur Verhinderung von Zellsedimentation im 3D-Bioprinting. Diese Methode ermöglicht homogene Zellverteilung für Gewebeengineering und regenerative Medizin.

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Die Autoren würdigen Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 und 81570422), National Key F&E-Programm chinas (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) und Shanghai Municipal Education Commission (Innovationsprogramm 2017-01-07-00-07-E00027).

1. Vorbereitung von zellbeladenem SF-GelMA
<ol><li>Sterilisieren Sie alle Materialien mit 0,22 m Spritzenfiltereinheiten. Führen Sie alle Schritte in einem biologischen Sicherheitsschrank aus.</li>
	<li>1x PBS auf 50 °C erwärmen und Gelatine in der erhitzten 1x PBS unter Rühren auflösen. Die Endkonzentration von Gelatine in PBS sollte 10% (w/v) betragen.</li>
	<li>Methacrylanhydrid unter Rühren langsam in die Gelatinelösung (Gewichtsverhältnis von Methacrylanhydrid zu Gelatine von 0,6 bis 1) geben und den Komplex mindestens 1 h (50 °C) mischen. In der Regel bereiten Sie 200 ml 10% Gelatinelösung mit 12 g Methacrylanhydrid; das Volumen hängt von den Bedürfnissen der Studie ab.</li>
	<li>Die gemischte Lösung mit Gelatine und Methacrylanhydrid in ein 50 ml steriles Rohr geben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Mischlösung bei 3.500 x g. Es dauert in der Regel 3-5 min, um zwei Schichten zu erhalten. Sammeln Sie die obere Schicht (GelMA) und entsorgen Sie die untere Schicht (unreagiertemethacrylanhydrid).</li>
	<li>Verdünnen Sie die in Schritt 1.5 erhaltene Lösung der oberen Schicht mit zwei Volumen entionisiertem Wasser (40 bis 50 °C).</li>
	<li>Dialyse die in Schritt 1.6 erhaltene Lösung mit einer 12-14 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Dialysemembran gegen entionisiertes Wasser für 5 bis 7 Tage (40 bis 50 °C). Wechseln Sie das Wasser zweimal täglich.</li>
	<li>Sammeln und einfrieren Sie die GelMA-Lösung bei 80 °C über Nacht.</li>
	<li>Lyophilisieren Sie die GelMA-Lösung für 3 bis 5 Tage in einem Gefriertrockner mit einer Temperatur von -45 °C und einem Druck von 0,2 mbar.</li>
	<li>Lösen Sie das lyophilisierte GelMA (Substitutionsgrad von ca. 75%) in 1x PBS mit 10% FBS (fetales Rinderserum, v/v), 25 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-Ethan-Sulfonsäure) und Photoinitiator (0,5%, w/v), um das GelMA-Bioinkpräparat zu erhalten. HINWEIS: Der Grad der Substitution von GelMA kann durch einen Ninhydrin-Assay3berechnet werden.</li>
	<li>Mischen Sie die GelMA-Lösung (10%, w/v) mit unterschiedlichen Volumina der anfänglichen SF-Lösung (5%, w/v) und verschiedenen Volumina von 1x PBS, um SF-GelMA-Bioinks mit unterschiedlichen SF-Konzentrationen zu erhalten. Der Anteil pro 1 ml GelMA- und SF-Lösung in den verschiedenen Bioinks ist in Tabelle 1dargestellt. HINWEIS: Alle Biotinten müssen eine Endkonzentration von 5% (w/v) GelMA enthalten, aber die Konzentration von SF variiert: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 und 1,5% (w/v) in den verschiedenen SF-GelMA-Biotinten. Verwenden Sie SF-M-Layered-GelMA, um den mit SF modifizierten GelMA-Bioink Schicht für Schicht zu bezeichnen. Verwenden Sie SF-X-GelMA, um die mit SF modifizierten GelMA homogen zu bezeichnen (z. B. wurde GelMA mit Modifikation von 1% SF als SF-1-GelMA bezeichnet).</li>
	<li>Beschallen Sie alle Bioinks für 10-20 min.</li>
	<li>Wachsen Sie NIH3T3-Zellen mit DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium), das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator enthält (37 °C mit 5%CO2). Durchfahrt der Zellen im Verhältnis 1:3, wenn die Dichte 80% erreicht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Suspension von NIH3T3-Zellen bei 1500 U/min für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit Absaugung und setzen Sie das Zellpellet mit frischer Bioinklösung in einem 15 ml sterilen Rohr wieder auf. HINWEIS: Die Konzentration der gekapselten Zellen im Bioink sollte 1 x 106 Zellen/ml betragen, und die Konzentration muss mit einem Zytometer berechnet werden.</li>
	<li>Verwenden Sie 2 ml verschiedene SF-GelMA Bioinks, um die Zellpellets aufzuhängen, um verschiedene zellbeladene Bioinks zu erhalten.</li>
</ol>2. Laden, Aufheizen und Bioprinting des SF-M-Layered-GelMA
<ol><li>0,4 ml zellbeladenes SF-0.5-GelMA in die untere Schicht der Spritze geben. HINWEIS: Verwenden Sie in dieser Studie eine 2 ml Spritze als Bioinkreservoir. Legen Sie verschiedene SF-GelMA-Bioinks Schicht für Schicht in die Spritze.</li>
	<li>Legen Sie die Spritze in ein Eiswasserbad (0 °C) für 5 min, damit sich der Bioink der Bodenschicht in einen Gelzustand verwandelt.</li>
	<li>0,4 ml zellbeladenen SF-0.75-GelMA-Bioinks über die untere Schicht laden.</li>
	<li>Legen Sie die Spritze mit den beiden Schichten Von Bioinks in einem Eiswasserbad (0 °C) für 5 min, um die beiden Schichten von Bioinks in einen Gelzustand zu verwandeln.</li>
	<li>Fahren Sie die Lade- und Kühlschritte noch 3 Mal mit den restlichen 3 Arten von Biotinten (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) um ein mehrschichtiges Bioinksystem mit unterschiedlichen SF-Konzentrationen in den verschiedenen Schichten zu erhalten. Das Volumen, das für die Beladung aller Bioinks verwendet wird, sollte 0,4 ml betragen.</li>
	<li>Erhitzen Sie den mehrschichtigen Bioink, indem Sie die Spritze 30 min vor dem Bioprinting in einen Inkubator (37 °C) geben.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 2 ml Spritze als Bioinkreservoir mit einer 27 G Druckdüse. Stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 50 l/min, die Bewegungsgeschwindigkeit der Düse auf 2 mm/s und die Düsenhöhe auf 1 mm. Führen Sie den Bioprinting-Vorgang bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) durch.<ol>
<li>Drucken Sie das Gewebekonstrukt extrusionsfrei mit einem maßgeschneiderten Bioprinter unter den Parametern, die aus unseren früheren Studien11,12angepasst wurden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie ultraviolettes Licht (365 nm, 800 mW) für 40 s, um das biogedruckte Gewebekonstrukt zu vernetzen.</li>
	<li>Kultur das vernetzte Gewebekonstrukt in DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium), das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator enthält (37 °C mit 5%CO2). Das Medium wurde in den ersten 2 Tagen alle 8 stunden und danach alle 2-3 Tage gewechselt.</li>
</ol>

<ol><li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li>
<li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting%3A+from+benches+to+translational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510(2019).</li>
<li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization%2C+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li>
<li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li>
<li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioink+properties+before%2C+during+and+after+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).</li>
<li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li>
<li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li>
<li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li>
<li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).</li>
<li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Stabilität des mehrschichtigen Systems ist ein wichtiger Punkt, um dieses Protokoll erfolgreich auszuführen. Theoretisch berechneten wir die Diffusion von SF-Molekülen in der GelMA-Lösung auf Basis von Naumans Studie13. Es wurde festgestellt, dass die Diffusion von Proteinen in Lösung mit ihrem Molekulargewicht zusammenhängt. Das durchschnittliche Molekulargewicht (MW) des Rinderserumalbumins (BSA) beträgt 66,5 kDa und sein Diffusionskoeffizient liegt bei 64-72 m2/s. Der durchschnit...

Der dreidimensionale (3D) Bioprinting war eine vielversprechende Methode zur Herstellung komplexer architektonischer und funktioneller Nachbildungen von nativen Geweben in der Biofabrikation und regenerativen Medizin1,2,3. Die gängigen Strategien des Bioprintings, einschließlich Inkjet-, Extrusions- und Stereolithographiedruck, haben Vor- und Nachteile aus verschiedenen Perspektiven4. Unter diesen Techniken wird das Extrusionsverfahren aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit am häufigsten verwendet. Bioink spielt eine Schlüsselrolle bei der Prozessstabilität des Extrusionsbioprintings. Der ideale zellbeladene Bioink sollte nicht nur biokompatibel, sondern auch für mechanischeEigenschaften5 geeignet sein. Bioinks mit niedriger Viskosität werden in der Regel als flüssigkeitsähnlicher Zustand dargestellt. Diese Bioinks können einfach und schnell abgelagert werden und zellmembranbedingte Schäden vermeiden, die durch hohe Scherspannung während der Extrusion verursacht werden. In komplexen Fällen, die langfristige Druckzeiten erfordern, führt jedoch eine niedrige Viskosität häufig zur unvermeidlichen Sedimentation der verkapselten Zellen im Bioinkreservoir, die in der Regel durch die Schwerkraft angetrieben wird und zu einer inhomogenen Zelldispersion im Bioinkführt 6,7. Folglich behindert ein Bioink mit inhomogener Zelldispergität den In-vitro-Bioprinting eines funktionellen Gewebekonstrukts.
Mehrere neuere Studien, die sich auf Bioinks konzentrieren, haben die Förderung der homogenen Dispergität von verkapselten Zellen berichtet. Für den Extrusionsbioprinting8wurde ein modifizierter Alginatbioink auf Basis einer zweistufigen Vernetzung verwendet. Ein Alginatpolymer wurde in dieser Studie mit Peptiden und Proteinen modifiziert. Zellen zeigten eine homogenere Verteilung in diesem modifizierten Alginat als in dem häufig verwendeten Alginat aufgrund der Anbaustellen, die von den Peptiden und den Proteinen bereitgestellt werden. Alternativ wurden gemischte Bioinks verwendet, um die Sedimentation von Zellen in Bioink zu lösen. In einer weiteren Studie wurde ein gemischter Bioink mit Polyethylenglykol (PEG) und Gelatine- oder Gelatinemethacryloyl (GelMA) mit verbesserter mechanischer Robustheit verwendet9. Die gekapselten Zellen zeigten eine homogene Verteilung vor allem, weil die Viskosität des gemischten Bioinks verbessert wurde. Im Allgemeinen gibt es mehrere Faktoren, die die Dispergität der verkapselten Zellen im Bioink beeinflussen, wie die Viskosität des Bioinks, die Schwerkraft der Zellen, die Dichte der Zellen und die Dauer der Arbeitszeit. Unter diesen Faktoren spielt die Schwerkraft von Zellen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Sedimentation. Der Auftrieb und die Reibung, die der zähflüssige Bioink bietet, wurden bisher als Hauptkräfte gegen die Schwerkraft untersucht10.
Hierbei haben wir eine neuartige Strategie entwickelt, um die homogene Dispergität der verkapselten Zellen in Bioink zu fördern, indem wir mehrere flüssige Schnittstellen im Bioink-Reservoir manipulieren. Diese flüssigen Schnittstellen, die durch die vielschichtige Modifikation des Bioinks entstehen, können nicht nur grenzflächenretentionsfähig sein, was die Sedimentation von Zellen verzögert, sondern auch eine geeignete Biokompatibilität und rheologisches Verhalten des Bioinks aufrechterhalten. In der Praxis haben wir die wässrige GelMA-Lösung (5%, w/v) mit Seidenfibroin (SF) in vielschichtiger Weise modifiziert, um längs vier Schnittstellen zu erzeugen, die Grenzflächenspannungen im gemischten Bioink erzeugen. Dadurch wurde die Schwerkraftbelastung der Zellen durch die vom Menschen hergestellte Grenzflächenspannung kompensiert, und eine nahezu homogene Dispersion der verkapselten Zellen im Bioink wurde durch weniger Sedimentation über die angrenzenden Zellschichten hinweg erzielt. Bisher wurde kein ähnliches Protokoll zur Verlangsamung der Sedimentation von verkapselten Zellen durch Manipulation der Grenzflächenretention in flüssigen Bioinks berichtet. Wir stellen hier unser Protokoll vor, um eine neue Möglichkeit zur Lösung der Zellsedimentation im Bioprinting aufzuzeigen.

<table><tbody><tr><td>2-Hydroxy-4&prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon (PI2959)</td><td>TCI</td><td>M64BK-QD</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10091</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900863MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Methacrylanhydrid (MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; Streptomycin-Antibiotika</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Seidenfibroin</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5154</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von mehrschichtigem hydrogel bioink im dreidimensionalen bioprinting für homogene zellverteilung

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Während des extrusionsbasierten dreidimensionalen Bioprinting-Prozesses können flüssigkeitsähnliche Bioinken mit geringer Viskosität Zellen vor Membranschäden schützen, die durch Scherspannung verursacht werden, und das Überleben der verkapselten Zellen verbessern. Eine schnelle gravitationsgetriebene Zellsedimentation im Reservoir könnte jedoch zu einer inhomogenen Zellverteilung in biobedruckten Strukturen führen und somit die Anwendung flüssigkeitsähnlicher Bioinks behindern. Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (z.B. Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation verkapselter Zellen zu verhindern. Mehrere flüssigkeitsnahe Schnittstellen wurden im vielschichtigen Bioink manipuliert, um die Grenzflächenretention zu gewährleisten. Folglich wurde die Zellsedimentationswirkung, die sich über benachbarte Schichten im mehrschichtigen System erstreckte, im Bioinkreservoir verzögert. Es wurde festgestellt, dass die Grenzflächenretention viel höher war als die Sedimentzugvon Zellen, was eine entscheidende Rolle der Grenzflächenretention bei der Verhinderung von Zellsedimentation und der Förderung einer homogeneren Dispersion von Zellen im vielschichtigen Bioink zeigt.

Ein Schema der Herstellung von zellbeladenen Bioinks ist in Abbildung 1dargestellt. Nach der Vorbereitung der verschiedenen Bioinks wurden Beladung, Aufwärmen und Bioprinting durchgeführt (Abbildung 2). Um die Verteilung der gekapselten Zellen im Bioinkreservoir zu bewerten, wurde ein Bioprinting-Verfahren mit drei verschiedenen zellbeladenen Bioinks in drei 96-Well-Platten durchgeführt (Abbildung 3A). Zwei Kontrollgruppen (Pristine...

Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation von verkapselten Zellen zu verhindern.

Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Mit unserem Protokoll fördert die Multilayering der flüssigkeitsähnlichen Bioinkverdünnungen nicht nur eine homogene Dispergität der verkapselten Zellen, sondern sorgt auch für eine zelltaugliche Bioinkumgebung. Wir verwenden die Grenzflächenspannung, um die Sedimentation der verkapselten Zellen innerhalb des Bioink-Reservoirs zu stoppen und die hohe Scherbelastung der Zellen während des Extrusionsdrucks zu vermeiden. Mit dieser Technologie können wir 3D-Gewebekonstrukte mit einer homogenen Zellverteilung erzeugen, die eine funktionelle In-vitro-Gewebeform für den Einsatz in Arzneimittelscreenings und Regenerationsmedizinstudien bereitstellt.Bei der Herstellung des Bioinks ist es wichtig, auf die Versuchstemperatur und das Hygrogel-Ladeverfahren zu achten, da diese Faktoren die Qualität der Tinte beeinflussen können. Vor Beginn der Zubereitung verwenden Sie 0,22-Mikrometer-Spritzenfiltereinheiten, um alle Materialien zu sterilisieren, und lösen Sie Gelatine in einer Endkonzentration von 10 % in 50-Grad-Celsius-PBS in einem biologischen Sicherheitsschrank auf. Methacrylanhydrid in einem Gewichtsverhältnis von 0,6 zu 1 mit langsamem Rühren für mindestens eine Stunde bei 50 Grad Celsius in die Gelatinelösung geben.Am Ende der Inkubation die Mischlösung in ein steriles 50-Milliliter-Rohr geben und die Lösung durch Zentrifugation in Schichten trennen. Sammeln Sie die obere GelMA-Schicht und verdünnen Sie die gesammelte Lösung mit zwei Volumina von 40 bis 50 Grad Celsius entionisiertem Wasser. Dialyze die GelMA-Lösung mit einer 12 bis 14 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Dialysemembran gegen deionisiertes Wasser für fünf bis sieben Tage bei 40 bis 50 Grad Celsius und wechsele das Wasser zweimal täglich.Am Ende der Dialyse, frieren Sie die GelMA-Lösung bei minus 80 Grad Celsius über Nacht. Als nächstes lyophilisieren Die GelMA-Lösung für drei bis fünf Tage in einem Gefriertrockner bei minus 45 Grad Celsius und 0,2 Millibar Druck. Dann lösen Sie das lyophilisierte GelMA in PBS, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 25 Millimolar HEPES und 0,5% Photoinitiator.Um die Seidenfibroin-GelMA-Bioinks zu erhalten, mischen Sie die GelMA-Lösung mit verschiedenen Volumina der anfänglichen Seidenfibroinlösung und verschiedenen PBS-Volumen, wie in der Tabelle vorgeschlagen. Wenn alle Biotinten vorbereitet sind, beschallen Sie die Lösung für 10 bis 20 Minuten. Während die Tinten beschallt werden, sammeln Sie die Zellen aus einer 80%konfluenten NIH/3T3-Zellkultur in einem 15-Milliliter konischen Rohr pro Bioinklösung und pellet die Zellen durch Zentrifugation.Dann die Überstande vorsichtig ansaugen und die Zellen in jeder Röhre mit zwei Milliliterbioink mit einem Mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Bioinklösungskonzentration wieder aufsetzen. Um den Bioink zum Drucken zu laden, fügen Sie 400 Mikroliter zellbeladenes Seidenfibroin 0,5 GelMA in die untere Schicht einer Zwei-Milliliter-Spritze ein. Legen Sie die Spritze für fünf Minuten in ein Null-Grad-Celsius-Eiswasserbad, um die Bioink der unteren Schicht in einen Gelzustand zu verwandeln, bevor Sie 400 Mikroliter zellbeladenes Seidenfibroin 0,75 GelMA-Bioink über die Schicht aus Seidenfibroin 0,5 GelMA laden.Dann geben Sie die Spritze für fünf Minuten ins Eisbad zurück, wobei Sie weiterhin jede zusätzliche Konzentration von zellbeladenem Bioink auf die gleiche Weise in die Spritze aufnehmen. Wenn ein mehrschichtiges Bioinksystem mit unterschiedlichen Konzentrationen von Seidenfibroin innerhalb der verschiedenen Schichten erreicht wurde, erhitzen Sie den Bioink in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator für 30 Minuten. Laden Sie am Ende der Inkubation eine 27-Spur-Druckdüse auf die Spritze und stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 50 Mikroliter pro Minute, die Bewegungsgeschwindigkeit der Düse auf zwei Milliliter pro Sekunde und die Höhe der Düse auf einen Millimeter ein.Als nächstes drucken Sie das Gewebekonstrukt in extrusionsorientierter Weise mit einem maßgeschneiderten Bioprinter bei Raumtemperatur und vernetzen Sie das biogedruckte Gewebekonstrukt mit 365 Nanometern ultraviolettem Licht für 40 Sekunden bei 800 Milliwatt. Dann Kultur das vernetzte Gewebekonstrukt in DMEM ergänzt mit 10%fetalem Rinderserum und 1%penicillin-streptomycin in einem Zellkultur-Inkubator, das Medium alle acht Stunden während der ersten zwei Tage und alle zwei bis drei Tage danach ändern. In dieser repräsentativen Analyse, im Verlauf des Bioprinting-Verfahrens, nahm die Dichte der Zellen in den Zielbrunnen in allen Gruppen ab.In der Seidenfibroin-Null-GelMA-Gruppe wurden etwa 70% der Zellen in der unteren Schicht abgelagert. In der Seidenfibroin-Gruppe wurde eine GelMA-Gruppe von etwa 40% der Zellen in der unteren Schicht abgelagert, und etwa 5% der Zellen wurden in der oberen Schicht abgelagert. In der Seidenfibroin-Mehrschicht-GelMA-Gruppe war die Ablagerung von verkapselten Zellen homogener als die der Kontrollgruppen.Der kritischste Teil dieses Protokolls ist das Laden der SF-GelMA Bioink Multilayer. Dieses Protokoll kann auf andere Extrusionsbioprinting-Analysen angewendet werden, die flüssige Bioinks verwenden.

using-multilayered-hydrogel-bioink-three-dimensional-bioprinting-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Dieses Protokoll hebt eine Methode zur schnellen Bewertung der Biokompatibilität einer kristallinen Nanocellulose (CNC)/Agarose-Verbundhydrogel-Biomaterialtinte mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen in Bezug auf die Zelllebensfähigkeit und die phänotypische Expression der Zelloberflächenrezeptoren Kit (CD117) und des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) hervor.

Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.

3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

In dieser Studie wird ein neuartiges κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad vorgestellt, das bemerkenswerte reversible Jamming-Unjamming-Übergangseigenschaften aufweist. Diese Attribute tragen zur Konstruktion biomimetischer Gewebe und Organe im eingebetteten 3D-Bioprinting bei. Das erfolgreiche Drucken von herz-/ösophagusähnlichem Gewebe mit hoher Auflösung und Zellwachstum demonstriert hochwertige Bioprinting- und Tissue-Engineering-Anwendungen.

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Erfahren Sie die Herstellung mehrschichtiger GelMA-Bioinks zur Verhinderung von Zellsedimentation im 3D-Bioprinting. Diese Methode ermöglicht homogene Zellverteilung für Gewebeengineering und regenerative Medizin.

Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

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