Name: Multiphotonmikroskopische Beobachtung von Gefäßen im Mauslebergewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Multiphotonmikroskopie zur Visualisierung von Blutgefäßdynamiken in der Mausleber mit Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran. Diese Methode ermöglicht hochauflösende 3D-Bildgebung lebender Gewebe.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), dem Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), dem Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) und dem Military Medical Innovation Project (17CXZ008).

Alle Tierpflege und -verfahren entsprachen der Politik des China Nanfang Hospital für Heide und Wohlbefinden (Antrag Nr.: NFYY-2019-73).
1. Mausvorbereitung
<ol><li>Anästhesisieren Sie die Maus.<ol>
<li>Natriumpentobarbital (50 mg/kg) in einer Spritze vorbereiten.</li>
		<li>Schnappen Sie sich die Maus (8 Wochen altes Männchen C57BL/6) mit der linken Hand, so dass ihr Bauch nach oben und ihr Kopf niedriger als sein Schwanz ist. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit 75% Alkohol.</li>
		<li>Halten Sie die Spritze in der rechten Hand, durchbohren Sie den Bauch weiße Linie mit der Nadel leicht auf der rechten Seite der Haut um 3-5 mm. Stellen Sie sicher, dass sich die Spritzennadel und die Haut in einem 45°-Winkel befinden, injizieren Sie das Pentobarbital langsam in die Bauchhöhle.  Nach der Rasur, desinfiziert um die Einschnittstelle der Maus 3 mal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidin-Lösung.</li>
		<li>Prüfen Sie, ob die Anästhesie durch das Fehlen eines rechten Reflexes erfolgreich war.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in die kaudale Vene.<ol>
<li>Bereiten Sie 100 l von 10 mg/ml Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in einer Spritze vor.</li>
		<li>Wischen Sie den Schwanz der Maus mit 75% Alkohol ab.</li>
		<li>Halten Sie den Schwanz mit der linken Hand, halten Sie die Spritze in der rechten Hand mit der Nadel parallel zur Vene, und injizieren Sie den 100-L-Farbstoff.</li>
		<li>Stoppen Sie die Blutung mit einem Wattestäbchen nach der Injektion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Bauchfell der Maus mit mit sterilem Wasser benetzten Gaze einweichen und den Bauch der Maus mit einem Rasiermesser rasieren, was Schläge in Richtung des Fells macht. Nach der Rasur, desinfiziert um die Einschnittstelle der Maus 3 mal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidin-Lösung.</li>
	<li>Nachdem Sie ein Heizkissen mit 75 % Alkohol gewischt haben, öffnen Sie das Heizkissen und legen Sie die Maus auf den Rücken in das Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten.</li>
</ol>2. Fixierung der Mausleber mit dem Körperorgan Bildgebungsrahmen
HINWEIS: Der kommerzielle Organbildrahmen wurde noch nicht veröffentlicht.
<ol><li>Legen Sie einen sauberen Saugnapf in eine feste Position.</li>
	<li>Installieren Sie eine Organbildgebungsvorrichtung(Zusatzabbildung 1) und wischen Sie das Heizkissen und den Saugnapf mit 75% Alkohol ab.</li>
	<li>Schließen Sie den Saugnapf (5 mm Durchmesser) an den Vakuumpumpenschlauch an und schalten Sie die Vakuumpumpe ein.</li>
	<li>Auf einem sterilen Tisch, der mit 75% Alkohol sterilisiert ist, um die Einschnittstelle der Maus dreimal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidinlösung desinfiziert, dann um die Einschnittstelle der Maus 3 mal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidinlösung desinfiziert, dann mit einer chirurgischen Schere 2 cm Haut vom unteren Brustrand der Maus schneidet und die Leber freisetzt.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus zusammen mit dem Heizkissen auf der Halterungsbasis.</li>
	<li>Passen Sie die Organbildleuchte so an, dass der Saugnapf die Leber hält. Dann verwenden Sie einen Unterdruck von 30-35 kPa zum Absaugen, so dass die Leber am Saugnapf befestigt wird (Zusatzabbildung 2).</li>
</ol>3. Einstellen des Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskops
<ol><li>Schalten Sie das Multiphotonenmikroskop ein und wählen Sie das 60x/1,00 W Objektiv aus.</li>
	<li>Fixieren Sie den Rahmen und die Maus unter der Objektivlinse.</li>
	<li>Fügen Sie einen Tropfen normaler Saline hinzu, die die gesamte Linse, die die Mitte des Saugnapfes ist, abdecken kann, und passen Sie die Objektivlinse so an, dass sie nur die normale Saline berührt.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf das Computersymbol, um die Lasersoftware einzuschalten und den Schalter einzuschalten. Halten Sie dann den Ein-/Ausschalter gedrückt und schließen Sie 3 s.</li>
	<li>Stellen Sie die Wellenlänge auf 800 nm ein.</li>
	<li>Starten Sie die Mikroskop-Betriebssoftware mit dem Computer.</li>
	<li>Für die Erfassungseinstellungsetzen Sie Laser 800.</li>
</ol>4. Beobachtung mit Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop
<ol><li>Klicken Sie für Die Bildaufnahmesteuerungauf den Schalter Fluorescent.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Raum- und Gerätebeleuchtung ausgeschaltet ist. Um den Geräuschpegel zu reduzieren, verwenden Sie das Mikroskop in einer abgedunkelten Umgebung.</li>
	<li>Öffnen Sie den Lichtpfadverschluss am Mikroskop.</li>
	<li>Drehen Sie den Fluoreszenzfilter auf den vierten Gang und ziehen Sie die beiden Hebel des optischen Schalters.</li>
	<li>Wenn Sie durch das Okular schauen, verwenden Sie die groben und feinen Fokussier-Quasispiralen, um die Brennweite einzustellen, und verwenden Sie die X/Y-Achsen, um das Sichtfeld anzupassen, um den Zielbereich zu finden.</li>
</ol>5. Multiphotonen LaserScanning Mikrographie
<ol><li>Schalten Sie den Leuchtstoffschalter der Software aus, schalten Sie den Leuchtstofffilter auf den zweiten Gang (zweiter Gang ist RXD1) und drücken Sie die beiden Hebel des optischen Schalters.</li>
	<li>Klicken Sie auf Fokus ×2, um eine Vorschau des Zielbereichs anzuzeigen und die Aufnahmeeinstellung und die Bildaufnahmesteuerungsparameter anzupassen (Bildauflösung: 1024).</li>
	<li>Drücken Sie Control + C und passen Sie die Hochspannung, Verstärkung und Versatz (um den Geräuschpegel zu reduzieren).</li>
	<li>Klicken Sie auf Beenden, um die Vorschau zu beenden, klicken Sie auf die Schaltfläche XY, um in zwei Dimensionen zu scannen, und speichern Sie sie nach Abschluss (Abbildung 1).</li>
	<li>Wählen Sie einen Bereich aus, klicken Sie auf Tiefe, und dann in der Vorschau, um den Endsatz und den Startsatz (siehe den gesamten erforderlichen Teil des Blutgefäßes) in der Einstellung Mikroskop auszuwählen. 3D-Bilder scannen und nach Abschluss speichern (Abbildung 2).</li>
	<li>Wählen Sie einen Bereich aus, klicken Sie auf Zeit, und passen Sie andere Parameter für die Erfassungseinstellung und Bildaufnahmesteuerung an (Schrittgröße: 1 m; Scheiben: 10; Zeitscanzahl: 40). Scannen Sie verschiedene Slices und speichern Sie sie nach Abschluss, um bewegte Bilder zu erhalten (Video 1). HINWEIS: Lassen Sie jemanden für die Mäuse während des Scans kümmern und Fügen Sie Anästhesie entsprechend hinzu.</li>
	<li>Opfern Sie die Maus durch Nackensesection.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+mass-forming+cholangiocarcinoma+growing+in+a+giant+hepatic+hemangioma%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report.</a> Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).</li>
<li>Werkmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+for+blood+vessel+imaging%3A+new+non-invasive+tools+%28Spectral+SHG%2C+FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+optical+microangiography+provide+accurate+imaging+of+capillary+vessels%3F%3A+validation+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).</li>
<li>Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+vascular+imaging+techniques+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomed Research International. 2015, 783983(2015).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Vogt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+multiphoton+imaging+of+the+whole+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatic multiphoton imaging of the whole brain.</a> Nature Methods. 16 (6), 459(2019).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+amyloid-%CE%B2+deposits+in+brains+of+living+mice+permits+direct+observation+of+clearance+of+plaques+with+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy.</a> Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Deep-Brain+Structural+and+Hemodynamic+Multiphoton+Microscopy+Enabled+by+Quantum+Dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots.</a> Nano Letters. , (2019).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Shear, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peer+Reviewed%3A+Multiphoton-Excited+Fluorescence+in+Bioanalytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry.</a> Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+fully+human+anti-TEM1+scFv+in+models+of+solid+tumor+imaging+and+immunotoxin-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).</li>
<li>Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in biological research.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Beobachtung eines bestimmten lebenden Gewebes ist ein wirksames Mittel, um die Veränderungen, Lokalisierung und biologischen Wirkungen des Materials im Gewebe zu verstehen17. In diesem Experiment sind die wichtigen Schritte die Fixierung der Leber mit einer Organbildvorrichtung, die das Problem der Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschläge lösen kann, und der Einsatz eines Multiphotonenmikroskops zur Beobachtung. Mit dieser Methode werden die inneren Gewebe der Leber in vivo durch ein Mu...

Blutgefäße können Nährstoffe für verschiedene Organgewebe des menschlichen Körpers liefern, und Austausch Substanzen. Gleichzeitig funktionieren viele Zytokine, Hormone, Medikamente und Zellen auch durch Gefäßtransport zu bestimmten Orten. Die Beobachtung von Gefäßveränderungen im Lebergewebe kann helfen, die Verteilung des Blutflusses im Lebergewebe und den Transport von Substanzen zu verstehen, und bei der Analyse bestimmter vaskulärer Erkrankungen helfen1,2.
Es gibt viele Möglichkeiten, die Blutgefäße der Leber bei Mäusen zu beobachten. Unter ihnen hat die optische Mikroskopie viele Einschränkungen bei der Beobachtung von undurchsichtigem Gefäßgewebe3. Multiphotonenmikroskopie kann verwendet werden, um die Blutgefäße von lebenden Lebern mit nichtinvasiver hoher Auflösung4abzubilden. Es können nicht nur dreidimensionale Bilder von Blutgefäßen gewonnen werden, sondern die Technik kann auch verwendet werden, um das Gewebe zu organisieren, um biologische Effekte darin zu beobachten; darüber hinaus kann das gesamte Gewebe abgebildet werden und nicht nur die Mikrogefäße wie in der Computertomographie und Magnetresonanztomographie5.
Multiphotonenmikroskopie kann verwendet werden, um verstreute fluoreszierende Signale in tiefem lebendem Gewebe effektiv zu erkennen, mit weniger Phototoxizität6. Daher kann die Aktivität des lebenden Gewebes sichergestellt werden, und die Höhe der Schäden kann reduziert werden. Die Multiphotonenmikroskopie hat eine bessere Durchdringende Leistung als die konfokale Mikroskopie, so dass tiefere Schichten beobachtet werden können7, die einzigartige 3D-Bildgebung bietet. Multiphotonenmikroskopie wird heute oft in bildgebenden Hirnnerven8 verwendet und wurde auf die Untersuchung der neuronalen Dynamik bei lebenden Mäusen9,10,11erweitert.
In diesem Experiment wird die Leber nach der fluoreszierenden Kennzeichnung von Mausblutgefäßen in einem Rahmen fixiert, und die Dynamik der Blutgefäße im lebenden Lebergewebe kann mit der Multiphotonenmikroskopie beobachtet werden. Dieses Experiment zeigt, wie man bestimmte Substanzen markiert, Multiphotonenmikroskopie verwendet, um einen Ort im Gewebe zu beobachten, zelluläre Ereignisse im interzellulären Gewebe zu beobachten, photochemische Messungen12,13,14zu machen und die Materialdynamik im lebenden Gewebe zu beobachten15. Zum Beispiel wurde der Tumorendothelmarker 1 (TEM1) als neuartiger Oberflächenmarker identifiziert, der auf den Blutgefäßen und Stroma in vielen soliden Tumoren hochreguliert ist und einkettiges variables Fragment (scFv) 78 gegen TEM1 markiert und dann die Multiphotonenmikroskopie für die Position des Maushämangioms und die Bewertung von Tumoren16verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>1 mL Spritze x 2</td><td>Hunan Pinan Medical Devices Technology</td><td>YA0551</td><td></td></tr><tr><td>5 W Heizkissen</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td></td></tr><tr><td>75% absolutes Ethanol</td><td>Guangdong Guanghua Sci-Tech</td><td>1.17113.023</td><td></td></tr><tr><td>Saugfähiger Wattebausch</td><td>Healthy Sanitation Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse chirurgisches Instrument</td><td>RWD Life Science</td><td>SP0001-G</td><td>Inklusive Schere und Pinzette</td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskopie</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Organ-Bildgebungsleuchte</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td>Inklusive Saugnapf, Schlauch, Unterdruckpumpe und Halterung</td></tr><tr><td>Rhodamin B Isothiocyanat&ndash; Dextran</td><td>Sigma</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Rasiermaschine</td><td>Lei Wa</td><td>RE-3201</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Pentobarbital</td><td>Sigma</td><td>P3761-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

multiphotonmikroskopische beobachtung von gefäßen im mauslebergewebe

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Die Beobachtung der intravaskulären Dynamik des Lebergewebes der Maus ermöglicht es uns, weitere eingehende Beobachtungen und Studien über gewebebedingte Erkrankungen der Mausleber durchzuführen. Eine Maus wird mit einem Farbstoff injiziert, der Blutgefäße färben kann. Um die Mausleber in vivo zu beobachten, wird sie freigelegt und in einem Rahmen fixiert. Mit einem Multiphotonenmikroskop werden zwei- und dreidimensionale Bilder der Blutgefäße im Lebergewebe gewonnen. Bilder der Gewebe an den ausgewählten Standorten werden kontinuierlich erfasst, um langfristige Veränderungen zu beobachten; die dynamischen Veränderungen der Blutgefäße in den Lebergeweben werden ebenfalls beobachtet. Die Multiphotonenmikroskopie ist eine Methode zur Beobachtung der Zell- und Zellfunktion in tiefen Gewebeabschnitten oder Organen. Die Multiphotonenmikroskopie hat eine Empfindlichkeit gegenüber Gewebemikrostrukturen und ermöglicht die Abbildung von biologischen Geweben mit hoher räumlicher Auflösung in vivo, wodurch die biochemischen Informationen der Organisation erfasst werden können. Multiphotonenmikroskopie wird verwendet, um einen Teil der Leber zu beobachten, aber die Leber zu fixieren, um das Bild stabiler zu machen, ist problematisch. In diesem Experiment wird ein spezieller Vakuumsauger verwendet, um die Leber zu fixieren und ein stabileres Bild der Leber unter dem Mikroskop zu erhalten. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um dynamische Veränderungen bestimmter Substanzen in der Leber zu beobachten, indem solche Stoffe mit Farbstoffen markiert werden.

Die Verteilung der Blutgefäße in der Leber kann in Abbildung 1gesehen werden, die mit Multiphotonenmikroskopie erhalten wurde. Das Blutgefäß ist in eine Vielzahl von Zweigen unterteilt, die von einem Stamm austreten und auf den umgebenden Raum verteilt sind. Der äußere Umfang des Blutgefäßes ist rot, die innere Höhle ist dunkel, und es gibt viele Dinge im Inneren. Je klarer das Bild, desto näher an der Beobachtungsebene ist es. Es gibt auch einige rote Flecken um, wahrscheinlich, weil der Fa...

In diesem Experiment wird eine Maus in ihre Schwanzvene mit Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran injiziert, die Blutgefäße färben können. Nachdem die Leber exponiert und fixiert wurde, kann ein bestimmter Teil der Leber ausgewählt werden, um das tiefe Gewebe im lebenden Körper mittels Multiphotonenmikroskopie zu beobachten.

Multiphotonmikroskopische Beobachtung von Gefäßen im Mauslebergewebe

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Diese Methode kann uns helfen, die Bewegungen der Blutgefäße innerhalb der Mausleber entlang der Evolution der Dynamik der Leber in mehreren Dimensionen zu visualisieren. Mit dieser Methode können wir die Dynamik der Blutgefäße in der Leber in drei Dimensionen visualisieren. Wir haben die Verwendung von Gefäßfarbstoff demonstriert, aber Sie können die Gefäßfärbung mit Ihrer Substanz von Interesse vor der mikroskopischen Visualisierung durchführen.Nach der Bestätigung eines Mangels an Rechten Reflex in einem anästhetisierten acht Wochen alten männlichen C 57 schwarze sechs Maus. Wischen Sie den Schwanz der Maus mit 75% Alkohol ab und verwenden Sie eine Ein-Mikroliter-Spritze, die mit einer 30-Meter-Nadel ausgestattet ist, um 10 Milligramm pro Milliliter frisch zubereitetes Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in 100 Mikroliter Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in die kaudale Schwanzvene zu injizieren. Wenn die gesamte Lösung geliefert wurde, verwenden Sie einen Wattestäbchen, um Druck auf die Punktionsstelle auszuüben und Gaze nass mit sterilem Wasser zu verwenden, um das Bauchfell einzuweichen.Verwenden Sie ein Rasiermesser, um den Bauch zu rasieren, Machen Schläge in Richtung des Fells, und legen Sie die Maus auf eine 37 Grad Celsius, Alkohol desinfiziert Heizungspad. Um die Mausleber mit einem Körperorgan-Bildrahmen zu fixieren, legen Sie zuerst einen sauberen Saugnapf mit fünf Millimeterdurchmessern in eine feste Position und wischen Sie das Heizkissen und den Saugnapf mit 75% Alkohol ab. Schließen Sie den Saugnapf an den Vakuumpumpenschlauch an und schalten Sie die Pumpe ein.Auf einem 75%Alkohol sterilisierten Tisch verwenden chirurgische Schere, um zwei Zentimeter Haut von der unteren Brustrand der Maus zu schneiden und die Leber auszusetzen. Legen Sie die Maus und das Heizkissen auf die Halterung des Körperrahmens und stellen Sie die Organbildleuchte so ein, dass der Saugnapf die Leber halten kann. Dann verwenden Sie einen Unterdruck von 30 bis 35 Kilopascal zum Absaugen, so dass die Leber an der Tasse befestigt wird.Um das Multiphoton Laser Scanning Microscope einzurichten, schalten Sie das Mikroskop ein und wählen Sie das 60 X Objektiv aus. Fixieren Sie den Rahmen und die Maus unter dem Objektiv und fügen Sie einen Tropfen normaler Saline zur Tasse hinzu, die groß genug ist, um die Linse zu bedecken. Passen Sie das Objektiv so an, dass die Linse nur die normale Saline berührt und schalten Sie die Lasersoftware ein.Schalten Sie den Laser ein und halten Sie den Ein-/Ausschalter und den Auslöser für drei Sekunden gedrückt. Starten Sie dann die Mikroskop-Betriebssoftware und stellen Sie den Laser auf 800 Nanometer ein. Um die Bildaufnahmesteuerung einzustellen, klicken Sie auf den Leuchtstoffschalter und schalten Sie die Raum- und Geräteleuchten aus.Öffnen Sie den Lichtpfadverschluss am Mikroskop und drehen Sie den Fluoreszenzfilter auf den vierten Gang. Ziehen Sie die beiden Hebel des optischen Schalters und schauen Sie durch das Augenstück, verwenden Sie den Kurs und feine Fokussier quasi Spiralen, um die Brennweite einzustellen. Verwenden Sie dann die X Y-Achsen, um das Sichtfeld anzupassen, um den Zielbereich zu finden.Schalten Sie für die Bildgebung den Leuchtstoffschalter in der Software aus und schalten Sie den Leuchtstofffilter auf den zweiten Gang um. Drücken Sie die beiden Hebel des optischen Schalters und klicken Sie auf Fokuszeiten zwei, um die Erfassungseinstellungen und die Bildaufnahmesteuerungsparameter und die Drucksteuerung plus C in der Vorschau anzuzeigen, um die Hochspannungsverstärkung und den Offset anzupassen. Klicken Sie auf Stopp, um die Vorschau zu beenden, klicken Sie auf die Schaltfläche X Y, um in zwei Dimensionen zu scannen, und klicken Sie auf Speichern.Wählen Sie einen Bereich aus, und klicken Sie auf Tiefe und Vorschau, um das Ende und die Startsätze in den Mikroskopeinstellungen auszuwählen. Scannen Sie 3D-Bilder und speichern Sie sie. Wählen Sie nach dem Scannen eine Region aus, klicken Sie auf Zeit, und passen Sie die anderen Erfassungseinstellungen und bildaufnahmegesteuerten Parameter an.Scannen Sie dann die verschiedenen Slices und speichern Sie, um den resultierenden Imagefilm zu erhalten. Hier kann eine Visualisierung der Verteilung der Blutgefäße in der Leber mittels Multi-Photonenmikroskopie beobachtet werden. Dieses Blutgefäß ist in eine Vielzahl von Zweigen unterteilt, die aus einem Stamm stammen und in den umgebenden Raum verteilt sind.Der äußere Umfang des Blutgefäßes kann rot beobachtet werden, während die innere Höhle dunkel ist, wie im Video beobachtet, dass nicht rote Objekte, die sich innerhalb der Gefäße bewegen, Zellen sein könnten. Die Dunkelheit des Gewebes in diesem Video beobachtet ist wahrscheinlich aufgrund der Leber nicht gut im Laufe der Zeit fixiert worden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass, wie narbenlose Leber fixiert ist, die Stabilität des Bildes beeinflusst.Diese Methode kann auch auf die Position anderer Strukturen innerhalb der Leber angewendet werden, um die Verteilung oder Veränderungen in bestimmten Arbeitsstrukturen von Interesse direkt zu beobachten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein optisches System wurde entwickelt, um hepatischen Mikrozirkulation mit FITC-markierten Erythrozyten visualisieren und die Sauerstoff-Partialdruck in der Mikrogefäße laserunterstützte phosphorimetry messen. Diese Methode kann verwendet werden, um physiologische und pathologische Mechanismen durch die Analyse von mikrovaskulären Struktur, Durchmesser, Blutflussgeschwindigkeit, und Sauerstoff-Partialdruck zu untersuchen.

Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Dieses Video beschreibt ein bildgebendes Verfahren zur Beobachtung und Untersuchung der intravaskulären Dynamik eines Mauslebergewebes mittels Multiphotonenmikroskopie nach Stabilisierung des Organs. Die Multiphotonenmikroskopie ermöglicht die Abbildung von biologischem Gewebe mit hoher räumlicher Auflösung in vivo.

Imaging Fixture Support Mouse Liver Staging für Multiphotonenmikroskopie basierte Gefäßvisualisierung: Eine stabilisierungsgerätgestützte Bildgebungstechnik zur Gewinnung mehrdimensionaler Bilder von Blutgefäßen in der Mausleber

Dieser Artikel berichtet über eine detaillierte Methode zur dynamischen Messung und Quantifizierung der Blutflussgeschwindigkeit in einzelnen Blutgefäßen des Lebergefäßsystems der Maus unter Verwendung der intravitalen mikroskopischen Bildgebung in Kombination mit einer spezifischen Methodik zur Bildaufnahme und -analyse.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Die stabile intravitale hochauflösende Bildgebung von Immunzellen in der Leber ist eine Herausforderung. Hier bieten wir eine hochempfindliche und zuverlässige Methode zur Untersuchung der Migration und Zell-Zell-Interaktionen von Immunzellen in der Leber von Mäusen über lange Zeiträume (ca. 6 Stunden) mittels intravitaler Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie in Kombination mit intensivmedizinischem Monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Hier beschreiben wir ein einfaches und wirtschaftliches Protokoll zur unvoreingenommenen Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte für das Lungengewebe ganzer Mäuse unter Verwendung einer Einzelfärbung von Isolectin B4.

Quantifizierung der pulmonalen mikrovaskulären Dichte bei Mäusen über Läppchen hinweg

Der ultraschnelle Dopplerultraschall (UFUS) mit hoher räumlicher Auflösung (100 μm) und Sensitivität stellt eine geeignete nichtinvasive Bildgebungsmodalität dar, um einen umfassenden qualitativen Überblick über das Lebergefäßsystem zu erhalten. UFUS erleichtert auch quantitative Messungen des Mikrovaskulatursystems und zielt darauf ab, unser Verständnis der Mechanismen von Gefäßerkrankungen zu verbessern.

Bildgebung und Quantifizierung des hepatischen Gefäßsystems von Mäusen mittels ultraschnellem Doppler-Ultraschall

Erfahren Sie die Multiphotonmikroskopie zur Visualisierung von Blutgefäßdynamiken in der Mausleber mit Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran. Diese Methode ermöglicht hochauflösende 3D-Bildgebung lebender Gewebe.

Multiphotonmikroskopische Beobachtung von Gefäßen im Mauslebergewebe

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