Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Die Einzelmolekülkraftspektroskopie ermöglicht es uns, physikalische Parameter zu messen, die die mechanischen und klebenden Eigenschaften von Polymeren beschreiben. Bei der Verwendung der AFM-basierten Kraftspektroskopie zur Untersuchung einzelner Moleküle ist es wichtig, ein zuverlässiges und effizientes Protokoll zu haben, um diese Moleküle kovalent an eine AFM-Auslegerspitze zu binden. Dieses Protokoll kann unabhängig von der Konturlänge oder Hydrophobizität auf viele verschiedene Polymere übernommen werden.

Alle Schritte sollten in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden, um das Einatmen organischer Dämpfe zu vermeiden. Zusätzlich sind lösungsmittelbeständiges Glas, Laborlack und Augenschutz erforderlich. Verwenden Sie zunächst frisch gereinigte Pinzette, um AFM Auslegerchips in die Plasmakammer zu legen.

Starten Sie das Plasmakammer-Oberflächenaktivierungsprogramm, indem Sie Start und dann ja auswählen. Stellen Sie sicher, dass der Plasmaprozess ordnungsgemäß funktioniert. Ein Plasmaprozess mit hohem Sauerstoffgehalt zeigt eine hellblaue Farbe.

Während das Oberflächenaktivierungsprogramm ausgeführt wird, lösen Sie Silan-PEG-mal in Toluen auf, um eine Konzentration von 1,25 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Legen Sie drei Milliliter der Lösung in eine flache Petrischale. Nachdem der Plasmaprozess abgeschlossen ist, belüften Sie die Plasmakammer, indem Sie bestätigen und dann entlüften.

Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, um die Absorption von Verunreinigungen zu verhindern. Legen Sie die Chips in die Petrischale und bebrüten Sie die Chips für drei Stunden bei 60 Grad Celsius. Entfernen Sie die Petrischale aus dem Ofen und lassen Sie sie mindestens 10 Minuten abkühlen.

Als nächstes spülen Sie die Chips. Für PEG- oder Polystyrolbindung die Chips dreimal mit Toluus abspülen. Bei Polynipambindung sollten Chips einmal mit Toluin und zweimal mit Ethanol vorspült werden.

Um den Aufprall von Kapillarkräften auf den AFM-Ausleger zu reduzieren, neigen Sie die Chips beim Spülen leicht. Die AFM Auslegerchips müssen richtig gespült werden, um einen Überschuss an physikalischen Polymeren zu entfernen, die das Experiment beeinflussen können. Das Spülen sollte sorgfältig durchgeführt werden, um Schäden an den AFM-Auslegern zu vermeiden.

Schließlich bereiten Sie mindestens zwei Chips als Steuerungen, die nicht kovalentpolymer aufbringen. Für Kontrollen im Vergleich zu PEG- und Polystyrol-Chips zweimal mit Ethanol und einmal mit Wasser abspülen. Für Kontrollen im Vergleich zu Polynipam-Chips zweimal mit Wasser abspülen.

Um eine kovalente Befestigung von PEG oder Polystyrol durchzuführen, bereiten Sie drei Milliliter Polymerlösung in Toluole in einer Konzentration von 1,25 Milligramm pro Milliliter vor. Fügen Sie die Lösung und die Chips zu einer Petrischale hinzu und brüten Sie die Chips bei 60 Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Inkubation mit PEG oder Polystyrol die Chips 10 Minuten abkühlen lassen.

Spülen Sie die Chips zweimal mit Toluin, zweimal mit Ethanol und einmal mit Wasser. Um eine kovalente Befestigung von Polynipam durchzuführen, bereiten Sie drei Milliliter Polymerlösung in Ethanol in einer Konzentration von 1,25 Milligramm pro Milliliter vor. Fügen Sie die Lösung und die Chips zu einer Petrischale hinzu und brüten Sie die Chips bei Raumtemperatur für drei Stunden.

Nach der Inkubation mit Polynipam die Chips zweimal mit Ethanol und zweimal mit Wasser abspülen. Um die Chips bis zum Einsatz in einem Experiment zu lagern, legen Sie jeden Chip separat in eine mit Wasser gefüllte Petrischale mit einem Milliliter. Halten Sie die Petri-Gerichte bei vier Grad Celsius.

Legen Sie zunächst den funktionalisierten AFM Auslegerchip in einen Chiphalter ein. Kleben Sie die vorbereitete Oberfläche in einen Probenhalter, der für Messungen in Flüssigkeit geeignet ist. Verwenden Sie eine Pipette, um den Chip in Wasser einzutauchen.

Montieren Sie die Probenoberfläche in den AFM. Tauchen Sie die Probenoberfläche in Wasser ein. Schließen Sie den Chiphalter an den AFM an.

Dann nähern Sie sich dem Chip an die Probenoberfläche. Verwenden Sie das Umgebungspanel, um die Zieltemperatur einzustellen und den Modus und die Feedback-Optionsfelder auf einzuschalten. Dann lassen Sie das System für etwa 15 Minuten ausstehen.

Um eine Kraftverlängerungskurve zu nehmen, nähern Sie sich der AFM-Auslegerspitze an die Oberfläche und wählen Sie eine einzelne Kraft aus. Die resultierende Kurve zeigt die Ablenkung gegen den Piezoabstand mit der Annäherung an die rot dargestellte Oberfläche und die in Blau dargestellte Retraktion an. Erweitern Sie den Teil der Kurve, der den Einzug der AFM-Auslegerspitze darstellt, in die darunter liegende Oberfläche.

Um eine lineare Anpassung durchzuführen, legen Sie die Cursor entweder auf den Ansatz oder die Rückzugskurve fest, und wählen Sie INVOLS aktualisieren aus dem Kontextmenü aus. Der resultierende Wert für den inversen optischen Hebelempfindlichkeitswert wird im Bedienfeld oben links angezeigt. Nachdem Sie dieses Verfahren mindestens fünfmal wiederholt haben, berechnen Sie einen Durchschnitt für die inverse optische Hebelempfindlichkeit und geben Sie den Durchschnitt in das Panel ein.

Positionieren Sie den AFM-Ausleger in einer Höhe von ca. 100 Mikrometern über der Oberfläche, indem Sie Move zum Pre-Engage auswählen. Um ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis für das thermische Rauschspektrum zu erhalten, stellen Sie die Mittelungszahl auf mindestens 10 ein und wählen Sie die höchstmögliche Frequenzauflösung. Zeichnen Sie als Nächstes das thermische Rauschspektrum auf, indem Sie Wärmedaten erfassen auswählen.

Um das thermische Rauschspektrum mit einer einfachen harmonischen Oszillatorfunktion anzupassen, erweitern Sie den Teil der Kurve, der die erste Resonanzspitze darstellt. Wählen Sie dann Initialisierungsanpassung aus. Verfeinern Sie schließlich die Passung mithilfe der Schaltfläche "Thermische Daten anpassen".

Die entsprechende Kraftkonstante wird im Panel angezeigt. Um mit dem Sammeln der Daten zu beginnen, legen Sie die Parameter für das Experiment fest. Legen Sie die Zuggeschwindigkeit auf ein Mikrometer pro Sekunde fest und erzwingen Sie den Trigger auf einen Nanonewton.

Nähern Sie sich der AFM-Auslegerspitze an die Oberfläche, und wählen Sie eine einzelne Kraft aus, um eine einzelne Kurve aufzuzeichnen und zu bestimmen, ob die Parameter wie im Manuskript beschrieben angepasst werden müssen. Wählen Sie F-Karte aus dem Master-Panel aus. Um eine Kraftkarte mit 100 Kurven zu erhalten, legen Sie die Anzahl der Kraftpunkte und Kraftlinien auf 10 fest.

Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Kraftkarte, indem Sie do F map auswählen. Nehmen Sie Die Kraftverlängerungskurven gitterartiver, um lokale Oberflächeneffekte zu vermeiden und unterschiedliche Flächen zu durchschnittlich zu nutzen. Wiederholen Sie nach dem Experiment die Bestimmung der inversen optischen Hebelempfindlichkeit und der Federkonstante, um die Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen.

Einzelne Polynipam- und PEG-Polymere wurden an einem Ende kovalent an eine AFM-Auslegerspitze gebunden und am anderen Ende auf der Siliziumdioxidoberfläche bebaut. Um das temperaturabhängige Dehnungsverhalten zu messen, wurde ein klares Einzelmolekül-Dehnungsereignis gefolgt von einem endgültigen Maximum am Ende der jeweiligen Kraftverlängerungskurve identifiziert. Dann wurde für jede Temperatur eine einzige Masterkurve erzeugt.

Bei PEG wurde eine Abnahme der Dehnkraft bei steigender Temperatur beobachtet. Bei Polynipam wurde der gegenteilige Trend beobachtet. Die Desorption von Polystyrol von einer SAM-Oberfläche in Wasser kann verwendet werden, um die Desorptionskraft und Länge zu bestimmen.

Wenn die Polymeraufsatzwarmung erfolgreich war, zeigten die Kraftverlängerungskurven Plateaus mit konstanter Kraft. Jedes Plateau wurde mit einer sigmoidalen Kurve ausgestattet, um die Desorptionskraft und desorptionslänge zu bestimmen. Die beobachteten Desorptionskräfte entsprachen zuvor ermittelten Werten.

Wenn mehr als ein Polymer an der AFM-Auslegerspitze befestigt war, wurden Kaskaden von Plateaus in den Kraftverlängerungskurven beobachtet. Bei zwei angeschlossenen Polymeren wurde eine bimodale Verteilung für die Desorptionslänge gefunden, während die Desorptionskraft eine enge Verteilung zeigte. Eine funktionalisierte AFM-Auslegerspitze kann verwendet werden, um die Kraftreaktion einzelner Moleküle in einer flüssigen Umgebung und mit externen Reizen zu quantifizieren.

Die Verwendung von sauberen Geräten, Lösungsmitteln, AFM-Auslegerspitzen und wiederholter Spülung ist sehr wichtig, um ein hohes Maß an Sauberkeit zu erreichen, das vor den beschriebenen kontrollierten Experimenten bestätigt werden sollte. Die vorgestellten Protokolle und Verfahren ebneten den Weg für ein besseres Verständnis von stimulierend reagierenden Polymersystemen. Die Ergebnisse können direkt mit molekulardynamischen Simulationen verglichen werden.