Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Die effiziente Montage supramolekularer Strukturen für minimalezellige Gestaltung und Medikamentenabgabe bleibt eine Herausforderung. Hier zeigen wir effiziente Protokolle, die supramolekulare Strukturen auf Basis amphiphiler Elastin-ähnlicher Proteine ergeben. Die vorgestellten Montageprotokolle erzeugen vielseitige supramolekulare Strukturen mit anpassungsfähigen physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Vesikel, Fasern und Koacervate.

Proteinmembranbasierte Kompartimente demonstrieren Phasentrennungsverhalten und ermöglichen die Verkapselung chemisch vielfältiger fluoreszierender Ladungsmoleküle. Für den Ausdruck von F20E20-mEGFP und F20E20-mCherry, impfen Sie die Hauptausdruckskultur von der Übernacht-Vorkultur zu einem OD600 von 0,3. Inkubieren Sie es in 400 Milliliter sterilem LB-Medium, ergänzt mit entsprechenden Antibiotika bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute.

Wenn die Ausdruckskultur OD600 von 0,5 bis 0,8 erreicht, fügen Sie IPTG zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzu und reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 20 Grad Celsius. Zur Expression des amphiphilen ELP mit der unnatürlichen Aminosäure impfen Sie die Hauptexpressionskultur von der E.coli-Präkultur über Nacht, die die entsprechenden Plasmide enthält, bis zu einem OD von 0,3. Inkubieren Sie es in 400 Milliliter sterilem LB-Medium, ergänzt mit Kanamycin und Chloramphenicol bei 37 Grad Celsius und 200 Rpm.

Um den 100-Millimolaren unnatürlichen Aminosäurebestand vorzubereiten, fügen Sie 206,2 Milligramm unnatürliche Aminosäure zu acht MilliliterRinpurwasser hinzu. Den pH-Wert der Lösung mit dreimolarem Natriumhydroxid anheben und kräftig mischen. Wenn die unnatürliche Aminosäure gelöst ist, senken Sie den pH-Wert auf ca. 10,5 und fügen Sie ein Volumen von 10 Millilitern Ultrareinstwasser hinzu.

Filtern Sie die Lösung mit einem sterilen 0,22-Mikrometer-Filter und aliquotieren Sie sie in Zwei-Milliliter-Reaktionsröhren. Wenn die Expressionskultur OD600 von 0,5 bis 0,8 erreicht, fügen Sie die unnatürliche Aminosäure zu einer Endkonzentration von zwei Millimolar hinzu. Inkubieren Sie es für 10 weitere Minuten.

Dann induzieren Expression des Zielproteins und die notwendige tRNA-Synthetase durch gleichzeitige Zugabe von IPTG und Arabinose. Reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 20 Grad Celsius, und lassen Sie den Ausdruck für etwa 20 Stunden fortsetzen. Nach der Inkubation die Zellen durch Zentrifugieren bei vier Grad Celsius und 4000 mal g für 40 Minuten ernten.

Setzen Sie das Zellpellet im Lysepuffer mit Lysozym und PMSF wieder auf. Inkubieren Sie die Lösung für 30 Minuten auf Eis. Dann einfrieren und zweimal auftauen, indem Sie in flüssigen Stickstoff eintauchen.

Sonicatdie Suspension, und löschen Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 10 000 mal g und vier Grad Celsius für 40 Minuten. Dann reinigen Sie das Protein mit Affinitätschromatographie. Nach der Proteinelution bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung lagern.

Fügen Sie einen Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff zu 500 Mikroliter ELP-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Reaktion für etwa 10 Stunden bei 15 Grad Celsius, während Sie in einem ThermoMixer schütteln, um sie vor Licht zu schützen. Um übermäßigen Fluoreszenzfarbstoff zu entfernen, gleichziehen Sie eine Dialysemembran in Reinstwasser für 10 Minuten. Schneiden Sie die Membran in die richtige Größe, um mit der angeklickten ELP-Lösung auf die Öffnung des Reaktionsrohrs gelegt zu werden.

Befestigen Sie dann die Membran an der Öffnung, indem Sie das Rohr mit einem Deckel schließen, der keinen Kern hat. Füllen Sie den Raum zwischen Deckel und Membran mit Puffer, um das Abfangen von Luft zu verhindern. Legen Sie dann das Reaktionsrohr in den gewählten Puffer, drücken Sie es unter die Oberfläche und drehen Sie es auf den Kopf.

Führen Sie die Dialyse mindestens drei Stunden bei vier Grad Celsius durch, sodass die Dialyse nach jedem Pufferwechsel noch mindestens drei Stunden andauern kann. Bei THF-Schwellungen die homogene ELP-Lösung gegen Phosphat oder Tris-Puffer mit stabilem pH-Wert 7,5 dialysieren. Bereiten Sie den Lyophilisator vor und kühlen Sie ihn auf Die Anfangstemperatur für die Gefriertrocknung.

Aliquot die dialysierte Proteinlösung in 1,5-Milliliter-Reaktionsröhren und versiegeln Sie sie mit Kappen mit einem kleinen Loch, um zu vermeiden, dass die feste Probe durch Druckänderungen im Verlauf der Gefriertrocknung verloren geht. Schock-Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff. Nehmen Sie die gefrorenen Proteinproben aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie sofort in den Lyophilisator, um mit der Gefriertrocknung zu beginnen.

Nachdem die Probe vollständig trocken ist, belüften Sie sie mit trockenem Stickstoff, und schließen Sie sofort die Reaktionsrohrdeckel, um den Kontakt mit Luftfeuchte zu vermeiden. Fügen Sie den lyophilisierten Proben reines THF hinzu und legen Sie die Lösung 15 Minuten lang in einen Wasserbadbeschalltoner mit Eiswasser. Einen Thermocycler für die Vesikelbildung auf 30 bis 60 Grad Celsius vorheizen oder bis zu 90 Grad Celsius für die Faserbildung vorheizen und neue Reaktionsrohre mit Reinstwasser oder Puffer vorbereiten.

Nach der Beschallung die ELP/THF-Lösung und das vorbereitete Wasser oder den Puffer fünf Minuten lang in den Thermocycler geben. Dann stifizieren Sie die ELP-Lösung auf das Wasser oder den Puffer, um sicherzustellen, dass die Trennung der beiden Phasen und eine deutliche Interphase sichtbar ist, und legen Sie das Gemisch wieder in den Thermocycler. Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur 10 Minuten abkühlen und fahren Sie mit der Dialyse gegen Wasser oder Puffer oder mit Fluoreszenzmikroskopie fort.

Bereiten Sie eine EIN- bis 50-Mikromolar-ELP-Lösung vor und fügen Sie 10 bis 20%1-Butanol hinzu. Mischen Sie die Lösung sofort, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Die Trübung der Lösung sollte während des Mischens zunehmen, was auf die Vesikelbildung hindeutet.

Um eine schmale Größenverteilung zu erreichen, extrudieren Sie Vesikel mit einem Miniextruder durch eine Membran mit einer Porengröße von einem Mikrometer. Für die Färbeverkapselung ca. 40 Mikroliter ELP-Lösung in 10-Millimolar Tris-HCl mit einem Mikroliter Dextran Texas Red Stofflösung in DMSO mischen. 10 Mikroliter 1-Butanol hinzufügen und fünf- bis zehnmal durch eine Spritze extrudieren, die mit einer 0,25 mal 25-Millimeter-Nadel ausgestattet ist.

Die THF-Schwellungsmethode besteht aus drei aufeinanderfolgenden Schritten und führt je nach Temperatur zu unterschiedlichen supramolekularen Baugruppen des ELP. Die Epifluoreszenzmikroskopiebilder zeigen Vesikel aus BDP-R20F20 und fibrilläre Strukturen aus BDP-R40F20. Die 1-Butanol-Extrusionsmethode führt ausschließlich zur Bildung von ELP-Vesikeln.

Etwa zwei Größenordnungen mehr Vesikel werden im Vergleich zur THF-Schwellungsmethode produziert. BDP-R40F20 wurde mit 10 bis 15% Butanol gemischt, und Vesikel wurden über die Extrusion der Mischung hergestellt. Aus BDP-R40F20 wurden über das THF-Schwellungsprotokoll verschiedene supramolekulare Strukturen zusammengesetzt.

Der pH-Wert des Puffers und die Temperatur des Montageprozesses wurden so eingestellt, dass sie entweder Koacervate, Fibrillen oder Vesikel bilden. Kleine Fehler im Montageprotokoll können zur Bildung von Aggregaten führen. Positiv geladener Farbstoff ATTO Rho 13 und das Polysaccharid dextran red 3000 wurden in das Lumen von Vesikeln eingekapselt, die aus F20R20-mEGFP über das 1-Butanol-Extrusionsverfahren zusammengesetzt wurden.

Konfokale Mikroskopiebilder zeigen die Vesikel im grünen Kanal, die Ladung im roten Kanal und die erfolgreiche Verkapselung im resultierenden zusammengeführten Kanal. Das Phasentrennungs- und Fusionsverhalten von ELP-Amphiphilen beim Mischen einzelner PMBC-Bausteine mit montierten PMBC-Populationen wurde ebenfalls demonstriert. Das Mischen vor der PMBC-Montage führt zu homogen verteilten Molekülen innerhalb der montierten PMBC-Membran, während das Mischen von zusammengesetzten Vesikelpopulationen zu Membranflecken mit roter oder grüner Fluoreszenz führt, die mindestens 20 Minuten lang sichtbar sind.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, auf die richtige Schrittreihenfolge und die Unterschiede zwischen der THF-Schwellungsmethode und der Butanolextrusionsmethode zu achten. Nach diesem Protokoll können die ELP-Vesikel als Arzneimittelabgabe-Shuttles, als Plattform für enzymatische Reaktionen wie In-vitro-Transkription und -Übersetzung oder bei der Bildung synthetischer Minimalzellen verwendet werden.