Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es sich um ein anpassungsfähiges, stereotaktisches Verfahren handelt, das sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten angewendet werden kann und auf viele neue neurowissenschaftliche Techniken angewendet werden kann. Der Hauptvorteil dieses anpassungsfähigen stereotaktischen Verfahrens besteht darin, dass es verwendet werden kann, um schwierige und schwer zugängliche Regionen des Gehirns zu erreichen. Chelsea Faber, eine junge, talentierte Postdoktorandin im Labor, wird das Verfahren vorführen.

Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Rahmen und der Mikromanipulator kalibriert wurden, setzen Sie das Mittenhöhenmessgerät in die Buchse der Grundplatte des Kopfhalters ein. Befestigen Sie das Zentrierzielfernrohr im Werkzeughalter und visieren Sie das Zielfernrohr nach unten. Passen Sie die Position des Mikromanipulators an, bis das Fadenkreuz ausgerichtet und auf das Fadenkreuz fokussiert ist, und platzieren Sie die Ohrstangen so in den Halterungen, dass die Anzeigelinien auf beiden Seiten bei Null stehen.

Verwenden Sie die medial-lateralen und anterior-posterioren Knöpfe an der Kopfhalterung, um die Ohrstangen in der X- und Y-Ebene über dem Fadenkreuz des mittleren Höhenmessgeräts zu zentrieren. Um die Position der Ohrbügel in der Z-Achse auszurichten, entfernen Sie die Ohrbügel aus der Halterung und entfernen Sie die mittlere Höhenanzeige. Setzen Sie dann die Ohrbügel wieder ein und zentrieren Sie die Stege wieder auf Null.

Richten Sie dann das Zielfernrohr wieder nach unten und verwenden Sie die vertikalen Verschiebungs- bzw. koronalen Neigungsknöpfe, um die Ohrbügel abzusenken und zu drehen, bis das Fadenkreuz des Zielfernrohrs während der gesamten koronalen Drehung zwischen den Ohrstangen zentriert bleibt. Um die zentrale Drehachse für abgewinkelte Koordinaten auszurichten, befestigen Sie den Zentrierbereich in der Werkzeugaufnahme und positionieren Sie den Mikromanipulator auf die berechnete Koordinate. Beachten Sie, dass die rechte/linke Koordinate für die abgewinkelte Implantation der Länge der Seite A entspricht.Wenn Sie das Zielfernrohr nach unten anvisieren, markieren Sie diese Koordinate so, dass sie den Punkt darstellt, an dem die Kanüle in das Gehirn eintritt, sobald der Kopf gedreht wird.

Positionieren Sie den Mikromanipulator neu über der Mittellinie und drehen Sie den Kopf mit dem koronalen Neigungsknopf in den berechneten Winkel. Wenn das Fadenkreuz des Zielfernrohrs nicht mit der Referenzmarkierung ausgerichtet ist, stellen Sie mit dem vertikalen Schaltknopf die Kopfposition in der Z-Achse ein, bis das Fadenkreuz so nah wie möglich an der Markierung ausgerichtet ist. An dieser Stelle sollte der beliebige Drehpunkt mit dem Rotationszentrum der Stereotax ausgerichtet werden.

Drehen Sie den Kopf zurück in die koronale Position von null Grad, bevor Sie mit den nachfolgenden Bohr- und Mikroinjektionsschritten fortfahren. Nachdem Sie die Mikroinjektion durchgeführt haben, bringen Sie den Kopf wieder in die Null-Grad-Position und platzieren Sie mit einem Handbohrer zwei Löcher vorne und zwei Löcher hinten weit genug von den abgewinkelten Koordinatengratlöchern entfernt, um den Ferrule-Teil der Faser aufzunehmen, der über dem Schädel sitzt. Wenn alle Löcher gebohrt sind, setzen Sie die Knochenschrauben mit einem kleinen Schlitzschraubendreher so sanft wie möglich ein, so dass sie fest im Schädel sitzen, ohne das Gehirn zu durchdringen.

Klemmen Sie eine faseroptische Kanüle in den Kanülenhalter ein und setzen Sie den Kanülenhalter in den Werkzeughalter ein. Drehen Sie den Kopf in den berechneten Winkel, wobei Sie beachten müssen, dass die Koordinaten des Mikromanipulators nicht für das neue Werkzeug gelten. Verwenden Sie die Mitte der abgewinkelten Fräslöcher als Implantationsziel.

Senken Sie die Faseroptik ab, bis sie die Dura in der Mitte des Bohrlochs berührt, und stellen Sie den Mikromanipulator in der Z-Achse auf Null. Senken Sie die Faseroptik langsam auf die dorsale ventrale Winkelkoordinate ab und verwenden Sie dann Cyanacrylatgel, um die Faseroptikzwinge mit den ipsilateralen Ankerschrauben zu verbinden. Verwenden Sie eine Mikropipettenspitze, um einen Beschleuniger aufzutragen.

Sobald das Gel vollständig ausgehärtet ist, lösen und heben Sie den Kanülenhalter vorsichtig an, bis er frei von der Ferrule ist. Implantieren Sie die zweite Faseroptik an die kontralaterale Winkelkoordinate und richten Sie dann den Kopf aus. Für zusätzliche Sicherheit verwenden Sie das Cyanacrylat-Gel und den Beschleuniger, um eine zusätzliche Verbindung zwischen den beiden abgewinkelten faseroptischen Kanülen herzustellen, und tragen Sie eine kleine, relativ dünne Menge Zahnzement auf die Oberfläche des Schädels auf, wobei Sie darauf achten, dass die Ankerschrauben und die Basis der faseroptischen Kanülen gründlich bedeckt sind.

Um die Rolle der Neuronen des ventromedialen Nucleus des Hypothalamus bei der glykämischen Kontrolle zu untersuchen, wurde in dieser repräsentativen Analyse ein standardmäßiger, nicht abgewinkelter, stereotaktischer Ansatz für die bilaterale Mikroinjektion eines inhibitorischen Kanal-Rhodopsinvirus in den ventromedialen Kern verwendet. Aufgrund der Nähe des ventromedialen Kerns zur Mittellinie war eine nicht abgewinkelte Implantation von bilateralen Faseroptiken aus Platzgründen nicht möglich, so dass eine chirurgische Strategie zur präzisen Implantation von Faseroptiken in einem Winkel erforderlich wurde. Das Wichtigste, woran Sie denken sollten, ist, einfach geduldig zu sein und sich Zeit zu nehmen, da es für den Erfolg entscheidend ist, konsistent und genau mit Ihren Koordinatenzuweisungen zu sein.

Dieses Verfahren kann an jede neurowissenschaftliche Methode angepasst und angewendet werden, die eine Mikroinjektion oder Implantation in das Nagetiergehirn erfordert, einschließlich Chemogenetik, Optogenetik und Faserphotometrie.