Hefestamm-Phänotypisierung mit Droplet-basierter RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz
21. Mai 2020
Ein Engpass im "Design-Build-Test"-Zyklus der mikrobiellen Technik ist die Geschwindigkeit, mit der wir funktionale Bildschirme von Stämmen durchführen können. Wir beschreiben eine Methode mit hohem Durchsatz für das Dehnungsscreening, die auf Hunderte bis Tausende von Hefezellen pro Experiment angewendet wird, die tropfenbasierte RNA-Sequenzierung verwendet.
ICO oder ICO-seq ist die erste Anpassung der RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz an Mikroben. Diese Methode bewertete die mikrobielle Funktion auf genomweiter Ebene. Bei technischen Mikroben kann diese Methode aufklären, wie Veränderungen des mikrobiellen Genoms seine Funktionen stören können.
Beziehen Sie Hefe aus einer Suspensionskultur, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Setzen Sie die Zellen in PBS in einer Konzentration von etwa 750.000 Zellen pro Milliliter wieder aus. Als nächstes mischen Sie ultra-niedrigen Schmelzpunkt Agarose in PBS, und erhitzen Sie die Mischung bei 90 Grad Celsius, bis die Agarose schmilzt.
Das Agarose-Gemisch mit einem angeschlossenen 0,22-Mikron-Filter in eine Spritze geben. Legen Sie eine Spritzenpumpe vor eine Raumheizung, die auf 80 Grad Celsius eingestellt ist, und legen Sie die Spritze in die Pumpe. Füllen Sie eine zweite Spritze mit der Hefesuspension und füllen Sie eine dritte Spritze mit fluoriertem Öl, mit 2% ionischem Fluorsursid.
Laden Sie beide Spritzen in die Spritzenpumpen. Schließen Sie die Schläuche von den Spritzen an das Gerät A. Platzieren Sie ein 15-Milliliter-Konusrohr in einen Eiskübel, und führen Sie den Auslassschlauch in das konische Rohr. Stellen Sie den Durchfluss für jede Spritze ein und sammeln Sie etwa einen Milliliter Emulsion im 15 Milliliter konischen Rohr.
Nachdem Sie fünf Minuten gewartet haben, bis die Agarose in der Röhre eingestellt ist, fügen Sie der Emulsion ein gleiches Volumen von 20% Perfluor-Oktanol in fluoriertem Öl hinzu. Mischen Sie die Emulsion und das Perfluor-Oktanol, indem Sie das konische Rohr ein paar Mal invertieren. Zentrifugieren Sie die gebrochene Emulsion bei 2.000 mal G für zwei Minuten.
Stellen Sie sicher, dass die Hydrogele über den Öl- und PFO-Phasen pelletiert haben. Entfernen Sie die Öl- und PFO-Phasen. Fügen Sie zwei Milliliter tet(W)Puffer hinzu, um die Hydrogele wieder aufzuhängen.
Übertragen Sie die Suspension in ein neues 15-Milliliter-Konusrohr. Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 2.000 mal G für zwei Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Hydrogele in tet(W) erneut auf.
Nachdem Sie die Hydrogele bei 2.000 mal G für zwei Minuten abgedreht haben, setzen Sie die Hydrogele in zwei Milliliter Hefekulturmedium wieder auf. Inkubieren Sie die Röhre über Nacht bei 30 Grad Celsius, mit Schütteln. Jede Stämme wächst mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten.
Die Wahl eines geeigneten Mediums und der Inkubationszeit ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Hefe innerhalb des Hydrogels wächst, aber nicht überwächst, was dazu führt, dass Zellen in die Medien entweichen. Übertragen Sie zunächst die Hydrogele in ein 15-Milliliter-Konusrohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2.000 mal G für zwei Minuten.
Waschen Sie die Hydrogele zweimal mit PBS und dann einmal in spheroplasting Puffer. Führen Sie eine 40-fache Verdünnung des spheroplasting Enzyms in spheroplasting Puffer. Dann fügen Sie den Hydrogelen einen Milliliter des verdünnten Enzyms hinzu.
Inkubieren Sie die Röhre der Hydrogele bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Die behandelte Hefe sieht transparenter aus. Aus dem Rohr, das die Hydrogelsuspension enthält, 0,8 Milliliter der Suspension von der Unterseite des Rohres abziehen und in eine ein Milliliter unbedeckte Spritze übertragen.
Legen Sie die Spritze in den 3D-gedruckten Spritzenhalter. Zentrifugieren Sie die Spritze und den Halter zwei Minuten lang bei 2 000 mal G. Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Hydrogele am Boden der Spritze fest verpackt sind.
Platzieren Sie 240 000 Drop-Seq-Perlen in einem 15-Milliliter-Konustube. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1 000 mal G für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und hängen Sie die Perlen in zwei Milliliter0,9x Hefelysepuffer mit 500 Millimolar Natriumchlorid wieder auf.
Legen Sie einen Rührstab ein und übertragen Sie die Perlensuspension in eine Drei-Milliliter-Spritze. Bereiten Sie eine weitere Spritze vor, die mehrere Milliliter PFPE-PEG-Tensid in fluoriertem Öl enthält. Besorgen Sie sich die zuvor vorbereitete Spritze mit hefeklonverpackten Hydrogelen.
Evakuieren Sie den Kopf und kappen Sie die Spritze. Legen Sie die drei Spritzen, die Hydrogele, die Perlensuspension und das Öl in Spritzenpumpen ein. Schließen Sie die Spritzen über Schläuche an Gerät B, das Verkapselungsgerät, an.
Legen Sie das Ende des Auslassschlauchs in eine 50-Milliliter-Konustube auf Eis. Legen Sie den Durchfluss für jede Spritze fest. Sammeln Sie etwa 1.000 Milliliter Emulsion, oder führen Sie das Gerät, bis keine Hydrogele übrig sind.
Folgen Sie dann dem Drop-Seq-Protokoll für cDNA-Synthese, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung. Mit Hilfe eines mikrofluidischen Geräts wurden Hefezellen in 160-Mikrometer-Tröpfchen eingekapselt. Ein achtfacher Splitter teilte diese Tröpfchen in acht 60-Mikrometer-Tröpfchen.
Die inder Nacht inkubierte Inkubation führte dazu, dass isogene Hefekolonien in einigen der Hydrogele wuchsen. Bevor die Hefehydrogele in das zweite mikrofluidische Gerät geladen wurden, wurden sie gewaschen und in eine Lösung zur Verdauung der Zellwände eingetaucht. Die richtige Verdauung wurde durch mikroskopische Behandlung entheben, wobei behandelte Hefezellen eine reflektierendere Morphologie hatten.
Ein Strom von mRNA-Capture-Perlen im Lysepuffer wurde mit einem Strom von Nahpackung-Hefe-Hydrogelen vor der Dropmaking-Kreuzung des zweiten mikrofluidischen Geräts gemischt. In der resultierenden Emulsion enthielten etwa 10% der gesammelten Tröpfchen eine Perle mit einer lysierten Kolonie. Dieser isogene Koloniesequenzierungsworkflow wurde verwendet, um die weiße undurchsichtige Schaltreaktion von C.albicans zu analysieren.
Hauptkomponente, PC, Analyse und eine tSNE-Dimensionsreduktion deuteten auf eine allgemeine Übereinstimmung zwischen dem Stichprobendatensatz und einem Referenzdatensatz hin. Die TSNE-Analyse ergab drei Zellcluster. Während Cluster 2 überwiegend aus Zellen aus dem Stichprobendatensatz bestand, bestanden die Cluster Null und eine aus Zellen aus beiden Stichproben.
Das Überlagern des WH11-Ausdrucks auf dem tSNE deutete darauf hin, dass Cluster eins wahrscheinlich weiße Kolonien enthielt. STF2-Ausdruck in Cluster eins erhöht, konsistent mit zuvor erhaltenen Daten. In den Clustern Null und zwei waren WH11 und STF2 im Vergleich zu Cluster 1 deutlich nach unten reguliert.
Androgen-Mikroben haben ein ständig wachsendes Potenzial, Um Massenprodukte für die Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten zu produzieren. Nach diesem Verfahren kann man eine Vielzahl von bioinformatischen Werkzeugen anwenden, um die Sequenzierungsdaten weiter zu analysieren.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Hochdurchsatzmethode für die Stamm-Screening in der mikrobiellen Gentechnik vor, die speziell die RNA-Sequenzierung auf Tropfenbasis zur Analyse von Hefezellen nutzt. Die Methode ermöglicht funktionelle Bewertungen genetisch veränderter Mikroben im genomweiten Maßstab.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobielle Ingenieurwissenschaft
- High-Throughput-Screening
- RNA-Sequenzierung
Hintergrund
- Funktionelle Screening-Verfahren für Mikrobenstämme sind oft langsam und ineffizient.
- Hochdurchsatzmethoden können die Geschwindigkeit dieser Bewertungen erheblich verbessern.
- Die RNA-Sequenzierung basierend auf Tröpfchen bietet einen neuartigen Ansatz zur Beurteilung mikrobieller Funktionen.
- Das Verständnis genomischer Störungen kann mikrobielle Engineering-Strategien gezielt unterstützen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnellen Screening-Methode für Hefestämme mittels RNA-Sequenzierung.
- Aufklärung der funktionellen Auswirkungen genomischer Veränderungen in gentechnisch veränderten Mikroben.
- Verbesserung der Effizienz des Design-Build-Test-Zyklus in der mikrobiellen Gentechnik.
Verwendete Methoden
- Hefe-Zellen wurden in einer bestimmten Konzentration kultiviert und vorbereitet.
- Mikrofluidik-basierte Tropfen wurden verwendet, um Hefe-Zellen einzukapseln.
- Die RNA-Sequenzierung der eingeschlossenen Zellen wurde durchgeführt, um die Genexpression zu bewerten.
- Bioinformatische Werkzeuge wurden zur Analyse der Sequenzierungsdaten angewandt.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglichte die erfolgreiche Einschließung von Hefezellen in Tropfen zur Analyse mit hoher Durchsatzrate.
- Isogene Kolonien wurden erzeugt und auf Genexpressionsmuster analysiert.
- Die Hauptkomponentenanalyse zeigte deutliche Cluster in der Genexpression.
- Die Ergebnisse wiesen auf signifikante Unterschiede in der Genexpression im Zusammenhang mit der Kolonie-Morphologie hin.
Schlussfolgerungen
- Diese Hochdurchsatzmethode verbessert die Fähigkeit, mikrobielle Stämme effizient zu screenen.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können die zukünftige Konstruktion von Mikroben für biotechnologische Anwendungen leiten.
- Der Ansatz ist auf verschiedene mikrobielle Spezies über Hefe hinaus anwendbar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Hochdurchsatz-Screening von Stämmen bleibt trotz Fortschritten in der Genomeditierung eine Engstelle in der mikrobiellen Ingenieurtechnik. Diese auf Tropfen basierende RNA-Sequenzierungsmethode ermöglicht eine genomweite funktionelle Bewertung von modifizierten Hefestämmen und adressiert direkt den Kompromiss zwischen Informationsausgabe und Durchsatz. Durch die Ableitung von phänotypischen Aussagen aus transkriptionellen Profilen unterstützt sie eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Stammselektion und beschleunigt den Design-Bau-Test-Zyklus für die Produktion von Biologika.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem genomische Modifikationen über transkriptomweite Nachweise mit funktionellen Phänotypen verknüpft werden.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Ent风险ung durch quantitative Genexpressions-Profilierung, die die Auswirkungen genetischer Editierungen auf Ebene von Signalwegen klärt.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Stämmen innerhalb eines Portfolios, indem Stämme mit gewünschten Expressionsmustern identifiziert werden, die mit Zielwegen assoziiert sind, wodurch die Abhängigkeit von Assays mit geringer Durchsatzleistung verringert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, in Tropfen eingeschlossene isogene Hefe-Kolonien, die für reproduzierbare, auf RNA-Seq basierende phänotypische Screening-Verfahren geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Verarbeitet parallel Tausende genetisch unterschiedlicher Stämme und überwindet damit die Einschränkungen traditioneller Kolonie-Auswahl- und arraybasierter Methoden.
- Datenqualität: Liefert quantitative, multiplexe Genexpressionsmessungen, die robuste Vergleiche zwischen Stamm-Bibliotheken ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Angewandt auf den Weiß-Opaqu-Schalter von Candida albicans, ein virulenzassoziiertes Phänotyp, wodurch die Nützlichkeit für die Charakterisierung pathogener Stämme gezeigt wird.
- Translationale Kontinuität: Verbindet genetische Modifikationen mit phänotypischen Ergebnissen über Expressionsbiomarker (z. B. WH11, STF2) und unterstützt die biomarkerbasierte Stammselektion.
- Präklinische Risikominderung: Ermöglicht die frühzeitige Identifizierung nicht funktionaler oder aberranter Stämme und verringert so das Ausfallrisiko in nachfolgenden Entwicklungsstufen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Workflows zur Mikrobenstamm-Engineering von der Bibliothekserstellung bis zur funktionalen Validierung und ermöglicht eine transkriptomgesteuerte Stamm-Priorisierung vor der Identifizierung von Leitstämmen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem aufgezeigt wird, wie genomische Störungen die globale Genexpression in isogenen Hintergründen beeinflussen.
- Screening: Bietet standardisierte, einsatzbereite mikrobielle Systeme mit reproduzierbaren transkriptionellen Ausgaben zur Untersuchung der Reaktion auf Verbindungen oder Bedingungen.
- Analytik: Stellt durch PCA- und tSNE-abgeleitete Expressionscluster sowie Marker-Gen-Überlagerungen bereit, die eine phänotypische Klassifizierung und Stammvergleiche ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Genotypen von Stämmen mit phänotypischen Zuständen über konservierte Marker und unterstützt so den kontinuierlichen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening von Hefe- und anderen mikrobiellen Stammbibliotheken über mehrere Projekte und therapeutische Bereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei Stamm-Funktion-Beziehungen, indem mechanistische Unschärfen durch expressionsbasierte Daten auf Genom-Ebene reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch mikrofluidische Einschließung und kontrolliertes, hydrogelbasiertes Koloniewachstum.
- Strategischer Wert: Steigert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalallokation, indem eine schnelle, mehrparametrige Stammbeurteilung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem Stämme mit molekularen Profilen, die auf gewünschte Phänotypen hindeuten, bereits früh im Entwicklungsprozess identifiziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrofluidik, Hefegenetik und der Vorbereitung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungs-Bibliotheken.
- Ist abhängig vom Zugang zu Tropfengenerierungsvorrichtungen, fluorierten Ölen, Tensiden sowie Infrastruktur für die nachgeschaltete Sequenzierung und Bioinformatik.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Herstellung von Hydrogelen, der Sphäroplastierung und der Kopplung an Kügelchen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
- Beinhaltet die Optimierung von Inkubationszeit und Medium, um ein Überwachsen der Hydrogele und das Entweichen von Zellen zu verhindern, was von der Hefestammabhängigkeit beeinflusst wird.
- Ist durch den Bedarf an transkriptionellen Biomarkern mit bekannten Phänotyp-Zuordnungen begrenzt, die eine genaue phänotypische Interpretation aus RNA-seq-Daten ermöglichen.
