In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding
1. Mai 2020
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von makromolekularem Crowding, um ein in vitro menschliches hypertrophes Narbengewebemodell zu erstellen, das in vivo-Bedingungen ähnelt. Wenn sie in einer überfüllten makromolekularen Umgebung kultiviert werden, weisen menschliche Hautfibroblasten Phänotypen, Biochemie, Physiologie und funktionelle Eigenschaften auf, die Narbengewebe ähneln.
Wir haben ein individuelles Collagen-reiches Modell entwickelt, um die Umgebung zu imitieren, die Zellen in vivo mit der makromolekularen Crowding-Technik erleben. Haut ist eine überfüllte Umgebung, im Gegensatz zu der flüssigen Umgebung, die wir bereits verwenden, um Zellen in vitro zu züchten. Im Vergleich zum traditionellen monolayern Zellkultursystem stellt dieses Modell die überfüllte molekulare Umgebung wieder her, die Zellen in vivo erleben, insbesondere in Narbengeweben, wo reichlich extrazelluläre Matrix flüssiges Wasser verdrängt.
Neben hypertrophen Narben kann diese makromolekulare Crowding-Technik für Studien verwendet werden, bei denen die extrazelluläre Matrix reichlich vorhanden ist, wie lungenfibrose. Wachsen Sie Narben abgeleitete und normale Fibroblasten nach Manuskriptrichtungen. Dann säen Sie sie in 24 Brunnenplatten bei 50.000 Zellen pro Brunnen in einem Milliliter Medium.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie makromolekulare Crowding- oder MMC-Medien vor, indem Sie Ficoll 70, Ficoll 400 und Ascorbinsäure in 10%FCS DMEM mischen. Inkubieren Sie die Medien in einem Wasserbad, um die Gedränge in die Lösung zu zerstreuen.
Dann sterilisieren Sie es mit einem 0,2 Mikrometer-Filter. Die verbrauchten Medien von den Fibroblasten abscheine und durch frisch hergestellte MMC-Medien ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für sechs Tage, und wechseln Sie alle drei Tage die MMC-Medien.
Bereiten Sie eine Sirius Red Lösung vor, indem Sie 0,2 Gramm Direct Red 80 Pulver in 200 Milliliter destilliertem deionisiertem Wasser mit einem Milliliter Essigsäure auflösen. Aspirieren Sie die MMC-Medien aus den Zellen und fügen Sie 300 Mikroliter Sirius Red Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Dann geben Sie die Zellen für 90 Minuten in den Inkubator zurück.
Nach der Inkubation die Sirius Red Lösung vorsichtig mit Leitungswasser abspülen und die Platte über Nacht trocknen lassen. Am nächsten Tag extrahieren Sie den Sirius Red, indem Sie 200 Mikroliter 0,1 Mol-Natriumhydroxid in jeden Brunnen geben und die Platte fünf bis zehn Minuten schütteln. Übertragen Sie 100 Mikroliter des extrahierten Flecks in eine transparente 96-Wellplatte und messen Sie die Absorption bei 620 Nanometern mit einem Mikroplattenleser.
Waschen Sie jeden Brunnen mit 200 Mikroliter PBS und fixieren Sie die Zellen mit Methanol bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann fügen Sie 3%BSA zu den Brunnen und inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Blockierlösung und fügen Sie 200 Mikroliter Antikollagen einen Antikörper zu jedem Brunnen hinzu.
Inkubieren Sie die Platte für 90 Minuten. Dann den Antikörper absaugen Und die Brunnen dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Fügen Sie 200 Mikroliter Ziegen-Anti-Rabbit-FITC Sekundärantikörper und DAPI zu jedem Brunnen hinzu.
Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den sekundären Antikörper und DAPI, und wiederholen Sie die Wähfe mit PBS. Dann visualisieren Sie die Fluoreszenz direkt unter dem Mikroskop.
Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie 40 Mikroliter Lysepuffer in jeden Brunnen ein und kratzen Sie die Zellschicht mit einer Pipettenspitze. Dann übertragen Sie das Proteinlysat in Mikrozentrifugenröhrchen, um die Proteinkonzentration zu messen. 10 Mikrogramm Protein in jeden Brunnen eines vier bis zwölf Prozent bis-Tris-Proteingels laden und 30 Minuten lang SDS-PAGE bei 200 Volt ausführen.
Übertragen Sie das Protein nach Fertigstellung auf eine Nitrocellulosemembran, indem Sie 90 Minuten lang einen westlichen Blot bei 90 Volt laufen lassen, wobei Darauf geachtet wird, blasenbildung zwischen Gel und Membran zu vermeiden. Blockieren Sie die Membran mit 10 Milliliter Blockierpuffer. Dann inkubieren Sie es mit primären Antikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag die Membran fünfmal mit 0,1 Prozent TBS Tween 20 für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Dann die Membran mit einem artgerechten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die Wässer und visualisieren Sie die Fluoreszenz mit einem Bildgebungssystem.
Nach der Reinigung der gesamten RNA mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer. Verwenden Sie dann ein cDNA-Synthese-Kit, um eine erste Strang-DNA-Synthese durchzuführen. Mischen Sie die cDNA mit 10 Mikroliter SYBR Green Supermix und übertragen Sie die Proben auf eine benutzerdefinierte 96 Well Platte, die mit Oligonukleotid-Primern vorbeschichtet ist.
Stellen Sie das Gesamtvolumen auf 20 Mikroliter pro Brunnen mit Wasser ein und führen Sie RT-PCR nach Manuskriptanweisungen aus. Die Zelldichte von hypertrophen Narben-abgeleiteten menschlichen Haut-Fibroblasten erhöhte sich nach der Kultivierung mit Ficoll signifikant im Vergleich zur Verwendung von PVP oder der Kontrolle. Makromolekulare Überfüllung mit Ficoll bei 9%Fraktionsvolumenbelegung verbesserte die Ablagerung von Kollagen, einschließlich Kollagen, im Vergleich zu anderen Formulierungen signifikant.
Dies wurde durch quantitative Analysen weiter demonstriert. Narben-abgeleitete Fibroblasten und normale dermale Fibroblasten, die in MMC-Umgebungen angebaut werden, regulierten zusätzlich zu Kollagen auch die Expression von ECM-Arten. Insbesondere wurde eine erhöhte Expression von Matrix-Metalloproteinasen oder MMPs gefunden, die sich in hypertrophen Narbengeweben im Vergleich zu nativen Geweben ansammelten.
Es wurde beobachtet, dass die Expression von MMP2, neun und 13 in beiden Zellkulturen, die in makromolekularen Gedränge kultiviert wurden, signifikant hochreguliert war. MMPs spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und Narbenbildung, die Regulierung der ECM-Montage und des Umbaus. Die Synthese von Interleukin sechs und vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor war nicht nachweisbar in einem westlichen Blot.
Aber RT-PCR-Analyse ergab, dass die Expression von Interleukin sechs war deutlich up-reguliert, während die Expression der vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor war down-reguliert in Fibroblasten in MMC Bedingungen kultiviert. Beim Versuch dieses Protokolls ist es sehr wichtig, dermale Fibroblasten zu wählen, die nur sehr wenige CO-Erreger haben. Wir müssen auch bedenken, dass Ascorbinsäure ein wesentlicher Bestandteil im MMC-Medium ist.
Wir sind besonders daran interessiert, die Kollagenablagerung und -ausrichtung in diesem MMC-Modell weiter zu erkennen. Wir planen, fortschrittliche mikroskopische Techniken zu verwenden, um dieses In-vitro-Modell mit nativen Narbengeweben in vivo zu vergleichen. Wir ermutigen andere, diese makromolekulare Crowding-Technik zu verwenden, um die In-vitro-Authentizität der Hilfs-Modalgewebe zu verbessern.
Natürlich kann makromolekulare Verdrängung auch verwendet werden, um Modelle von Krankheit und Pathologie in vitro neu zu berechnen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von makromolekularer Überfüllung zur Erstellung eines in-vitro-Modells für menschliches hypertrophes Narbengewebe, das in-vivo-Bedingungen ähnelt. Menschliche Hautfibroblasten weisen in einem überfüllten makromolekularen Milieu Phänotypen, biochemische und physiologische Eigenschaften sowie funktionelle Merkmale auf, die Narbengewebe ähneln.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Die Haut ist eine stark besiedelte Umgebung, im Gegensatz zu herkömmlichen Zellkulturen in flüssigem Medium.
- Hypertrophe Narben weisen einzigartige zelluläre Eigenschaften auf.
- Makromolekulare Überfüllung kann in-vivo-Bedingungen für Fibroblasten nachahmen.
- Diese Technik könnte auch auf andere Erkrankungen wie die pulmonale Fibrose anwendbar sein.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Modells, das die in-vivo-Umgebung von Narbengewebe genau widerspiegelt.
- Untersuchung des Verhaltens von Fibroblasten in einer dichten extrazellulären Matrix.
- Verbesserung des Verständnisses der Narbenbildung und verwandter Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Erstellung eines kollagenreichen Modells mithilfe makromolekularer Überlastung.
- Vergleich mit herkömmlichen Zellkultur-Systemen in Monoschicht.
- Aussaat von narbengeleiteten und normalen Fibroblasten in 24-Well-Platten.
- Verwendung spezifischer Wachstumsbedingungen gemäß den Anleitungen im Manuskript.
Hauptergebnisse
- Fibroblasten in der überfüllten Umgebung weisen narbenähnliche Eigenschaften auf.
- Das Modell ahmt erfolgreich die extrazelluläre Matrix von Narbengewebe nach.
- Die Ergebnisse deuten auf mögliche Anwendungen bei der Untersuchung anderer fibrotischer Erkrankungen hin.
- Zeigte die Bedeutung umgebungsbedingter Faktoren für das Zellverhalten auf.
Schlussfolgerungen
- Die Makromolekül-Anreicherungstechnik eignet sich zur Modellierung hypertropher Narben.
- Dieser Ansatz kann Einblicke in das Verhalten von Fibroblasten bei fibrotischen Erkrankungen liefern.
- Zukünftige Studien könnten dieses Modell für verschiedene Anwendungen im Gewebeengineering erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Durch makromolekulare Überfüllung (MMC) lassen sich In-vitro-Modelle erstellen, die das Milieu der extrazellulären Matrix menschlicher hypertropher Narben genau nachahmen und damit eine entscheidende Lücke in der translationsnahen Fibroseforschung schließen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und unterstützt die mechanistische Risikominimierung in der Pipeline für fibrotische Erkrankungen. Die physiologische Relevanz und Skalierbarkeit des Modells machen es zu einer wiederverwendbaren Plattform für fibrose- und ECM-Umbaustudien über das gesamte Portfolio hinweg.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung fibrotischer Signalwege und Mechanismen der ECM-Umbildung in einem physiologisch relevanten Kontext.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an der Kollagenablagerung und der Regulation von Matrix-Metalloproteinasen beteiligt sind.
- Erleichtert die Vorhersagbarkeit für die Weiterentwicklung von antifibrotischen Kandidaten, indem Merkmale von Narbengewebe imitiert werden, die in vivo-ähnlich sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares System zur quantitativen Beurteilung der Kollagen- und ECM-Proteinablagerung.
- Ermöglicht eine robuste Untersuchung von Substanzen, die auf die Narbenbildung und die Umgestaltung der Matrix abzielen.
- Ermöglicht die Skalierbarkeit des Assays und die Wiederverwendung der Plattform für die Analyse fibrotischer Reaktionen mit hohem Informationsgehalt.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt In-vitro-Befunde mit krankheitsrelevanten Biomarkern wie der Expression von Kollagen I, MMP2, MMP9 und MMP13 ab.
- Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung durch Modellierung der Biologie menschlichen Narbengewebes ohne Tierversuche.
- Reduziert Risiken bei der translationellen Weiterentwicklung, indem mechanistische Einblicke in die Dynamik der extrazellulären Matrix und fibrotische Signalwege bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses auf MMC basierende Modell integriert sich in die Entdeckungs- bis präklinische Kontinuum für Fibrose- und Wundheilungsprogramme.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Regulation der ECM und Aktivierung fibrotischer Signalwege in humanen Fibroblasten.
- Screening: Liefert quantitative Messwerte zur Kollagenablagerung und Expression von Matrixproteinen für die Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Ermöglicht statistische Vergleiche der expression fibrosebezogener Gene und Proteine unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Kontinuität für die Biomarkerabstimmung und mechanistischen Studien, die für die menschliche Pathologie relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare, ethisch vorteilhaftere Alternative zu Tierversuchen für die Forschung an verschiedenen fibrotischen Erkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung von Fibrosezielen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die in-vitro-Modellierung von ECM-reichen Geweben mit reproduzierbaren, skalierbaren Protokollen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalwirtschaftlichkeit, indem frühzeitige Risikominderung anti-fibrotischer Strategien ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Wirkstoffen gegen Fibrose und zur Wundheilung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur primärer humaner Fibroblasten und der Analyse der extrazellulären Matrix (ECM).
- Benötigt Zugang zu Fluoreszenzmikroskopie, Mikroplattenlesegeräten und Instrumenten der Molekularbiologie.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung von MMC-Medien und quantitativen Assay-Protokollen voraus.
- Kann mit Protokollanpassungen auf andere ECM-reiche Krankheitsmodelle, wie beispielsweise die pulmonale Fibrose, übertragen werden.
- Hängt von hochwertigen, gering kontaminierten Fibroblastenquellen und einer präzisen Handhabung der Reagenzien ab.
