Name: Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie HDX-MS die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen unter naturnahen Bedingungen untersucht. Diese Methode identifiziert funktionell wichtige Proteinregionen mit minimaler Probenmenge.

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Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dem Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, der Canadian Foundation for Innovation und den Start-up-Fonds der McGill University unterstützt.

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<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
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Wir haben nichts zu verraten.

Der in diesem Protokoll vorgestellte HDX-MS-Workflow bietet eine bemerkenswert robuste Plattform zur Kartierung der räumlichen Verteilung strukturdynamischer Elemente in Proteinen und zur Untersuchung, wie sich diese Dynamik als Reaktion auf Störungen (Ligandenbindung, Enzym-Mutagenese usw.) ändert. HDX-MS bietet mehrere deutliche Vorteile gegenüber anderen strukturbiologischen Ansätzen, die häufig zur Untersuchung der Konformationsdynamik verwendet werden. Vor allem werden nur geringe Mengen Aniis benötigt. Mithilfe des...

Proteine sind strukturell dynamische Moleküle, die verschiedene Konformationen auf Zeitskalen abtasten, die von Bindungsschwingungen im Femtosekundenmaßstab bis hin zu Umlagerungen ganzer Proteindomänen reichen, die über viele Sekunden auftreten können1. Diese Konformationsschwankungen sind oft kritische Aspekte der Enzym-/Proteinfunktion. So sind beispielsweise konforme Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, oft von entscheidender Bedeutung für die Modulation der Enzymfunktion, entweder durch die Organisation aktiver Standortrückstände, die für die Katalyse benötigt werden, die Definition von Substratbindungsstellen in sequenziellen kinetischen Mechanismen, die Abschirmung reaktiver Zwischenprodukte von der Umgebung oder durch Modulation der Enzymfunktion über allosterische Netzwerke. Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass die konforme Dynamik während der gesamten Evolution konserviert werden kann und dass Störungen zu konservierten molekularen Bewegungen mit Veränderungen der Substratspezifität und der Entstehung neuer Enzymfunktionenkorreliertwerden können 2,3.
In den letzten Jahren hat sich die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) schnell als eine leistungsstarke Technik entwickelt, um zu untersuchen, wie Proteinkonformationslandschaften auf Störungen wie Ligandenbindung oder Mutagenese4,5,6,7reagieren. In einem typischen HDX-MS-Experiment (Abbildung 1) wird ein inD2O hergestelltes Protein in einen Puffer gegeben, der den Austausch von lösungsmittelaustauschbaren Protonen durch Deuteria auslöst. Die Wechselkursrate der Amid-Feuchtigkeit der Peptidbindungen hängt stark vom pH-Wert, der lokalen Aminosäuresequenz und der lokalen strukturellen Umgebung des Amids8ab. Amide, die mit Wasserstoffbindungswechselwirkungen (wie sie in α-Helices und β-Blättern vorhanden sind) tätig sind, tauschen sich langsamer aus als Amide in unstrukturierten Regionen des Proteins, die Massenlösungsmitteln ausgesetzt sind. Somit spiegelt das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die Struktur des Enzyms wider. Enzyme, die konform dynamisch sind oder bei Ligandenbindung strukturelle Übergänge durchlaufen, würden eine messbare HDX-Antwort liefern.
Die mechanistische Grundlage für den langsamen Wechselkurs eines strukturierten Amids ist in Abbildung 25,8,9dargestellt. Um HDX zu durchlaufen, muss der strukturierte Bereich zunächst eine entfaltete Konformation vorübergehend abtasten, so dass die Lösungsmittelmoleküle, die den HDX-Austausch über einen bestimmten säure-basenchemischen Mechanismus katalysieren, Zugang zum austauschbaren Amid haben. Letztlich bestimmen die relativen Größen des chemischen Wechselkurses (kchem) und die Falt- und Umfaltraten (koffen und kschließen) die im ExperimentgemesseneHDX-Rate 5,8. Aus diesem einfachen kinetischen Modell geht klar hervor, dass das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die zugrunde liegende Konformationsdynamik widerspiegelt (wie definiert durch koffen und kclose). Die meisten HDX-MS-Experimente werden in einem Bottom-up-Workflow durchgeführt, bei dem nach der Austauschreaktion das von Interesse kommende Protein in Peptide verdaut wird und die Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid als Erhöhung der Masse7gemessen wird. Auf diese Weise ermöglicht HDX-MS die Zuordnung von Störungen der Enzym-Konformationsdynamik auf der lokalen räumlichen Skala von Peptiden, sodass der Forscher beurteilen kann, wie die Störung die Dynamik in verschiedenen Regionen des Enzyms von Interesse verändert.
Die Vorteile des HDX-MS-Ansatzes zur Aufklärung der Proteinstrukturdynamik sind zahlreich. Zunächst kann die Methode mit kleinen Mengen an nativem Protein oder auf Proteinkomplexen in Systemen mit quartärer Struktur10durchgeführt werden. Es ist nicht einmal notwendig, dass die im Test verwendete Enzympräparation hochgereinigt wird11,12, solange der Bottom-up-HDX-MS-Workflow eine ausreichende Anzahl von sicher identifizierten Peptiden bietet, die die Proteinsequenz von Interesse abdecken. Darüber hinaus kann HDX-MS Informationen über konforme Dynamiken unter nahezu nativen Bedingungen bereitstellen, ohne dass eine standortspezifische Proteinkennzeichnung erforderlich ist, wie sie in Einzelmolekülfluoreszenzstudien13verwendet würde, und es gibt keine Größenbeschränkung für den Protein- oder Proteinkomplex, die untersucht werden kann (was Ansätze wie Kernspinresonanz [NMR] Spektroskopie schwierig macht)7,14. Schließlich können zeitaufgelöste HDX-MS-Methoden eingesetzt werden, um intrinsisch ungeordnete Proteine zu untersuchen, die mit Röntgenkristallographie15,16,17,18schwer zu untersuchen sind. Die Hauptbeschränkung von HDX-MS ist, dass die Daten von geringer struktureller Auflösung sind. HDX-MS-Daten sind nützlich, um darauf hinzuweisen, wo sich die Konformationsdynamik ändert, und um gekoppelte Konformationsänderungen aufzudecken, aber sie bieten oft nicht viel Einblick in den genauen molekularen Mechanismus, der die beobachtete Veränderung antreibt. Jüngste Fortschritte in der Kombination von Elektronenfang-Dissoziationsmethoden mit Protein-HDX-MS-Daten haben gezeigt, dass Austauschstellen zu einzelnen Aminosäurerückständen19zugeordnet werden können, aber nachfolgende biochemische und strukturelle Studien sind immer noch häufig erforderlich, um Klarheit für Strukturmodelle zu schaffen, die von HDX-MS-Daten übermittelt werden.
Nachfolgend wird ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung eines HDX-MS-Assays vorgestellt20. Die nachstehend vorgestellten Probenvorbereitungsprotokolle sollten allgemein für jedes Protein gelten, das eine gute Löslichkeit in wässrigen Puffern aufweist. Speziellere Probenvorbereitungsmethoden und HDX-MS-Workflows stehen für Proteine zur Verfügung, als in Gegenwart von Waschmitteln oder Phospholipiden21,22,23,24untersucht werden müssen. Instrumentale Einstellungen für die HDX-MS-Datenerfassung werden für ein hochauflösendes Quadrupol-Massenspektrometer beschrieben, das an das Flüssigchromatographiesystem gekoppelt ist. Daten von ähnlicher Komplexität und Auflösung könnten auf einem der handelsüblichen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Systeme (LC-MS) gesammelt werden. Wichtige Aspekte der Datenverarbeitung mit einem kommerziell erhältlichen Softwarepaket werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Wir stellen auch Richtlinien für die Datenerhebung und -analyse vor, die mit den Empfehlungen der breiteren HDX-MS-Community12übereinstimmen. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die dynamischen strukturellen Eigenschaften von HalM2 zu untersuchen, einer Lanthipeptid-Synthetase, die die mehrstufige Reifung eines antimikrobiellen Peptids20katalysiert. Wir veranschaulichen, wie HDX-MS verwendet werden kann, um Substratbindungsstellen und allosterische Eigenschaften aufzudecken, die einer vorherigen Charakterisierung entgangen sind. Mehrere andere Protokolle zum Protein HDX-MS wurden in den letzten Jahren veröffentlicht25,26. Zusammen mit der vorliegenden Arbeit sollten diese früheren Beiträge dem Leser eine gewisse Flexibilität im experimentellen Design bieten.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptid B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Amicon Ultracel 10k Zentrifugalfiltrationsgerät (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>BioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Hydrochlorid</td><td>TRC Kanada</td><td>T012500</td><td>Peptid wurde auf Anfrage synthetisiert</td></tr><tr><td>Name des Materials/ der Ausrüstung</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>Version 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>Version 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>Version 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>Version 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>Version 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Name des Materials/ der Ausrüstung</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>Instrument und Ausrüstung</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytische Säule</td><td>Wasser</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Vorsäulen</td><td>Wässer</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td><td>Wässer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Wässer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotip pH-Elektrode</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Wässer Enzymat BEH Säule oder Pepsin Solumn</td><td>Wässer</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Wässer Synapt G2-Si</td><td>Wasser</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine wasserstoff-deuterium-austausch-massenspektrometrie -plattform (hdx-ms) zur untersuchung biosynthetischer peptidenzyme

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Die Wasserstoff-Deuterium-Austauschmassenspektrometrie (HDX-MS) ist eine leistungsfähige Methode zur biophysikalischen Charakterisierung von Enzymkonformationsveränderungen und Enzym-Substrat-Wechselwirkungen. Unter seinen vielen Vorteilen verbraucht HDX-MS nur geringe Mengen an Material, kann unter nahezu nativen Bedingungen ohne Enzym-/Substratkennzeichnung durchgeführt werden und kann räumlich aufgelöste Informationen über Enzymkonformationsdynamik liefern – auch für große Enzyme und Multiproteinkomplexe. Die Methode wird durch die Verdünnung des enzyms von Interesse in Puffer inD2O vorbereitet initiiert. Dies löst den Austausch von Protium in Peptidbindungsamiden (N-H) mit Deuterium (N-D) aus. An den gewünschten Austauschzeitpunkten werden Reaktions-Aliquots abgeschreckt, das Enzym in Peptide proteolysiert, die Peptide durch ultra-performance liquid chromatography (UPLC) getrennt und die Veränderung der Masse jedes Peptids (aufgrund des Austauschs von Wasserstoff gegen Deuterium) wird von MS aufgezeichnet. Die Menge der Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid hängt stark von der lokalen Wasserstoffbindungsumgebung dieses Peptids ab. Peptide, die in sehr dynamischen Regionen des Enzymaustauschdeuteriums sehr schnell vorhanden sind, während Peptide aus gut geordneten Regionen viel langsamer austauschen. Auf diese Weise berichtet die HDX-Rate über die lokale Enzymkonformationsdynamik. Störungen der Deuteriumaufnahme in Gegenwart verschiedener Liganden können dann verwendet werden, um Ligandenbindungsstellen zu kartieren, allosterische Netzwerke zu identifizieren und die Rolle der Konformationsdynamik in der Enzymfunktion zu verstehen. Hier veranschaulichen wir, wie wir HDX-MS verwendet haben, um die Biosynthese einer Art von Peptid-Naturprodukten namens Lanthipeptide besser zu verstehen. Lanthipeptide sind genetisch kodierte Peptide, die posttranslational durch große, multifunktionale, konformational dynamische Enzyme modifiziert werden, die mit traditionellen strukturbiologischen Ansätzen schwer zu studieren sind. HDX-MS bietet eine ideale und anpassungsfähige Plattform zur Untersuchung der mechanistischen Eigenschaften dieser Enzymtypen.

Es ist notwendig, die Qualität der proteolytischen Verdauung und die Reproduzierbarkeit des Workflows für jeden Satz von Probeninjektionen zu bewerten. Daher ist es vor der Durchführung von HDX-MS-Assays wichtig, wirksame Bedingungen für die Proteolyse des Proteins von Interesse, für die Trennung von Peptiden mittels Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie und Gasphasenionenmobilität sowie für den Nachweis von Peptiden mit MS zu schaffen. Zu diesem Zweck sollten zunächst die Referenzproben für das Protein von Interesse...

Lanthipeptid-Synthetasen katalysieren mehrstufige Reaktionen während der Biosynthese von Peptid-Naturprodukten. Hier beschreiben wir einen kontinuierlichen, Bottom-up, Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) Workflow, der verwendet werden kann, um die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen zu studieren, sowie andere ähnliche Enzyme, die an der Peptid-Naturproduktbiosynthese beteiligt sind.

Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Dieses Protokoll kann speziell aufgelöste Informationen über die Konformationsdynamik von Proteinen liefern. Dies kann helfen, funktionell wichtige Regionen in Proteinen von Interesse zu identifizieren. Diese Technik untersucht die Dynamik der Proteinkonformation unter nahezu nativen Bedingungen.Ohne die Notwendigkeit einer Proteinmarkierung mit nanomolarer Materialmenge für jede Reaktion. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von nicht deuterierten Referenzproben für das interessierende Protein in dreifacher Ausfertigung in 500-Mikroliter-Röhrchen. Queten Sie die Proben mit dem entsprechenden Volumen an Quench-Puffer pro Röhrchen ab, um einen pH-Messwert von 2,5 zu erreichen.Schockfrosten Sie die Proben in flüssigem Stickstoff für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius bis zu ihrer Analyse. Analysieren Sie dann die protiierten Enzym-Referenzproben mit einem Bottom-up-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Workflow gemäß Standardprotokollen. Zur Analyse der Massenspektrometrie-Rohdaten in dem entsprechenden Proteomic Softwareprogramm.Navigieren Sie zu Bibliotheken und Proteinsequenzdatenbanken, um die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins zu importieren. Geben Sie einen Namen für die gewünschte Proteinsequenz ein und importieren Sie die Proteinsequenz im FASTA-Format. Um die Verarbeitungsparameter im Menü Bibliothek zu definieren, wählen Sie Elektrospray als Datenerfassungstyp aus.Geben Sie im Feld Lock Mass for Charge 2 785,8426 für das Master-Ladungsverhältnis für die zwei plus Ionen Glucan eine Faser ohne Peptid B ein und klicken Sie auf Fertig stellen. Um die Workflow-Parameter zu definieren, wählen Sie als Suchtyp Elektrospray aus. Wählen Sie unter der Überschrift Workflow- und Datenbanksuchabfrage das im Feld Datenbank erstellte Datenbankprotein aus und ändern Sie das primäre Digest-Reagenz in unspezifisch.Um das Feld für das feste Modifikatorreagenz zu löschen, halten Sie die Steuertaste gedrückt, während Sie auf Carbamidomethyl klicken, C.To geben Sie das Ausgabeverzeichnis an, wählen Sie Optionen, Automatisierungseinrichtung und E identifizieren. Aktivieren Sie dann die Kontrollkästchen Apex 3D- und Peptid-3D-Ausgabe und Ionenabrechnungsausgabe. Geben Sie das gewünschte Verzeichnis an. Um die referenzierten Probendaten zu verarbeiten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Mikrotiterplatte, um eine neue Platte zu erstellen.Klicken Sie mit der linken Maustaste in eine Vertiefung, und ziehen Sie sie in drei weitere Vertiefungen, um für jede referenzierte Probe eine Vertiefung hervorzuheben. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Rohdaten hinzufügen aus. Navigieren Sie im Fenster zu dem Verzeichnis, das die drei referenzierten Dateien enthält, und wählen Sie alle drei Dateien gleichzeitig aus.Klicken Sie auf Weiter und wählen Sie die definierten Verarbeitungsparameter aus. Klicken Sie erneut auf Weiter und wählen Sie die definierten Workflow-Parameter aus. Klicken Sie dann auf Fertig stellen.Sobald die Rohdaten, Verarbeitungsparameter und Workflow-Parameter den einzelnen Vertiefungen auf der Platte zugewiesen wurden, werden die Vertiefungen blau. Wählen Sie die Vertiefungen aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Neueste Rohdaten verarbeiten aus. Um die Verarbeitung der Daten nachzuverfolgen, klicken Sie auf die rechte untere Ecke des Fensters.Wenn kein Auftrag zum Ausführen angezeigt wird, ist die Verarbeitung abgeschlossen und die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte werden grün. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Vertiefungen, und wählen Sie Workflow-Ergebnisse anzeigen aus. Für jede referenzierte Datendatei öffnet sich ein separates Fenster.Überprüfen Sie die Daten, um sicherzustellen, dass die Mehrheit der Massenspektrometriesignale in den referenzierten Probendaten erfolgreich auf die Peptide abgebildet wurde, die aus dem In-silico-Verdau des interessierenden Proteins vorhergesagt wurden. Übereinstimmende Peptide erscheinen im Ausgangsspektrum blau. Doppelklicken Sie auf den Okay-Filter und überprüfen Sie, ob die prozentuale Abdeckung größer als 99 % ist. Importieren Sie die Ausgabe der Proteomic Software in die Software zur Verarbeitung von Wasserstoff-Deuterium-Austausch, um zusätzliche Schwellenwerte festzulegen.Klicken Sie auf Daten und PLGS-Ergebnisse importieren. Klicken Sie auf das Symbol Hinzufügen und navigieren Sie zum entsprechenden Verzeichnis, um die verarbeiteten Datendateien auszuwählen. Klicken Sie auf Weiter und legen Sie die maximale Anzahl aufeinanderfolgender Ionen auf größer oder gleich zwei fest.Der Massenfehler auf fünf Teile pro Million. Und den Dateischwellenwert auf drei, und klicken Sie dann auf Fertig stellen. Um Wasserstoff-Deuterium-Austauschreaktionen durchzuführen, aliquot Quenchpuffer in 500-Mikroliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie kurz, um den gesamten Quench-Puffer auf den Boden jedes Röhrchens zu übertragen. Stellen Sie die Röhrchen mit der abgeschreckten Lösung auf Eis. Anschließend mischen Sie alle deuterierten Reaktionskomponenten in einem separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen vor.Dann überführen Sie das Reaktionsgemisch für eine 10-minütige Inkubation in ein 25 Grad Celsius warmes Wasserbad. Fügen Sie den deuterierten Reaktionskomponenten ein Enzym hinzu, um die Austauschreaktion zu starten. Mischen Sie den Reaktionsinhalt gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren.Zu den entsprechenden experimentellen Austauschzeitpunkten werden 50 Mikroliter Aliquote aus jeder Wasserstoff-Deuterium-Austauschreaktion entfernt. Und mischen Sie die Reaktionen schnell und gleichmäßig mit einem Aliquot eiskaltem Quenchpuffer in einzelnen 500-Mikroliter-Röhrchen. Dann verschließen Sie sofort die Röhrchen für das Schockfrosten in flüssigem Stickstoff.Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Analyse bereit sind. Nach dem Auftauen der gefrorenen Proben werden die deuterierten Enzym-Referenzproben mit dem gleichen Bottom-up-Bottom-up-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Workflow analysiert, der für die nicht deuterierten Referenzproben entwickelt wurde. Nachdem Sie die LCMS-Daten für die deuterierten Proben gesammelt haben, importieren Sie die Daten zur Datenverarbeitung in das zuvor erstellte Wasserstoff-Deuterium-Austauschprojekt.Klicken Sie auf Neuer Zustand und Neue Belichtung, um die biochemischen Zustände bzw. Deuterium-Expositionszeiten zu definieren, die für die Analyse relevant sind. Klicken Sie auf New Raw, um die zu analysierenden Wasserstoff-Deuterium-Austauschdatendateien auszuwählen. Und weisen Sie jeder Rohdatendatei, die importiert wird, die entsprechenden Austauschzeiten und den biochemischen Zustand zu.Wählen Sie zur Analyse und Visualisierung der Daten das erste Peptid in der Peptidliste aus und öffnen Sie das gestapelte Spektraldiagramm aus dem Menü Ansichten. Klicken Sie mit der Maus, um die Zuweisung von Sticks nach Bedarf aufzuheben und sicherzustellen, dass die richtige Isotopenverteilung in den Daten gefunden wurde. Und dass jedem Isotopenpeak zugewiesen wurde.Um die Stick-Zuweisungen für jeden Ladungszustand zu überprüfen, schalten Sie den Ladungszustand oben im Fenster für das gestapelte Spektraldiagramm um. Um die Standardabweichung der Peptid-Deuterium-Aufnahmewerte im Menü "Ansichten" zu überprüfen, wählen Sie die Abdeckungskarte aus. Dadurch wird jedes Peptid in der Peptidliste angezeigt, das entlang der Aminosäuresequenz des interessierenden Proteins abgebildet ist.Färchen Sie die Peptide nach relativer Standardabweichung ein und durchsuchen Sie die Karte visuell nach Ausreißerpeptiden mit der hohen relativen Standardabweichung. Klicken Sie auf die Ausreißerpeptide in der Abdeckungskarte, um die gestapelten Spektraldiagramme und das Datenanzeigefenster mit dem Zielpeptid zu füllen. Zeigen Sie die Interessendifferenz in der Abdeckungskarte an, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Karte, um die Differenzdaten in eine CSV-Datei zu exportieren.Importieren Sie die Differenz- und Zustandsdaten sowie die PDB-Datei des interessierenden Proteins in Deuteros. Wählen Sie das Konfidenzintervall von 99 % aus, und aktivieren Sie Summe, und verarbeiten Sie die Daten. Wählen Sie dann unter pi mol Export, Aufnahme und Export aus, um ein PyMOL-Skript zu generieren, das die Regionen mit signifikantem Austauschunterschied auf die PDB-Struktur des Proteins von Interesse in der PyMOL-Software abbildet.Diese repräsentativen Gesamtionenchromatogramme für drei Referenzproben der Hal-M2-Lambda-Peptid-Synthetase zeigen die zeitabhängigen Änderungen in der Summe aller Ionenzahlen bei allen Werten des Masse-Ladungs-Verhältnisses, die im Massenspektralscan enthalten sind. Die Form und Intensität des Gesamtionenchromatogrammprofils sollte ähnlich sein. Dies deutet darauf hin, dass der proteolytische Verdau von Hal-M2 reproduzierbar ist.Und ist in allen drei Referenzproben von ähnlicher Effizienz. Auch die Massenspektren über ein bestimmtes Zeitintervall sollten ähnlich sein. Dies gibt die Gewissheit, dass ähnliche Peptide in jeder Probe vorhanden sind und zu ähnlichen Zeiten aus der C18-Säule anspielen.Die meisten Peptide in den deuteriumausgetauschten Proben sollten offensichtliche Verschiebungen in ihren Isotopenverteilungen hin zu höheren Werten des Masse-Ladungs-Verhältnisses aufweisen. Diese Daten deuten beispielsweise darauf hin, dass ein erheblicher Teil der Deuteriummarkierung während des gesamten Verlaufs der Datenerfassung zur Säureabschreckung, zum Pepsinaufschluss und zur Massenspektrometrie der Flüssigchromatographie beibehalten wurde. Nach der beschriebenen Charakterisierung der biochemischen Eigenschaften des Enzyms können repräsentative Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie-Ergebnisse wie diese generiert werden.Zur Veranschaulichung der Bindung des Hal-A2-Vorläuferpeptids an den Hal-M2 AMP, PMP-Komplex. Die Wasserstoff-Deuterium-Austauschreaktionen müssen in konsistenter Weise vorbereitet und abgeschreckt werden. Und Sie müssen methodisch vorgehen, wenn Sie die Deuteriumaustauschwerte für zahlreiche nachgewiesene Peptide bestimmen.Die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie liefert Informationen auf Peptidebene und dynamische Konformationsänderungen von Proteinen. Die funktionelle Relevanz eines etwaigen Wasserstoff-Deuterium-Austauschs sollte für Meter Genesis validiert werden. Und orthogonale Aktivitätsassays.

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurde erfolgreich genutzt, um die Amid-Wasserstoff / Deuterium-Austausch in Proteinkinase PAK2 Aktivierung überwachen.

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch &amp; MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Protein-Konformation und Dynamik sind der Schlüssel zum Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. Wasserstoffaustausch gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie ist eine vielseitige Methode, um die Konformationsänderungen Dynamik von Proteinen als auch studieren Charakterisierung von Protein-Ligand und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich Kontaktschnittstellen und allosterische Effekte.

Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Festkörper-Amid-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und die Festkörper-Photolytische Markierungs-Massenspektrometrie (ssPL-MS) für Proteine in festen Pulvern. Die Methoden liefern hochauflösende Informationen über die Proteinkonformation und -wechselwirkungen im amorphen Festkörper, die für das Formulierungsdesign nützlich sein können.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Eines der schwierigsten Stressbedingungen, die Organismen im Laufe ihres Lebens zu begegnen bedeutet die Anhäufung von Oxidantien. Bei oxidativem Stress Zellen auf Molekulare Chaperone angewiesen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zu untersuchen, die Redox-regulierte Anti-Aggregation Tätigkeit, als auch strukturelle Veränderungen, die EZB der Chaperon-Funktion mit HDX-MS zu überwachen.

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Hier wird ein Protokoll für einen Kapillarelektrophorese-basierten Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX)-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-Massenspektrometrie vorgestellt. Dieser Ansatz charakterisiert den Unterschied in Strukturen höherer Ordnung zwischen verschiedenen Proteinspezies, einschließlich Proteinen in verschiedenen Zuständen und verschiedenen Proteoformen, indem er gleichzeitig differentielle HDX- und elektrophoretische Trennung durchführt.

Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Das strukturelle Ensemble des monomeren Alpha-Synucleins beeinflusst seine physiologische Funktion und seine physikalisch-chemischen Eigenschaften. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie und anschließende Datenanalysen durchgeführt werden können, um Konformationsinformationen über das Monomer dieses intrinsisch ungeordneten Proteins unter physiologischen Bedingungen zu bestimmen.

Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung der Alpha-Synuclein-Strukturdynamik unter physiologischen Bedingungen

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Verschiedene Methoden zu manipulieren, dreidimensionalen Architektur in Protein-basierte Hydrogele werden hier in Bezug auf die Materialeigenschaften ausgewertet. Die makroporöse Netze sind mit einer Zelle-Klebstoff-Peptid funktionalisiert und deren Umsetzbarkeit in der Zellkultur wird ausgewertet, mit zwei verschiedenen Modell-Zelllinien.

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Erfahren Sie, wie HDX-MS die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen unter naturnahen Bedingungen untersucht. Diese Methode identifiziert funktionell wichtige Proteinregionen mit minimaler Probenmenge.

Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme

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