Aufbau der Kapillarelektrophorese-Induktiv gekoppelte Plasmamassenspektrometrie (CE-ICP-MS) zur Quantifizierung von Eisenredoxarten (Fe(II), Fe(III))
4. Mai 2020
Diese Eisen-Redox-Speziation methode basiert auf kapillarer Elektrophorese-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie mit Probenstapelung kombiniert mit kurzer Analyse in einem Durchlauf. Die Methode analysiert schnell und bietet niedrige Quantifizierungsgrenzen für Eisen-Redox-Arten in einer Vielzahl von Geweben und Biofluidproben.
Übermäßiges Eisen führt zu freiem Redox-aktivem Eisen-Zwei-plus, das verheerende Auswirkungen innerhalb der Zelle verursachen kann, wie oxidativen Stress und Zellsterben durch Lipidperoxidation, die als Ferroptose bekannt ist. Quantitative Messungen von Eisen- und Eiseneisen sind der Schlüssel für einen genaueren Einblick in diese schädlichen Prozesse. Diese CE-ICP-Ms-Technik bietet sowohl eine schnelle Analyse als auch niedrige Quantifizierungsgrenzwerte, die beide für die Quantifizierung von Eisen-Redox-Arten erforderlich sind.
Wählen Sie zunächst einen Vernebler mit einem geringen selbstansaugenden Volumen aus und bereiten Sie die entsprechenden Teile vor, um die hausgemachte Schnittstelle zu montieren. Schließen Sie zwei dreiseitige Buchsen mit einem männlichen Kegel-Luer-Stecker an, indem Sie das linke Ende der unteren Drei-Wege-Luerstange mit dem Stecker und dem Stecker stecker an die mittlere Verbindung des oberen Drei-Wege-Luers anschließen. Als nächstes legen Sie ein ein Zentimeter langes Rohr über den Platindraht und verwenden Sie ein ein Zentimeter Silikonrohr, um das erste Rohr und die Düse eines männlichen Luer-Steckers zu verbinden.
Befestigen Sie die Baugruppe an der mittleren Verbindung des unteren Drei-Wege-Luer-Steckers durch Schraubendrehung. Schieben Sie ein ein Zentimeter langes Rohr über den Auslass der CE-Kapillare und positionieren Sie es acht bis neun Zentimeter vom Ende entfernt, und verbinden Sie es dann mit einem Silikonrohr an die Düse des männlichen Luer-Steckers. Legen Sie die gesamte Baugruppe durch die Stange des oberen Drei-Wege-T-Steckers und fixieren Sie den männlichen Luer-Stecker und das linke Ende des weiblichen Drei-Wege-Luer-Steckers durch Schraubendrehung.
Dann fixieren Sie das 25 Zentimeter große Silikonrohr an der Düse eines männlichen Luer-Steckers und fixieren Sie die gesamte Baugruppe an der Unterseite der Stange vom unteren Drei-Wege-Köderverbinder. Schieben Sie das ein Zentimeter lange Silikonrohr fest, fünf Millimeter über das Ende des Verneblers. Während der zweite männliche Luer-Kegel-Anschluss in den hervorstehenden Teil des Rohres gesteckt wird.
Bewegen Sie den Interface-Teil mit der hervorstehenden CE-Kapillare zum männlichen Kegel am Vernebler, dann legen Sie die Kapillare vorsichtig durch den männlichen Kegel und den breiteren Teil der Verneblerkapillare ein. Stellen Sie bei Bedarf die Länge der hervorstehenden Kapillare ein, indem Sie den linken männlichen Luer abschrauben, den Luer mit angeschlossenen Rohren in die gewünschte Position bewegen und neu installieren. Die oberen weiblichen Drei-Wege-Luer-Anschlüsse sollten eng am männlichen Kegel passen.
Wenn Sie mit dem Setup fertig sind, fahren Sie mit ICP-Ms fort. Kalibrierkurven wurden für Eisen drei und Eisen zwei Redox-Arten erstellt. Die Nachweisgrenzen lagen bei 3,1 Mikrogramm pro Liter für Eisen zwei und 3,2 Mikrogramm pro Liter für Eisen drei und die Linearität wurde bis zu 150 Mikrogramm pro Liter nachgewiesen.
Die Analyse des SH-SY5Y-Zelllysats zeigte aufgrund der etwas höheren Leitfähigkeit eine etwas langsamere Migration bei Eisenredoxarten. Die gemessenen Konzentrationen von Eisen drei und Eisen zwei betrugen 330 Mikrogramm pro Liter bzw. 84 Mikrogramm pro Liter. Das Ergebnis ergibt ein Eisen-Verhältnis von 2 zu 3 von 0,25.
Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist das sorgfältige Einsetzen der hervorstehenden CE-Kapillare durch die montierte Schnittstelle und deren geeignete Positionierung im Zusammenhang mit der Verneblerkapillare. Die hier vorgestellten Methoden können zu einem vielversprechenden Werkzeug werden, um den Einblick in eisenabhängige molekulare Prozesse zu vertiefen. Sorgfältig ausgearbeitete Studien sind erforderlich, um zu validieren, ob Eisen zwei-plus, Eisen Drei-plus-Quantifizierung kann als potenzieller Biomarker dienen, um Gewebe zu lokalisieren, das Risiko für eisenvermittelte tödliche Schäden im Zusammenhang mit neurodegenerativen und Krebserkrankungen.
Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Methode zur Eisen-Redoxspeziation unter Verwendung der Kapillarelektrophorese gekoppelt mit massenspektrometrischer Detektion mittels induktiv gekoppeltem Plasma (CE-ICP-MS) vor. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Analyse sowie niedrige Bestimmungsgrenzen für Eisen-Redoxspezies in verschiedenen Geweben und Bioflüssigkeiten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biokemie
- Analysenchemie
Hintergrund
- Überschüssiges Eisen kann zu oxidativem Stress und Zelltod führen.
- Die quantitative Messung von zweiwertigem und dreiwertigem Eisen ist entscheidend für das Verständnis dieser Prozesse.
- Ferroptose ist eine Form des Zelltods, die mit Eisenüberladung in Verbindung steht.
- Bestehende Methoden liefern möglicherweise nicht die erforderliche Schnelligkeit und Empfindlichkeit für die Eisenquantifizierung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnellen und empfindlichen Methode zur Quantifizierung von Eisen-Redox-Spezies.
- Untersuchung der Bedeutung der Eisenquantifizierung bei neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs.
- Validierung des Potenzials der Eisenquantifizierung als Biomarker für Gewebeschäden.
Verwendete Methoden
- Kapillarelektrophorese-gekoppelt mit massenspektrometrischer Detektion mittels induktiv gekoppeltem Plasma (CE-ICP-MS).
- Probenvorbereitung unter Verwendung einer selbstgebauten Schnittstellenanordnung.
- Kalibrierkurven für die Redoxspezies Eisen(II) und Eisen(III).
- Analyse von SH-SY5Y-Zelllysaten zur Bestimmung der Eisenkonzentration.
Hauptergebnisse
- Die Nachweisgrenzen betrugen 3,1 µg/L für Eisen zwei und 3,2 µg/L für Eisen drei.
- Eine lineare Antwort wurde bis zu 150 µg/L beobachtet.
- Die gemessenen Konzentrationen lagen bei 330 µg/L für Eisen drei und 84 µg/L für Eisen zwei.
- Das Verhältnis von Eisen zwei zu drei betrug 0,25.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist aussichtsreich für die Untersuchung eisenabhängiger molekularer Prozesse.
- Sorgfältige Vorbereitung ist entscheidend für genaue Messungen.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die Rolle der Eisenquantifizierung in Krankheitszusammenhängen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung der Eisen-Redox-Spezies (Fe(II)/Fe(III)) ist entscheidend für das Verständnis eisenvermittelter zellulärer Schäden in neurodegenerativen und onkologischen Kontexten. Die CE-ICP-MS-Methode ermöglicht einen schnellen und empfindlichen Nachweis dieser Spezies in komplexen biologischen Matrizes und unterstützt so die frühe mechanistische Entschärfung therapeutischer Hypothesen, die oxidative Stress- und Ferroptose-Wege betreffen. Diese Fähigkeit verbessert die Zielvalidierung, indem sie quantitative, redoxspezifische Biomarker für die Portfolio-Priorisierung in Entdeckungsprogrammen bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung der Eisen-Redox-Homöostase als therapeutische Hypothese in Krankheitsmodellen.
- Operationaler Wert: Liefert redoxspezifische quantitative Messgrößen, um die mechanistischen Wege des eiseninduzierten Zelltods aufzuklären.
- Prädiktiver Wert: Stärkt die Zielhypothesensicherheit basierend auf Biomarkern, indem Fe(II)/Fe(III)-Verhältnisse mit oxidativem Stress und Ferroptose-Ergebnissen korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Ermöglicht niedrige Nachweisgrenzen (3,1–3,2 µg/L) und lineare Antwort bis zu 150 µg/L, wodurch eine zuverlässige Quantifizierung in verdünnten Lysaten und Bioflüssigkeiten möglich ist.
- Reproduzierbarkeit: Zeigt eine Präzision der Migrationszeit von <3 % und eine Messpräzision von 2,2–3,5 %, was konsistente Ergebnisse bei der Verbindungsscreening ermöglicht.
- Skalierbarkeit: Die Leitfähigkeits-pH-Stapelung erlaubt höhere Injektionsvolumina, ohne die Trennleistung zu beeinträchtigen, und verbessert so den Durchsatz bei der Assay-Validierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die Messung von Eisen-Redox-Spezies in SH-SY5Y-Lysaten und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und verknüpft damit die Entdeckung mit krankheitsrelevanten Systemen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Die hohe Wiederauffindungsgenauigkeit (97–105 %) und die Bestätigung durch Standardaddition unterstützen eine zuverlässige Biomarker-Quantifizierung für Go/No-Go-Kriterien.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Ermöglicht die Bewertung von Strategien zur Modulation von Eisen, indem direkte Nachweise von Fe(II)- und Fe(III)-Spezies in präklinischen Modellen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die CE-ICP-MS-Methode lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows integrieren, indem sie redoxspezifische quantitative Daten liefert, die die Validierung von Zielstrukturen und die Identifizierung von Leitverbindungen unterstützen, insbesondere für Signalwege, die eisenabhängigen oxidativen Stress beinhalten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bei Eisenstörungen in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen und Krebserkrankungen durch speziesaufgelöste Quantifizierung.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays mit niedriger Bestimmungsgrenze (LOQ) und hoher Präzision und damit die zuverlässige Beurteilung von Substanzeffekten auf Eisen-Redoxzustände.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse basierend auf Peakflächen und Migrationszeitmetriken, die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen sowie Trendanalysen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Bietet Anschluss an die präklinische Validierung über messbare Eisenspezies in Zelllysaten und Bioflüssigkeiten und unterstützt so die Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Plattformunabhängige Detektion mittels ICP-MS ermöglicht die Nutzung über Eisen hinaus für mehrere weitere Elementziele und erhöht so die langfristige Nützlichkeit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem er die Beiträge von Fe(II) und Fe(III) zum oxidativen Stress und zur Ferroptose unterscheidet.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch stapelungsverstärkte Trennung und Verringerung von Interferenzen im DRC-Modus.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem quantitative Redox-Biomarker bereitgestellt werden, die mit pathologischen Eisenzuständen verknüpft sind.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf deren Einfluss auf die Eisenspeziation in krankheitsrelevanten Modellen.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Einrichtung der Kapillarelektrophorese und der Optimierung der ICP-MS voraus, insbesondere im DRC-Modus mit NH3 als Reaktionsgas.
- Hängt von einer stabilen Schnittstellenkonstruktion zwischen der CE-Kapillare und dem Nebulizer ab, um die Signalintegrität aufrechtzuerhalten und Redoxverschiebungen zu vermeiden.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich der Hintergrundelektrolytlösung (20 mM HCl) und der Spannung (+25 kV), um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
- Erfordert eine Anpassung an Proben mit variabler Leitfähigkeit (z. B. Zerebrospinalflüssigkeit) unter Verwendung der Standardaddition zur Bestätigung der Peakidentifizierung.
- Praktische Einschränkung: Die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber Matrixeffekten der Probe erfordert eine Verdünnung oder Standardisierung, um eine genaue Quantifizierung in komplexen Körperflüssigkeiten zu gewährleisten.
