Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode

Unser Protokoll beschreibt die neuen Erkenntnisse zur Trennung und Reinigung aktiver Moleküle aus einem Pflanzenextrakt. Wissenschaftler können diese Methoden verwenden, um kleine Moleküle und Peptide aus natürlichen Produktquellen für therapeutische Anwender zu isolieren. Machen Sie sich mit den Instrumentenkomponenten und deren Montagemethoden vertraut.

Es ist wichtig, sicher zu sein, dass die zu trennende Probe durch die vorgeschlagenen Leitlinien vorbereitet wird. Diese Methode umfasst mehrere Montageprozesse des Instruments. Und die visuelle Demonstration wird Benutzern helfen, sie zu verfolgen und erfolgreich auf die Forschung anzuwenden.

Nach der Montage der flüssigen Phase, IEF-Einheit, wie in der Bedienungsanleitung beschrieben, equilibrate die Anionenaustauschmembranen mit 0,1 Mol Natriumhydroxid und die Kationenaustauschmembranen mit 0,1 Molphosphorsäure. Richten Sie die Gummidichtungen so aus, dass die drei großen längs langen Löcher durch den Gummi entsperrt bleiben. Dies wird dazu beitragen, die Ionen zwischen der Elektrode und den Probenteilen über die Membran während der Elektrophorese auszutauschen.

Montieren Sie den inneren und äußeren Teil der Elektrode, indem Sie die drei längs langen Löcher in den Ionenaustauschdichtungen ausrichten. Dann füllen Sie die Elektroden mit ihren jeweiligen Elektrolyten, um zu verhindern, dass ihre Membranen austrocknen. Ziehen Sie als nächstes den Kunststoff-Schraubenhalter fest, um eine leckagefreie Montage zu gewährleisten.

Bedecken Sie die Probensammelbretter mit Dichtband. Als nächstes montieren Sie die Teile der Fokussierkammer über den keramischen Kühlfinger in der folgenden Reihenfolge: Anodenelektrode, Nylonmembrankern, Fokussierkammer und Kathodenelektrode. Mit einer 50-Milliliter-Spritze die Fokussierkammer mit vorgekühltem destilliertem Wasser füllen.

Für eine Standard-IEF-Zelle 60 Milliliter Wasser hinzufügen. Schließen Sie das IEF-Gerät an zirkulierendes Kühlwasser bei vier Grad Celsius an. Betreiben Sie das Gerät mit 15 Watt und 3000 Volt, bis sich die Spannung stabilisiert, etwa drei bis fünf Minuten.

Schalten Sie dann die Stromquelle aus. Entfernen Sie mit dem Fraktionskollektor das Wasser aus der Zelle. Versiegeln Sie die Sammelbretter mit Dichtband.

Fügen Sie 0,6 Gramm Gymnema sylvestre Pflanzenextrakt, zu 60 Milliliter destilliertes Wasser. Den Pflanzenextrakt durch Mischen in einem Rollenrohr für fünf Minuten auflösen. Um die unlöslichen Partikel zu entfernen, zentrifugieren Sie diese Lösung fünf Minuten lang bei 10.000 mal G.

Übertragen Sie den Überstand auf einen 150 Milliliter Glasbecher und fügen Sie Ampholyt hinzu, um eine 1%-Lösung nach Volumen zu erstellen, etwa 0,6 Milliliter. Mit einer 50-Milliliter-Spritze mit einer 1,5 Zoll 19 Gauge stumpfen Endnadel, laden Sie diese Lösung in die IEF-Zelle durch die Probensammeltafeln. Entfernen Sie dann die Zelle aus dem Ständer und tippen Sie auf die Elektrodenkammer, um blasen zu lösen und zu entfernen.

Schließen Sie das Gerät an das Kühlwasser an. Mit der Stromversorgung auf konstante 15 Watt beginnen Fraktionierung. Führen Sie die IEF-Einheit aus, bis die Spannung einen konstanten Wert von etwa drei Stunden erreicht.

Nach dem Drücken der Ernte auf Knopf richten Sie die FraktionskollektorStifte mit den Sammelbrettern aus. Drücken Sie die Stifte durch das Dichtband, um mit dem Sammeln der Gymnema sylvestre Fraktionen zu beginnen. Wachsen Sie eine einzige Kolonie von C.albicans und Hefe Pepiton Dextrose Brühe über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln.

Übertragen Sie die Kultur auf ein Zentrifugenrohr und sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes die Hefezellen im Puffer aufhängen und die Suspension in einem Rollenrohr für eine Stunde bei fünf Grad Celsius drehen. Um die Hefezellen zu entfernen, zentrieren Sie die Suspension bei 10.000 mal G für fünf Minuten.

Dann filtern Sie den Proteinextrakt durch einen 0,45 Mikrometer Filter. Übertragen Sie den Proteinextrakt auf Dialyseschläuche und Dialyse gegen Wasser für 15 Stunden bei vier Grad Celsius. Nach der Schätzung der Proteinkonzentration, sammeln Sie ein Volumen von Protein-Extrakt mit 500 Milligramm Gesamtprotein.

Verdünnen Sie die 500 Milligramm Protein in 60 Milliliter Wasser mit 1%Ampholyt Volumen. Mit einer Spritze den verdünnten Proteinextrakt in die IEF-Zelle laden und vier Stunden lang konstant 15 Watt bedienen. Da dieses Gerät eine Hochspannungsstromversorgung verwendet, muss der Benutzer alle Vorkehrungen treffen, um einen direkten Kontakt mit den Lebendenelektroden zu vermeiden.

Der Fraktionssammler enthält 20 Kunststoffrohre mit jeweils 12 Millimetern und 75 Millimetern. Und es ist mit der Vakuumpumpe verbunden. Bereiten Sie sich darauf vor, die Fraktionen zu sammeln, indem Sie die Ernte auf Knopf drücken.

Richten Sie dann die 20 Sammelstifte auf dem Fraktionskollektor mit der 20 Sammelplatine aus, sodass die versiegelte Fokussierzelle. Drücken Sie die Sammelstifte durch das Dichtband und schalten Sie gleichzeitig die Vakuumpumpe ein. Jede Röhre sammelt einen Proteinanteil von etwa drei Millilitern.

Nach dem Reduzieren und Kochen der Proteinfraktionen, analysieren Sie sie auf einem 12,5%SDS-Seitengel. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blue Farbstoff und legen Sie es auf eine Wippe bei Raumtemperatur. Nach zwei bis drei Stunden das Gel destain.

Nehmen Sie dann das Gelbild mit einem Gel-Imager auf. Bereiten Sie eine Hefezellsuspension vor, indem Sie eine Nachtkultur von C.albicans im Verhältnis 1:1000 im RPMI-Zellkulturmedium verdünnen, ergänzt mit 50 Millimolar Glukose. Fügen Sie 90 Mikroliter der Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu.

Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter jeder G.sylvestre Fraktion zu getrennten Brunnen hinzu. Als Negativkontrolle, fügen Sie 10 Mikroliter Wasser mit 1%Ampholyt in separate Brunnen. Nachdem Sie die 96-Wellplatte 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop.

Der Mangel an fadenförmigem Wachstum deutet auf die Hemmung der C.albicans Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung hin. Zwanzig Fraktionen des G.sylvestre-Extraktes wurden durch flüssige Phase IEF gewonnen. Dunkel gefärbte Moleküle, die Gymnemsäuren, wanderten zu und wurden am Anodenende der Einheit angereichert.

Am Kathodenende wurden transluzente hellgelbe Fraktionen beobachtet. Aliquots aus jeder G.sylvestre Brechung wurden reduziert, gekocht und durch SDS-Seite aufgelöst. Ein Coomassie Blue Fleck zeigte ein anderes Polypeptidband bei etwa fünf Kilodaltonen, angereichert mit den Fraktionen 16 bis 19.

Die Gymnemic Säuren in Fraktion eins, und die nächsten paar Fraktionen wurden nicht nachgewiesen, da sie nicht proteinaceous sind. Diese Moleküle können jedoch durch TLC getrennt und unter UV-Licht detektiert werden. Fraktion 10 enthielt keine nachweisbare Menge dieser kleinen Moleküle, was darauf hindeutet, dass die meisten organischen kleinen Moleküle in Den fraktionen eins bis drei angereichert wurden.

Alle 20 G.sylvestre Fraktionen wurden auf Hemmung der Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung und Das Hyphenwachstum bei C.albicans geprüft. Die größte Hemmung wurde in Fraktion eins beobachtet und wenig bis gar keine Hemmung wurde in den Fraktionen 10 und höher beobachtet. Zelloberflächenproteine von C.albicans wurden mit der flüssigen Phase IEF fraktioniert.

Und Aliquots aus 18 Fraktionen wurden per SDS-Seite analysiert. Angereicherte Proteine waren in mehreren Fraktionen sichtbar. Der Anfang, kleine Moleküle konnten nicht durch isoelektrische Fokussierung getrennt werden, weil sie geglaubt werden, um nicht ambulant zu sein.

Unsere Studien zeigen, dass sie ambulant sind, zumindest wöchentlich, und diese Methode kann für andere kleine Moleküle weiter erforscht werden.