Name: Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie die präparative Isoelektrische Fokussierung zur Trennung bioaktiver kleiner Moleküle und Peptide aus Pflanzenextrakten. Diese Methode ermöglicht die Isolierung therapeutisch wertvoller Verbindungen.

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Wir sind dankbar für die Finanzierungsquellen der Division of Biology und des Johnson Cancer Research Center für BRIEF- und IRA-Auszeichnungen bzw. an GV. Wir danken auch dem K-INBRE Postdoktorandenpreis an RV. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20 GM103418 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of General Medical Sciences oder der National Institutes of Health dar. Wir danken den anonymen Rezensenten für ihre hilfreichen Kommentare.

1. Einrichtung und Vorlauf der Standard-Flüssigphasen-IEF-Einheit
<ol><li>Montieren Sie die flüssigen Phasen-IEF-Elektroden (anodenroter Knopf und Kathoden-Schwarzknopf) mit ihren jeweiligen Austauschmembranen gemäß der Bedienungsanleitung (siehe Materialtabelle). Gleichgewichten Sie die Anionenaustauschmembranen mit 0,1 M NaOH und die Kationenaustauschmembranen mit 0,1 M H3PO4 mindestens für 16 h, wenn neue Membranen verwendet werden.<ol>
<li>Bewahren Sie die Membranen zwischen den Durchläufen in Elektrolyten (0,1 M NaOH oder 0,1 M H3PO4) auf und lassen Sie sie nicht austrocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montieren Sie den inneren und äußeren Teil der Elektrode, indem Sie drei längs in den Ionenaustauschdichtungen ausrichten. Füllen Sie die Elektroden mit entsprechenden Elektrolyten (ca. 25-30 ml), um ein Austrocknen ihrer Membranen zu verhindern.<ol>
<li>Fügen Sie keinen überschüssigen Elektrolyten (mehr als 1/3rd des Elektrodenkammervolumens) hinzu, der Druck innerhalb der Elektrode aufbauen und Leckagen verursachen kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bedecken Sie die Probenentnahmeports mit Dichtungsband, das mit den Instrumentenbaugruppenteilen enthalten ist (siehe Tabelle der Materialien). Die Seite der Probenentnahmeanschlüsse kann durch die beiden vertikalen Metallausrichtungsstifte identifiziert werden. Alternativ können Sie Standard-Dichtungsband verwenden, um die Anschlüsse zu versiegeln.</li>
	<li>Montieren Sie alle Teile der Fokussierkammerbaugruppe nacheinander (Anodenelektrode, Nylonmembrankern, Fokussierkammer und Kathodenelektrode) über den keramischen Kühlfinger.</li>
	<li>Füllen Sie die Fokussierkammer mit vorgekühltem destilliertem Wasser (Gesamtvolumen von 60 ml für die Standard-IEF-Zelle) mit einer 50 ml Spritze.</li>
	<li>Schließen Sie das Flüssigphasen-IEF-Instrument an ein zirkulierendes Kühlwasser bei 4 oC an und führen Sie das Gerät bei 15 W und 3.000 V für 3-5 min voroder bis sich die Spannung stabilisiert. HINWEIS: Im Allgemeinen erreicht die Spannung innerhalb einer Minute die maximalen solligen Werte. Das Vorlaufen mit destilliertem Wasser hilft, die Restionen aus der Fokussierkammer und dem Nylonmembrankern zu entfernen.</li>
	<li>Schalten Sie die Stromquelle aus und entfernen Sie das Wasser aus der Zelle mit dem Fraktionskollektor. Versiegeln Sie die Sammelanschlüsse erneut mit Dichtband. HINWEIS: Jetzt ist das Instrument in Schritt 2.4 einsatzbereit.</li>
</ol>2. Trennung und Reinigung von kleinen Molekülen und Peptiden aus Gymnema sylvestre Extrakt
<ol><li>0,6 g Pflanzenextrakt messen und in destilliertem Wasser (60 ml) durch Mischen in einem Rollenrohr für 5 min auflösen. HINWEIS: Jede biologische Probe, die löslich und salzfrei ist, kann mit diesem IEF-Instrument zur Trennung und Reinigung verwendet werden. Proben mit puffernder Salzkonzentration bis zu 10 mM können mit leicht verringerter Auflösung verwendet werden. Wir interessieren uns für die Saponin-Familie von Triterpenoid-Verbindungen, die Gymnemsäuren, aus G. sylvestre Pflanze für ihre einzigartigen antimykotischen Eigenschaften16.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den löslichen Pflanzenextrakt bei 10.000 x g für 5 min, um unlösliche Partikel zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand (ca. 60 ml) auf ein 80 ml Zentrifugenrohr und mischen Sie ihn mit 0,6 ml Ampholyt (pH 3-10) auf 1% (v/v).</li>
	<li>Befolgen Sie die Schritte 1.1 – 1.7, um die Flüssigphasen-IEF-Einheit vorzubereiten. Die Kammer ist nun bereit, die Probe zu laden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 50 ml Spritze mit einer 1-1/2 Zoll 19 G stumpfen Endnadel (kommt mit dem Instrument) und laden Sie die vorbereitete Probe mit Ampholyt (60 ml gesamt) in die Zelle durch Probenentnahmeports.</li>
	<li>Entfernen Sie Luftblasen aus der Probenzelle, indem Sie die Fokussierzelle aus dem Ständer entfernen und auf die Elektrodenkammer tippen, um die Blasen zu lösen. Das Vorhandensein von Luftblasen wird Spannungs- und Stromschwankungen verursachen und den Lauf beeinflussen.</li>
	<li>Schließen Sie das Gerät an das Wasserkühlmittel (4 °C) an und starten Sie die Fraktionierung mit dem Netzteil bei konstant 15 W.</li>
	<li>Führen Sie das Gerät 3 h oder bis die Spannung einen konstanten Wert erreicht. HINWEIS: Wenn die Probe beginnt zu fokussieren, beginnt die Spannung allmählich zu klettern, bis sie einen konstanten Wert erreicht.</li>
	<li>Nach dem Lauf bereiten Sie sich darauf vor, die mit der Vakuumpumpe verbundenen Fraktionen im Erntekasten (mit 20 Kunststoffrohren, 12 mm x 75 mm, 5-6 ml Volumen) zu sammeln, die mit der Vakuumpumpe verbunden sind, indem Sie den Ernteknopf EIN in der IEF-Einheit drücken.</li>
	<li>Richten Sie die 20-Sammlungs-Pins an den 20-Sammlungs-Ports der Fokussierzelle aus, die mit dem Band versiegelt ist.</li>
	<li>Drücken Sie die Sammelstifte durch das Dichtband und schalten Sie die Vakuumpumpe gleichzeitig ein (siehe Abbildung 2B, 2C & 2D). HINWEIS: Etwa 3 ml Fraktionen aus jeder Kammer werden für jedes Mal in die Rohre gesammelt. Fraktionen können für nachfolgende nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden (SDS-PAGE für Peptidquantifizierung, TLC und Bioassay für kleine Moleküle).</li>
</ol>3. Trennung und Reinigung von Proteinen aus C. albicans
<ol><li>Einzelne Kolonie von C. Albicans in Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Brühe16 bei 30 °C mit Schütteln (200 U/min) für die Nacht wachsen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation (10.000 x g für 5 min).</li>
	<li>Hefezellen in Ammoniumcarbonat (1,89 g/L) mit einem Beta-Mercaptoethanol (1/10 des Kulturvolumens) in einem Walzenrohr um 1 h bei 5 °C15drehen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Hefezellen durch Zentrifugation (10.000 x g für 5 min) und filtern Sie den Proteinextrakt durch einen 0,45 m Filter. HINWEIS: Proteinproben aus C. albicans Cytosol, Membran oder Zellwand können für die IEF-Fraktionierung hergestellt und verwendet werden. Ebenso können Proteine aus Bakterien oder anderen biologischen Proben (Tiergewebeextrakt) nach Entfernung von Salz durch geeignete Methoden(z. B.durch Dialyse oder mit Entsalzungssäulen) verwendet werden.</li>
	<li>Dialyse den Proteinextrakt in einem Dialyseschlauch (3.500 MWCO) gegen Wasser für 15 h bei 4 °C. Schätzen Sie die Proteinkonzentration nach der Bradford-Färbebindungsmethode unter Verwendung von Gammaglobulin als Standard17.</li>
	<li>Verwenden Sie 500 mg Gesamtprotein in 60 ml Wasser, das 1% (v/v) Ampholyt (pH 5-8) für die Fraktionierung enthält. HINWEIS: Da ein Breitbereichs-Ampholyt (pH 3-10) bestimmte nicht glucan-gebundene Zellwandproteine von C. albicans nicht gut anreichert, verwenden Sie ein Engbereichs-Ampholyt (pH 5-8). Eine Ampholytkonzentration von bis zu 2% kann verwendet werden, wenn die Probenproteinkonzentration mehr als 2 mg/ml beträgt; Dies minimiert die Proteinaggregation während der Fokussierung. Bewahren Sie die Proben, Ampholyten und Wasser immer auf Eis auf.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.1- 1.7, um die IEF-Einheit vorzubereiten, und verwenden Sie die Proteinlösung ab Schritt 3.6, um sie in die IEF-Zelle zu laden.</li>
	<li>Nach 4 h Fokussierung bei konstant 15 W, Ernten Sie Proteinfraktionen (1-20) wie oben beschrieben (Schritte 2.9-2.11) und analysieren Sie auf 12,5% SDS-PAGE nach Reduktion und Kochen der Proteinproben18.</li>
	<li>Färben Sie die gelösten Proteine, indem Sie das SDS-PAGE-Gel mit dem Coomassie-Blaufarbstoff färben (0,01%) Lösung für 2-3 h bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Entzähen Sie das Gel und zeichnen Sie das Gelbild mit einem Gel-Imager auf. HINWEIS: Coomassie blauer Farbstoff (0,01%) kann durch Mischen von 0,01 g Coomassie-Blaupulver in einer entzähnten Lösung mit 40% Methanol und 10% Essigsäure hergestellt werden.</li>
</ol>4. Bioaktivität von gereinigten kleinen Molekülen aus Pflanzenextrakt Gymnema sylvestre
<ol><li>Wachsen Sie C. albicans in Hefezellen wie in Schritt 3.1.</li>
	<li>Zur Vorbereitung der Zellsuspension die Nachtkultur von C. albicans Hefezellen (1/1000 Verdünnung) in ein frisches RPMI-Zellkulturmedium, das mit 50 mM Glukose ergänzt wird. HINWEIS: C. Albicans wandelt von Hefewachstum zu Hyphen unter Hyphal-induzierenden Bedingungen um (RPMI bei 37 °C). Gymnemic Säure kleine Moleküle werden gezeigt, um die Umwandlung von Hefezellen in Hyphen unter Hypha induzierenden Bedingungen zu hemmen16. Wir wollten herausfinden, ob flüssigphasen-IEF-getrennte G. sylvestre Extrakt diese bioaktiven Moleküle enthalten.</li>
	<li>Von der vorbereiteten Zellsuspension 90 l zu jedem Brunnen der 96-Well-Platte hinzufügen.</li>
	<li>Aus jeder Fraktion (1-20 geerntete Fraktionen des G. sylvestre Extraktes aus flüssiger Phase IEF, Abbildung 4),fügen Sie 10 l in die Brunnen mit 90 l der oben genannten Zellsuspension (Schritt 4.2) hinzu. Führen Sie den Test in dreifacher Ausführung durch.</li>
	<li>Fügen Sie 10 l Wasser hinzu, das Ampholyt enthält (1%) in separate Brunnen mit 90 l C. albicans Hefezellsuspension als Negativkontrolle. HINWEIS: Ampholyten haben Bioaktivitätspotenzial und daher ist es wichtig, eine Ampholyt-Kontrolle bei der Durchführung eines Bioassays19einzuschließen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 °C für 12 h und beobachten Sie die Hemmung der C. albicans Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung unter dem Mikroskop16. Bestimmen Sie auch den Prozentsatz der Hemmung der Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren möchten keine konkurrierenden finanziellen Interessen erklären.

Kleine Moleküle aus natürlichen Produktquellen (z. B. Pflanzen) umfassen komplexe sekundäre Metaboliten, die in der chemischen Struktur sehr unterschiedlich sind. Es wird angenommen, dass sie an Pflanzenabwehrmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind Polypeptide auch in Pflanzengeweben22vorhanden. Diese natürlichen Produkt kleine Moleküle sind reiche Quellen von Testmolekülen für die Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten. Die schwierigen und mühsamen Methoden, die für ihre Isolierung u...

Die Reinigung von Biomolekülen aus komplexen biologischen Proben ist ein wesentlicher und oft schwieriger Schritt in biologischen Experimenten1. Isoelektrische Fokussierung (IEF) eignet sich gut für die hochauflösende Trennung komplexer Biomoleküle, bei denen Trägerampholyten nach ihrer Ladung reisen und den pH-Gradienten in einem elektrischen Feld3festlegen. Die erste kommerzielle Trägerampholyte für IEF wurde 1964 von Olof Vesterberg entwickelt und4,5patentiert. Trägerampholyte sind aliphatische Oligo-Amino-Oligo-Carbonsäuremoleküle unterschiedlicher Länge und Verzweigung6. Anschließend verbesserten Vesterberg und andere die Trägerampholyten für ihren erweiterten Einsatz bei der Trennung von Biomolekülen6,7.
Zu den Methoden zur Trennung von Biomolekülen gehören Agarose und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE), isoelektrische Fokussierung, Kapillarelektrophorese, Isotachophorese und andere chromatographische Techniken (z.B. TLC, FPLC, HPLC)2. Liquid-Phase IEF in einem Instrument namens "Rotofor" durchgeführt wurde von Milan Bier8erfunden. Er war Pionier des Konzepts und der Gestaltung dieses Instruments und trug maßgeblich zur Theorie der elektrophoretischen Migration bei. Sein Team entwickelte auch ein mathematisches Modell des elektrophoretischen Trennverfahrens für Computersimulationen9.
Das Flüssigphasen-IEF-Gerät ist eine horizontal rotierende zylindrische Zelle, die aus einem Nylonkern besteht, der in 20 poröse Fächer und einen zirkulierenden Wasserkühlkeramikstab unterteilt ist. Die porösen Kammern ermöglichen es Molekülen, durch die wässrige Phase zwischen den Elektroden zu wandern und die Sammlung von gereinigten Proben unter Vakuum in Fraktionen zu ermöglichen. Dieses Reinigungssystem kann bis zu 1000-fache Reinigung eines bestimmten Moleküls in <4 Stunden ermöglichen. Ein wertvolles Merkmal dieses Instruments ist, dass es als erster Schritt für die Reinigung aus einer komplexen Mischung oder als letzter Schritt zur Erreichung der Reinheit10angewendet werden kann. Wenn das Molekül von Interesse ein Protein ist, ist ein weiterer Vorteil, dass seine native Konformation während der Trennung erhalten bleibt.
Die Verwendung von Flüssigphase IEF wurde weithin für Proteine, Enzyme und Antikörper-Reinigung6,10,11,12,13,14berichtet. Hier beschreiben wir die Verwendung dieses Ansatzes zur Trennung und Reinigung kleiner Moleküle und Peptide von der Heilpflanze Gymnema sylvestre. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, aktive kleine Moleküle aus einem Pflanzenextrakt für nachgelagerte Anwendungen kostengünstig zu konzentrieren und zu reinigen. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass die Anreicherung von Proteinen aus einem komplexen Proteinextrakt aus Candida albicans Pilz15 in diesem IEF-basierten System als zweites Beispiel.

<table><tbody><tr><td>0,45 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Fisher scientfic</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207861-500</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Lyte 3/10 Ampholyte</td><td>Bio-Rad</td><td>163-1113</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td><td>Bio-Rad</td><td>163-1192</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktes Niedertemperaturthermostat</td><td>Lauda - Brinkmann</td><td>RM 6T</td><td>Stellen Sie die Wasserkühlung auf 4 oC ein und sie kann sogar bei 0 oC betrieben werden, denn wenn sie durch den Rotofor-Kühlkern läuft, liegt die Temperatur des zirkulierenden Wassers je nach Spannung bei etwa 5 oder mehr.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch (3.500 MWCO)</td><td>Spectrum Spectra/Por</td><td>132112T</td><td></td></tr><tr><td>Gymnema Pflanzenblattextrakt Pulver (>25% Gymnemischsäuren)</td><td>Suan Farma, NJ USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Laborbegleiter</td><td>SI 300R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM 6B</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Elektrophorese</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Mettler Toledo</td><td>S20</td><td>Nützlich zur Bestimmung des pH-Werts der Rotofor (Flüssigphasen-IEF)-Fraktionen</td></tr><tr><td>Rotofor</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2972</td><td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Bedienungsanleitung für den Zusammenbau des Geräts)</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>HyClone</td><td>DH30255.01</td><td></td></tr><tr>Es kann auch <td>Dichtungsband</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2960</td><td>Scotch Tape verwendet werden.</td></tr><tr><td>Sorvall legend micro 17 Zentrifuge</td><td>Thermo scientific</td><td>75002432</td><td></td></tr><tr><td>TPP Gewebekulturplatte -96 Well flacher Boden</td><td>TPP</td><td>TP92696</td><td></td></tr></tbody></table>

trennung von bioaktiven kleinen molekülen, peptiden aus natürlichen quellen und proteinen aus mikroben durch präparative isoelektrische fokussierung (ief) methode

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Natürliche Produkte aus Pflanzen und Mikroben sind eine reiche Quelle bioaktiver Moleküle. Vor ihrer Verwendung müssen die aktiven Moleküle aus komplexen Extrakten für nachgeschaltete Anwendungen gereinigt werden. Es gibt verschiedene chromatographische Methoden für diesen Zweck zur Verfügung, aber nicht alle Labore können sich Hochleistungsmethoden leisten und die Isolierung von komplexen biologischen Proben kann schwierig sein. Hier zeigen wir, dass präparative flüssige Phasen-Isoelektrische Fokussierung (IEF) Moleküle, einschließlich kleiner Moleküle und Peptide, von komplexen Pflanzenextrakten trennen kann, basierend auf ihren isoelektrischen Punkten (pI). Wir haben die Methode zur komplexen biologischen Probenfraktionierung und Charakterisierung eingesetzt. Als Beweis des Konzepts, Wir fraktioniert einen Gymnema sylvestre Pflanzenextrakt, Isolierung einer Familie von Terpenoid Saponin kleine Moleküle und ein Peptid. Wir haben auch eine effektive mikrobielle Proteintrennung mit dem Candida albicans Pilz als Modellsystem demonstriert.

Trennung und Reinigung von kleinen Molekülen und Peptiden aus Gymnema sylvestre Pflanzenextrakt Mit der präparativen Flüssigphase IEF-Methode fraktionierten wir medizinische Pflanzenextrakte und Zelloberflächenproteine aus einem menschlichen pathogenen Pilz, C. albicans. Ein Schaltplan dieser Fraktionierungsprotokolle ist in Abbildung 1dargestellt.
Aus 20 Fraktionen des G. sylvestre-Extrakts aus flüssiger Phase IEF wu...

Ziel ist es, bioaktive kleine Moleküle, Peptide aus einem komplexen Pflanzenextrakt und Proteine aus pathogenen Mikroben durch die Anwendung der Flüssigphasen-Isotonisierungsmethode (IEF) zu fraktionieren und zu isolieren. Darüber hinaus wurden die getrennten Moleküle identifiziert und ihre Bioaktivität bestätigt.

Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Unser Protokoll beschreibt die neuen Erkenntnisse zur Trennung und Reinigung aktiver Moleküle aus einem Pflanzenextrakt. Wissenschaftler können diese Methoden verwenden, um kleine Moleküle und Peptide aus natürlichen Produktquellen für therapeutische Anwender zu isolieren. Machen Sie sich mit den Instrumentenkomponenten und deren Montagemethoden vertraut.Es ist wichtig, sicher zu sein, dass die zu trennende Probe durch die vorgeschlagenen Leitlinien vorbereitet wird. Diese Methode umfasst mehrere Montageprozesse des Instruments. Und die visuelle Demonstration wird Benutzern helfen, sie zu verfolgen und erfolgreich auf die Forschung anzuwenden.Nach der Montage der flüssigen Phase, IEF-Einheit, wie in der Bedienungsanleitung beschrieben, equilibrate die Anionenaustauschmembranen mit 0,1 Mol Natriumhydroxid und die Kationenaustauschmembranen mit 0,1 Molphosphorsäure. Richten Sie die Gummidichtungen so aus, dass die drei großen längs langen Löcher durch den Gummi entsperrt bleiben. Dies wird dazu beitragen, die Ionen zwischen der Elektrode und den Probenteilen über die Membran während der Elektrophorese auszutauschen.Montieren Sie den inneren und äußeren Teil der Elektrode, indem Sie die drei längs langen Löcher in den Ionenaustauschdichtungen ausrichten. Dann füllen Sie die Elektroden mit ihren jeweiligen Elektrolyten, um zu verhindern, dass ihre Membranen austrocknen. Ziehen Sie als nächstes den Kunststoff-Schraubenhalter fest, um eine leckagefreie Montage zu gewährleisten.Bedecken Sie die Probensammelbretter mit Dichtband. Als nächstes montieren Sie die Teile der Fokussierkammer über den keramischen Kühlfinger in der folgenden Reihenfolge: Anodenelektrode, Nylonmembrankern, Fokussierkammer und Kathodenelektrode. Mit einer 50-Milliliter-Spritze die Fokussierkammer mit vorgekühltem destilliertem Wasser füllen.Für eine Standard-IEF-Zelle 60 Milliliter Wasser hinzufügen. Schließen Sie das IEF-Gerät an zirkulierendes Kühlwasser bei vier Grad Celsius an. Betreiben Sie das Gerät mit 15 Watt und 3000 Volt, bis sich die Spannung stabilisiert, etwa drei bis fünf Minuten.Schalten Sie dann die Stromquelle aus. Entfernen Sie mit dem Fraktionskollektor das Wasser aus der Zelle. Versiegeln Sie die Sammelbretter mit Dichtband.Fügen Sie 0,6 Gramm Gymnema sylvestre Pflanzenextrakt, zu 60 Milliliter destilliertes Wasser. Den Pflanzenextrakt durch Mischen in einem Rollenrohr für fünf Minuten auflösen. Um die unlöslichen Partikel zu entfernen, zentrifugieren Sie diese Lösung fünf Minuten lang bei 10.000 mal G.Übertragen Sie den Überstand auf einen 150 Milliliter Glasbecher und fügen Sie Ampholyt hinzu, um eine 1%-Lösung nach Volumen zu erstellen, etwa 0,6 Milliliter. Mit einer 50-Milliliter-Spritze mit einer 1,5 Zoll 19 Gauge stumpfen Endnadel, laden Sie diese Lösung in die IEF-Zelle durch die Probensammeltafeln. Entfernen Sie dann die Zelle aus dem Ständer und tippen Sie auf die Elektrodenkammer, um blasen zu lösen und zu entfernen.Schließen Sie das Gerät an das Kühlwasser an. Mit der Stromversorgung auf konstante 15 Watt beginnen Fraktionierung. Führen Sie die IEF-Einheit aus, bis die Spannung einen konstanten Wert von etwa drei Stunden erreicht.Nach dem Drücken der Ernte auf Knopf richten Sie die FraktionskollektorStifte mit den Sammelbrettern aus. Drücken Sie die Stifte durch das Dichtband, um mit dem Sammeln der Gymnema sylvestre Fraktionen zu beginnen. Wachsen Sie eine einzige Kolonie von C.albicans und Hefe Pepiton Dextrose Brühe über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln.Übertragen Sie die Kultur auf ein Zentrifugenrohr und sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes die Hefezellen im Puffer aufhängen und die Suspension in einem Rollenrohr für eine Stunde bei fünf Grad Celsius drehen. Um die Hefezellen zu entfernen, zentrieren Sie die Suspension bei 10.000 mal G für fünf Minuten.Dann filtern Sie den Proteinextrakt durch einen 0,45 Mikrometer Filter. Übertragen Sie den Proteinextrakt auf Dialyseschläuche und Dialyse gegen Wasser für 15 Stunden bei vier Grad Celsius. Nach der Schätzung der Proteinkonzentration, sammeln Sie ein Volumen von Protein-Extrakt mit 500 Milligramm Gesamtprotein.Verdünnen Sie die 500 Milligramm Protein in 60 Milliliter Wasser mit 1%Ampholyt Volumen. Mit einer Spritze den verdünnten Proteinextrakt in die IEF-Zelle laden und vier Stunden lang konstant 15 Watt bedienen. Da dieses Gerät eine Hochspannungsstromversorgung verwendet, muss der Benutzer alle Vorkehrungen treffen, um einen direkten Kontakt mit den Lebendenelektroden zu vermeiden.Der Fraktionssammler enthält 20 Kunststoffrohre mit jeweils 12 Millimetern und 75 Millimetern. Und es ist mit der Vakuumpumpe verbunden. Bereiten Sie sich darauf vor, die Fraktionen zu sammeln, indem Sie die Ernte auf Knopf drücken.Richten Sie dann die 20 Sammelstifte auf dem Fraktionskollektor mit der 20 Sammelplatine aus, sodass die versiegelte Fokussierzelle. Drücken Sie die Sammelstifte durch das Dichtband und schalten Sie gleichzeitig die Vakuumpumpe ein. Jede Röhre sammelt einen Proteinanteil von etwa drei Millilitern.Nach dem Reduzieren und Kochen der Proteinfraktionen, analysieren Sie sie auf einem 12,5%SDS-Seitengel. Färben Sie das Gel mit Coomassie Blue Farbstoff und legen Sie es auf eine Wippe bei Raumtemperatur. Nach zwei bis drei Stunden das Gel destain.Nehmen Sie dann das Gelbild mit einem Gel-Imager auf. Bereiten Sie eine Hefezellsuspension vor, indem Sie eine Nachtkultur von C.albicans im Verhältnis 1:1000 im RPMI-Zellkulturmedium verdünnen, ergänzt mit 50 Millimolar Glukose. Fügen Sie 90 Mikroliter der Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu.Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter jeder G.sylvestre Fraktion zu getrennten Brunnen hinzu. Als Negativkontrolle, fügen Sie 10 Mikroliter Wasser mit 1%Ampholyt in separate Brunnen. Nachdem Sie die 96-Wellplatte 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop.Der Mangel an fadenförmigem Wachstum deutet auf die Hemmung der C.albicans Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung hin. Zwanzig Fraktionen des G.sylvestre-Extraktes wurden durch flüssige Phase IEF gewonnen. Dunkel gefärbte Moleküle, die Gymnemsäuren, wanderten zu und wurden am Anodenende der Einheit angereichert.Am Kathodenende wurden transluzente hellgelbe Fraktionen beobachtet. Aliquots aus jeder G.sylvestre Brechung wurden reduziert, gekocht und durch SDS-Seite aufgelöst. Ein Coomassie Blue Fleck zeigte ein anderes Polypeptidband bei etwa fünf Kilodaltonen, angereichert mit den Fraktionen 16 bis 19.Die Gymnemic Säuren in Fraktion eins, und die nächsten paar Fraktionen wurden nicht nachgewiesen, da sie nicht proteinaceous sind. Diese Moleküle können jedoch durch TLC getrennt und unter UV-Licht detektiert werden. Fraktion 10 enthielt keine nachweisbare Menge dieser kleinen Moleküle, was darauf hindeutet, dass die meisten organischen kleinen Moleküle in Den fraktionen eins bis drei angereichert wurden.Alle 20 G.sylvestre Fraktionen wurden auf Hemmung der Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung und Das Hyphenwachstum bei C.albicans geprüft. Die größte Hemmung wurde in Fraktion eins beobachtet und wenig bis gar keine Hemmung wurde in den Fraktionen 10 und höher beobachtet. Zelloberflächenproteine von C.albicans wurden mit der flüssigen Phase IEF fraktioniert.Und Aliquots aus 18 Fraktionen wurden per SDS-Seite analysiert. Angereicherte Proteine waren in mehreren Fraktionen sichtbar. Der Anfang, kleine Moleküle konnten nicht durch isoelektrische Fokussierung getrennt werden, weil sie geglaubt werden, um nicht ambulant zu sein.Unsere Studien zeigen, dass sie ambulant sind, zumindest wöchentlich, und diese Methode kann für andere kleine Moleküle weiter erforscht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Trennung komplexer Moleküle aus Pflanzenextrakten mittels isoelektrischer Fokussierung in der flüssigen Phase. Diese Technik hilft dabei, komplexe Biomoleküle in ihrem nativen Zustand zu reinigen, die für verschiedene Downstream-Anwendungen verwendet werden können.

Isoelektrische Fokussierung in der Flüssigphase: Eine Elektrophoresetechnik zur Trennung bioaktiver Moleküle aus rohem Gymnema sylvestre-Extrakt

Eine Methode für die massenspektrometrische Analyse von endogenen Peptiden in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) wird vorgestellt. Durch den Einsatz von Molekulargewicht Cut-off-Filtration, chromatographische Pre-Fraktionierung, massenspektrometrischen Analyse und eine anschließende Kombination von Peptid-Identifikation-Strategien, war es möglich, die bekannten CSF Peptidome fast um das Zehnfache im Vergleich zu erweitern zu früheren Studien.

Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis

Kapillare isoelektrischen Fokussierung ist eine Antikörper-basierten, empfindsamen, hoher Durchsatz-Technik, ermöglicht detaillierte Charakterisierung von Proteinen und deren Isoformen von extrem kleinen biologischen Proben. Im folgenden beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Proteinen und deren Isoformen robotisierte und automatisierte.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Ein detailliertes Protokoll wird für die Trennung, Identifikation und Charakterisierung von Proteoforms in Proteinproben mit Kapillare Zone Elektrophorese-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (CZE-ESI-MS/MS) beschrieben. Das Protokoll kann für die hochauflösende Charakterisierung von Proteoforms in einfachen Proteinproben und der großen Identifikation von Proteoforms in komplexen Proteom Proben verwendet werden.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Hier stellen wir Ihnen ein optimiertes On-Filter-Verdauungsprotokoll mit detaillierten Informationen zu folgenden Themen vor: Proteinverdauung, Peptidreinigung und datenunabhängige Erfassungsanalyse. Diese Strategie wird auf die Analyse von exprimierenden Prostatasekreten-Urinproben angewendet und ermöglicht eine hohe Proteomabdeckung und eine etikettenfreie Profilierung des Harnproteoms.

Proteomisches Profil von EPS-Urin durch FASP-Verdauung und datenunabhängige Analyse

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen durch differentielle Ultrazentrifugation und Extraktion des Peptidoms zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie.

Identifizierung von Peptiden kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen aus dem Knochenmark

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung, Ernte und Konzentration von sezernierten Proteinen von Mycobacterium tuberculosis. Kulturfiltratproteine (CFPs) werden quantifiziert, durch isoelektrische Fokussierung in 20 Fraktionen getrennt und mit einem präparativen SDS-PAGE und einem Elektroelutionssystem weiter in 30 Fraktionen aufgelöst.

Trennung und Fraktionierung von Kulturfiltratproteinen (CFPs) aus Mycobacterium tuberculosis

Dieses Protokoll trennt unlösliche Zellwand- und Membranproteine in einfache Fraktionen (1-5 Proteine) unter Verwendung der präparativen isoelektrischen Fokussierung (IEF) auf der Grundlage des isoelektrischen Punktes, gefolgt von der Trennung nach Molekulargewicht. Die resultierenden Fraktionen können ohne weitere Reinigung direkt für die immunologische und proteomische Analyse verwendet werden.

Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik

Erfahren Sie die präparative Isoelektrische Fokussierung zur Trennung bioaktiver kleiner Moleküle und Peptide aus Pflanzenextrakten. Diese Methode ermöglicht die Isolierung therapeutisch wertvoller Verbindungen.

Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode (Video) | JoVE Journal

Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode

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