Name: Live-Cell Imaging des Lebenszyklus des bakteriellen Raubtiers Bdellovibrio bacteriovorus mittels Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Erfahren Sie Live-Cell-Imaging des Lebenszyklus von Bdellovibrio bacteriovorus mittels Time-Lapse-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung prädativer Bakterien und deren Interaktionen.

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Diese Studie wurde vom National Science Centre Grant Opus 2018/29/B/NZ6/00539 an J.Z.C. unterstützt.

1. Herstellung von B. bakteriovorus Lysat zur mikroskopischen Analyse
<ol><li>In einem 250 ml-Kolben die Kokultur durch Kombination von 1 ml frischer 24-h-B.-B.-B.-B.-B.-Kultur (z. B. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) und 3 ml über Nacht Beutekultur (z.B. E. coli S17-1 pZMR100) mit 50 ml Ca-HEPES Puffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7.6]) bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt (hier 50 g/m Kanamycin). B. bacteriovorus</li>
	<li>Die Cokultur für 24 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen/min inkubieren.</li>
	<li>Prüfen Sie, ob die Beutezellen vollständig durch eine flüssig montierte Phasenkontrastmikroskopie lysiert werden. An dieser Stelle sollten zahlreiche motile Angriffsphase B. bakteriovorus Zellen vorhanden sein, und keine E. coli-Zelle oder Bdelloplast sollte sichtbar sein.</li>
	<li>Filtern Sie die B. bakteriovorus Kultur durch einen 0,45 m Poren-Größenfilter, um alle verbleibenden Wirtszellen zu entfernen. Raubzellen (0,3–0,5 x 0,5–1,4 m) dringen frei in 0,45 m Poren ein, während Wirtszellen auf der Filteroberfläche zurückgehalten werden.</li>
	<li>Drehen Sie das Filtrat 20 min bei 2469 x g und 30°C in einem 50 ml konischen Rohr, um Raubzellen zu sammeln. Das B. bakteriovorus Pellet in 3 ml Ca-HEPES-Puffer (auf eine endgültige OD600 von ca. 0,2) wieder aufheben und bei 30 °C und 200 Umdrehungen pro Minute für 30 min inkubieren.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Wirtszellen für B. bakteriovorus Invasion
<ol><li>Verwenden Sie eine einzelne Kolonie des Wirtsstamms(E. coli S17-1 pZMR100 wird aufgrund verschiedener Zellgrößen empfohlen, die zur Bildung von ungleich großen Bdelloplasten führen), um 10 ml YT-Medium zu impfen (0,8% Bacto Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl [pH = 7,5]), die bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt wurde (hier 50 g/mL Kanamycin). Kulturzellen über Nacht bei 37 °C und 180 Rpm.</li>
	<li>Überträgt 2 ml E. coli-Kultur (OD600 von 3,0) in ein 2 ml Reagenzglas und Zentrifuge bei Raumtemperatur (RT) und 2469 x g für 5 min. Setzen Sie das Pellet in 200 L Ca-HEPES-Puffer wieder aus.</li>
</ol>3. Aufbau des Mikroskops (siehe Materialtabelle)
<ol><li>Vordem Vorwärmen einer mikroskopischen Kammer mit einem 100-fachen Öl-Eintauchobjektiv auf 30 °C für mindestens 1 h. Dieser Schritt ist erforderlich, um Fehler bei der Fokussierung während des Experiments zu vermeiden.</li>
	<li>Schalten Sie sowohl die Mikroskopie- als auch die Mikroskopie-Automatisierung ein. Initialisieren Sie die Steuerungssoftware und wählen Sie die geeigneten Filter aus, um je nach Bedarf Hellfeld-/DIC/Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder zu erfassen (hier: BF-Bilder, GFP/mCherry-Polychromfilter und Emission/Erregung für mCherry und GFP).</li>
</ol>4. Montage von Layouts für die Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Mischen Sie 200 mg niedrigfluoreszierende molekulare Agarose mit 20 ml Ca-HEPES-Puffer (1% endgantiöse Agarose-Konzentration) und lösen Sie die Agarose in einer Mikrowelle auf. Die Charge kann mehrmals nach der Erstarrung wiederverwendet werden, also wiederholen Sie einfach den Heizschritt.</li>
	<li>Gießen Sie 3 ml geschmolzene Agarose in eine 35 mm Glasbodenschale (Tisch der Materialien). Lassen Sie die Agarose verfestigen.</li>
	<li>Mit einem Labor-Mikrospachtel, entfernen Sie vorsichtig das Agarose-Pad von der 35-mm-Schale, ohne den Mittelpol des Agarose-Pads zu stören. Drehen Sie das Pad unten nach oben und legen Sie es in eine Petrischale Abdeckung (Abbildung 2).</li>
	<li>Legen Sie 5 l konzentrierte E. coli Suspension auf das gekippte Pad und verteilen Sie Zellen im Mittelpol mit einer Impfschleife. Die konzentrierte B. bakteriovorus Suspension (OD600 von 0,2) wird auf die E.coli-beschichtete Oberfläche aufgebracht. Verteilen Sie die Zellen nicht.</li>
	<li>Das Agarose-Gel schnell auf die 35 mm Glasbodenschale (obere Seite nach unten) zurückgeben und dann mit einem Deckel abdecken. Entfernen Sie bei Bedarf Luftblasen, indem Sie den Agar vorsichtig gegen die Platte drücken.</li>
</ol><img alt="Aufbaudiagramm für bakterielle Experimente; Petrischale, E. coli, B. bacteriovorus, inverses Mikroskop." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Schematische Darstellung des experimentellen Workflows. Das Agarose-Pad wird aus der 35-mm-Schale entfernt und gekippt, so dass die untere Seite nach oben zeigt. Frische Suspensionen von Raubzellen und über Nacht Kultur von Beutezellen werden auf dem gekippten Pad platziert, um die "untere" Seite zu beschichten. Das Agarose-Pad wird dann in seine ursprüngliche Ausrichtung gekippt und in der 35-mm-Schale wieder platziert, die in der Mikroskopkammer auf der invertierten Mikroskopstufe montiert ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
5. Leitung der Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Legen Sie die 35 mm Schale in den Petrischalenhalter, so dass sie sich im Laufe des Experiments nicht bewegt. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl (1.518 Brechungsindex) auf das Objektiv sowie den Boden der 35 mm Schale.</li>
	<li>Montieren Sie den Halter auf die Bühne des invertierten Mikroskops in der Mikroskopkammer.</li>
	<li>Richten Sie die Optionen in der Mikroskopsteuerungssoftware ein, um mehrere Bilder an mehreren Bühnenpositionen im Laufe der Zeit zu sammeln.<ol>
<li>Stellen Sie die Vergrößerung (100x) und die polychrome Linse (GFP/mCherry) ein. Mit einem Eyepiece und Brightfield (BF) finden Sie die Brennebene und öffnen Sie den Punktlisten-Manager.</li>
		<li>Wählen Sie mindestens 10 Sehenswürdigkeiten aus, indem Sie die Bühne verschieben und die Koordinaten für jede Position in der Mikroskopsoftware speichern, indem Sie auf die Schaltfläche Punkt markieren klicken. Vermeiden Sie Positionen in der Nähe von einander, um Photobleichungen und Phototoxizität zu verhindern. Drehen Sie das Kameraventil vom Okular auf den Monitor und kalibrieren Sie jeden Punkt, indem Sie die Fokusebene einstellen und im Punktlisten-Manager auf die Schaltfläche Punkt ersetzen klicken.</li>
		<li>Öffnen Sie den Experiment-Designer, und legen Sie alle experimentellen Parameter auf jeder Registerkarte wie folgt fest:<ol>
<li>Deaktivieren Sie die Z-Stapelbox.</li>
			<li>Wählen Sie Fluoreszenzkanäle und stellen Sie die optimalen Beleuchtungseinstellungen ein. Hier wurden folgende Einstellungen verwendet: für den mCherry-Kanal, mCherry Filtersätze (EX575/25; EM625/45), 50% Intensität und 200 ms Expositionszeit; für den GFP-Kanal, GFP-Filtersatz (EX475/28; EM525/48), 50% Intensität und 80 ms; und für die BF-Bilder, POL-Kanal, 5% Intensität und 50 ms.</li>
			<li>Wählen Sie Intervalle zwischen dem Erfassen von Bildern und der Gesamtzeit des Experiments aus. Hier wurden 5 min Intervalle über den 10 h-Zeitraum des Experiments durchgeführt.</li>
			<li>Aktivieren Sie die Fokuspflege für die gewählten Positionen (für das hier verwendete System, indem Sie das Kontrollkästchen Fokus beibehalten mit UltimateFocus markieren).</li>
			<li>Wählen Sie den Datenordner aus, in dem die Bilddateien automatisch gespeichert werden sollen.</li>
			<li>Überprüfen Sie alle Einstellungen in der Steuerung der Mikroskopsoftware, und starten Sie dann das Zeitrafferexperiment.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie nach der ersten Stunde des Experiments, ob alle Bühnenpositionen noch im Fokus stehen. Passen Sie den Fokus in Zeitintervallen zwischen der Bildaufnahme an, falls erforderlich.</li>
	<li>Wenn das Zeitrafferexperiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Petrischale und verwenden Sie die 35 mm Schale mit einem Agarose-Pad nach dem Biosicherheitsprotokoll. HINWEIS: Alle Unterschritte nach Schritt 5.2 sind spezifisch für DeltaVision Elite-Benutzer. Forscher, die andere Systeme verwenden, müssen die Einstellungen an die einzelnen Systeme anpassen.</li>
</ol>6. Verarbeitung von Zeitrafferbildern und Generierung von Filmen mit Fidschi-Software
<ol><li>Übertragen Sie experimentelle Daten auf einen Computer, der mit der Fidschi-Software geladen ist. Starten Sie das Fidschi-Programm und öffnen Sie ein Bild mit Datei | Öffnen Sie oder indem Sie einfach die Bilddatei nach Fidschi ziehen und ablegen.</li>
	<li>Wählen Sie in denOptionen für die Stapelanzeige die Option Stapel mit Hyperstack anzeigen aus, klicken Sie in den Farboptionen auf Composite, und markieren Sie Autoscale.</li>
	<li>Beurteilen Sie durch einen Bildlauf durch die Bildstapel, ob die Zellen und Bdelloplaste im Laufe des Experiments im Fokus blieben. Prüfen Sie, ob grüne fluoreszierende Flecken von DnaN-mNeonGreen innerhalb von B. bakteriovorus Zellen in Bdelloplasten während der wachstumsphase vorhanden sind, und stellen Sie sicher, dass alle Stadien des raubtierlichen Lebenszyklus visualisiert werden können.</li>
	<li>Um eine bestimmte B. bakteriovorus Zelle/Bdelloplast zu analysieren, markieren Sie sie mit den Auswahlwerkzeugen im Fidschi-Menü (Rechteck, Oval , Polygon oder Freihand). Duplizieren der ausgewählten Region mithilfe von Image | Duplizieren oder mit Strg + Umschalt + D.</li>
	<li>Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für jeden Fluoreszenzkanal wie folgt an:<ol>
<li>Um einen einzelnen Kanal auszuwählen, öffnen Sie Channel-Tools, indem Sie auf Bild | Farbe | Kanäle Werkzeuge oder Strg + Shift + Z, und wählen Sie den Kanal von Interesse (Kanal 1: mCherry, Kanal 2: mNeonGreen, Kanal 3: hellfeld).</li>
		<li>Anpassen der Helligkeit und des Kontrasts von Bildern im Fluoreszenzkanal, indem Sie das B&amp;C-Menü in Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast oder durch Klicken auf Strg + Umschalt + C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hinzufügen einer Maßstabsleiste mithilfe von Analyze | Werkzeuge | Skalenleiste. Fügen Sie den Zeitstempel zu den Bildern hinzu, indem Sie auf Bilder | Stapel | Zeit-Stempel.</li>
	<li>Um geänderte Bilder zu speichern, gehen Sie zu Datei | Speichern Sie unter, und wählen Sie TIFF, um es als Bildsequenz zu speichern, AVI, um einen Film zu erstellen, oder PNG, um ein einzelnes Bild des aktuellen Frames zu speichern.</li>
</ol>

<ol><li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li>
<li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predatory+Patchwork%3A+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbial+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li>
<li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadowing+the+actions+of+a+predator%3A+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li>
<li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Aufgrund des gestiegenen Interesses an der Verwendung von B. bacteriovorus als lebendes Antibiotikum sind neue Werkzeuge zur Beobachtung des raubtierlichen Lebenszyklus, insbesondere raubtier-pathogene Wechselwirkungen, erforderlich. Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um den gesamten B. bakteriovorus Lebenszyklus zu verfolgen, vor allem während seines Wachstums innerhalb des Hosts, in Echtzeit. Darüber hinaus ermöglichte die Anwendung eines Stammes, der fluoreszierend getaggte Betaklemme des DNA...

Bdellovibrio bacteriovorus ist ein kleines (0,3–0,5 m x 0,5–1,4 m) gramnegatives Bakterium, das andere gramnegative Bakterien, einschließlich schädlicher Krankheitserreger wie Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, und Shigella flexneri1,2,3,beutet. Da B. bacteriovorus Krankheitserreger abtötet, gilt es als ein potenzielles lebendes Antibiotikum, das zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt werden kann, insbesondere solche, die durch multiresistente Stämme verursacht werden.
B. bacteriovorus weist einen besonderen Lebenszyklus auf, der aus zwei Phasen besteht: einer frei lebenden nicht-replikativen Angriffsphase und einer intrazellulären Reproduktionsphase (Abbildung 1). In der Freilebphase sucht dieses hochmotile Bakterium, das sich mit Geschwindigkeiten von bis zu 160 m/s bewegt, nach seiner Beute. Nach der Befestigung an der äußeren Membran der Beute gelangt es in das Periplasma4,5. Während der interperiplasmischen Fortpflanzungsphase verwendet B. bacteriovorus eine Fülle hydrolytischer Enzyme, um die Makromoleküle des Wirts zu degradieren und für sein eigenes Wachstum wiederzuverwenden. Bald nach dem Eindringen in das Periplasma stirbt die Wirtszelle und bläht sich in eine kugelförmige Struktur namens Bdelloplast, in der sich die Raubzelle längt und ihre Chromosomen repliziert. Der Replikationsprozess beginnt am Replikationsursprung (oriC)6 und geht weiter, bis mehrere Kopien des Chromosoms vollständig synthetisiert wurden7. Interessanterweise folgt der Replikation jedes Chromosoms nicht die Zellteilung. Stattdessen erlänget sich das Raubtier zu einer langen, multinukleoiden und fadenförmigen Zelle. Bei Nährstoffmangel wird das Filament einer synchronen Septation unterzogen und Diegenzellen werden aus dem Bdelloplast8freigesetzt.
Bevor B. bacteriovorus als lebendes Antibiotikum gegen bakterielle Infektionen verwendet werden kann, ist es entscheidend, die wichtigsten Stadien seines Lebenszyklus zu verstehen, insbesondere diejenigen, die mit seiner Proliferation innerhalb der Beute zusammenhängen. Die Live-Zell-Bildgebung von B. bacteriovorus war aufgrund der verschiedenen morphologischen Formen des Raubtiers und seiner Beute während des komplexen Lebenszyklus eine Herausforderung. Bisher wurden die Wechselwirkungen zwischen B. bacteriovorus und seiner Wirtszelle hauptsächlich durch Elektronenmikroskopie und Schnappschussanalyse2,9,10untersucht, die beide Einschränkungen haben, insbesondere wenn sie verwendet werden, um aufeinanderfolgende Stadien des räuberischen Lebenszyklus zu überwachen. Diese Methoden liefern hochauflösende Bilder von B. bakteriovorus Zellen und ermöglichen die Beobachtung eines kleinen Raubtiers während der Angriffs- oder Wachstumsphase. Sie erlauben jedoch keine Verfolgung einzelner B. bakteriovorer Zellen während der beiden Lebenszyklusphasen.
Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Verwendung der Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie (TLFM) zur Überwachung des gesamten Lebenszyklus von B. bakteriovorusvorgestellt. Ein System, das aus einem Agarose-Pad besteht, wird in Kombination mit einer Zellbildschale verwendet, bei der sich die Raubzellen frei unter dem Agarose-Pad bewegen können, während die immobilisierten Beutezellen Inderoplasten bilden können (Abbildung 2). Diese Einrichtung wird auf der Grundlage spezifischer Stämme von E. coli und B. bacteriovoruserstellt, aber das Protokoll kann leicht an die individuellen Stämme eines Benutzers anpassen (z. B. mit verschiedenen Selektionsmarkern, Proteinen, die mit verschiedenen Fluorophoren verschmolzen sind usw.).
In diesem Fall wurde zur Visualisierung von B. bacteriovorus während der Angriffsphase ein spezifischer Stamm (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) konstruiert, der eine fluoreszierend markierte Version des zytoplasmischen Proteins PilZ (verfügbar in unserem Labor auf Anfrage)ausdrückt 7. Dieser Stamm produziert zusätzlich DnaN (die Schiebeklemme), eine Untereinheit des DNA-Polymerase-III-Holoenzyms, die mit einem fluoreszierenden Protein verschmolzen wird. Dies ermöglicht die überwachung der kontinuierlichen DNA-Replikation innerhalb der Raubzellen, während sie innerhalb von Bdelloplasten wachsen.
Obwohl sich das beschriebene Protokoll und die für die Bildaufnahme verwendete Software auf ein invertiertes Mikroskop beziehen, das von einem bestimmten Hersteller bereitgestellt wird (siehe Tabelle der Materialien), kann diese Technik für jedes invertierte Mikroskop angepasst werden, das mit einer Umweltkammer oder einem anderen externen Heizhalter ausgestattet ist und zeitraffiver abbilden kann. Für die Datenanalyse können Benutzer jede verfügbare Software auswählen, die mit den einzelnen Ausgabeformaten kompatibel ist.
<img alt="Lebenszyklusdiagramm von Bdellovibrio; Anfalls- und Fortpflanzungsphasen; bakterieller Invasionsprozess." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: B. bakteriovorus Lebenszyklus in E. coli als Wirtszelle. Während der Angriffsphase sucht eine freischwimmende B. bakteriovore Zelle nach einer E. coli-Wirtszelle und heftet sie an. Nach der Invasion wird die Raubzelle im Periplasma der Beute lokalisiert, verändert die Form der Wirtszelle und bildet einen Bdelloplast. Die Fortpflanzungsphase beginnt mit der Bdelloplastbildung. Die Raubzelle verdaut die Beutezelle und verwendet einfache Verbindungen, um ihre eigenen Strukturen aufzubauen. B. bacteriovorus wächst als ein langes einzelnes Filament im Periplasma des Wirts. Wenn die Ressourcen der Beutezelle erschöpft sind, septiert das B. bakteriovorus Filament synchron und bildet Nachkommenzellen. Nachdem die Nachkommenzellen ihre Flagella entwickeln, lysieren sie den Bdelloplast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>Zentrifuge</td><td>MPW MED. INSTRUMENTS</td><td>MPW-260R</td><td>Rotor ref. 12183</td></tr><tr><td>CertifiedMolecular Biology Agarose</td><td>BIO-RAD</td><td>161-3100</td><td>Agarose mit niedriger Fluoreszenz für Agarose-Pad</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>Open-Source-Bildverarbeitungspaket</td></tr><tr><td>Glasbodenschale 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81218-200</td><td>unbeschichtetes Glas</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Mikrotitertisch, Ultimate Focus Lasermodul, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI-Baugruppe FP DV, Kit obj. Oly 100x Öl 1,4 NA, Prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td></tr><tr><td>Minisart Filter 0,45 &micro; m</td><td>Sartorius</td><td>16555----------K</td><td>Celluloseacetat, steril, Luer-Lock-Ausgang</td></tr><tr><td>Start SoftWoRx</td><td>GE</td><td></td><td>Vom Hersteller bereitgestellte Bildgebungssoftware</td></tr></tbody></table>

live-cell imaging des lebenszyklus des bakteriellen raubtiers bdellovibrio bacteriovorus mittels time-lapse fluoreszenzmikroskopie

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus ist ein kleines gramnegatives, obligates Raubbakterium, das andere gramnegative Bakterien abtötet, einschließlich schädlicher Krankheitserreger. Daher gilt es als ein lebendes Antibiotikum. Um B. bakteriovorus als lebendes Antibiotikum anzuwenden, ist es zunächst notwendig, die wichtigsten Stadien seines komplexen Lebenszyklus zu verstehen, insbesondere seine Proliferation in der Beute. Bisher war es schwierig, aufeinanderfolgende Phasen des raubtieren Lebenszyklus in Echtzeit zu überwachen. Präsentiert hier ist ein umfassendes Protokoll für die Echtzeit-Bildgebung des gesamten Lebenszyklus von B. bacteriovorus, vor allem während seines Wachstums innerhalb des Wirts. Dazu wird ein System aus einem Agarose-Pad in Kombination mit zellbildenden Schalen eingesetzt, bei denen sich die Raubzellen frei unter dem Agarose-Pad bewegen können, während immobilisierte Beutezellen Bdelloplasten bilden können. Die Anwendung eines Stammes, der eine fluoreszierend markierte Untereinheit der DNA-Polymerase III erzeugt, ermöglicht ferner die Überwachung der Chromosomenreplikation während der Reproduktionsphase des B. bakteriovorus Lebenszyklus.

Das beschriebene TLFM-basierte System ermöglicht die rechtzeitige Verfolgung einzelner Zellen vonB. bakteriovorus (Abbildung 3, Film 1) und liefert wertvolle Informationen über jede Phase des komplexen Raublebenszyklus. Die PilZ-mCherry-Fusion ermöglicht die Kennzeichnung der gesamten Raubzelle in der Angriffsphase sowie der frühen Phase der Wachstumsphase (Abbildung 3). Der Übergang von der Angriffs- zur Replikphase wurde nicht nur dur...

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Überwachung des gesamten Lebenszyklus des raubtierlichen Bakteriums Bdellovibrio bacteriovorus mittels Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie in Kombination mit einem Agarosepad und zellbildenden Gerichten beschreibt.

Live-Cell Imaging des Lebenszyklus des bakteriellen Raubtiers Bdellovibrio bacteriovorus mittels Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

Live-Cell Bdellovibrio bacteriovorus Bildgebung war aufgrund des komplexen Lebenszyklus dieser räuberischen Bakterien herausfordernd. Unser Protokoll ermöglicht die Überwachung der Phasen des gesamten Lebenszyklus in Echtzeit. Obwohl unser Protokoll auf einer spezifischen Ausgleichsstämme basiert, kann es leicht an eine Vielzahl von Bakterienstämmen angepasst werden, einschließlich pathogener Stämme.Um eine B.bacteriovorus Kultur zu schaffen, kombinieren Sie einen Milliliter frischer 24-Stunden-Kulturbakterien mit drei Millilitern über Nacht-Beutekultur in einem 250-Milliliter-Kolben mit 50 MilliliterCalcium-Hippies, die bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt werden. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute überprüfen Sie, ob die Beutezellen vollständig durch eine flüssigkeitsmontierte Gesichtskontrastmikroskopie lysiert wurden. Zahlreiche multi-attackierte b.bacteriovorus Zellen sollten vorhanden sein und keine E.coli-Zelle oder Bdelloplast sollte sichtbar sein.Die B.bacteriovorus Kultur durch einen 0,45 Mikrometer Poren-Filter in ein 50 Milliliter konisches Rohr abseihen und das Filtrat in einer Zentrifuge aussetzen. Dann setzen Sie das B.bacteriovorus Pellet in drei Milliliter Calcium Hippies auf eine endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,2 zurück und bebrüten die Bakterien bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten. Um die Wirtszellen vorzubereiten, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem Wirtsstamm von Interesse und die Bakterien in 10 Milliliter YT Medium ergänzt mit Antibiotika, wie für eine Nacht inkubation bei 37 Grad Celsius und 180 Umdrehungen pro Minute ergänzt.Am nächsten Morgen zwei Milliliter der Nachtkultur in ein Zwei-Milliliter-Reagenzglas übertragen und die Zellen per Zentrifugation pellet. Dann das Pellet in 200 Mikroliter Kalzium Hippies Puffer wieder aussetzen. Es ist sehr wichtig, das gesamte Zellpellet nach der Zentrifugation vollständig wieder aufzuhängen, um sicherzustellen, dass die Beutezelle auf einzelzeller Ebene getrennt ist.Um die Zellen auf die Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, mischen Sie zunächst 200 Milligramm niedrigfluoreszierende molekulare Agarose mit 20 Milliliter Calcium-Hippies Puffer und lösen Sie die Agarose in einer Mikrowelle auf. Gießen Sie drei Milliliter der geschmolzenen Agarose in eine 35-Millimeter-Glasbodenschale und lassen Sie die Agarose erstarren. Mit einem Labor-Mikrospachtel, vorsichtig entfernen Sie das Agarose-Pad aus der Schale, ohne den Mittelpol des Pads zu stören und legen Sie das Pad unten auf einer Petrischale Abdeckung.Legen Sie fünf Mikroliter der konzentrierten Wirtszellsuspension auf das gekippte Pad und verwenden Sie eine Impfschleife, um Zellen im Mittelpol zu verteilen. Als nächstes fünf Mikroliter der konzentrierten B.bacteriovorus Suspension auf die wirtzellbeschichtete Oberfläche geben, ohne sich auszubreiten, und das Gel schnell auf die 35 Milliliter Glasbodenschale oben nach unten zurückgeben. Dann die Schale mit einem Deckel bedecken.Für die Zeit-Lapse Florescence Mikroskopie der Co-Kultur, legen Sie die Schale in einem Petri Schale Halter, so dass die Schale nicht im Laufe des Experiments bewegen und legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das invertierte Mikroskop Objektiv und einen Tropfen auf dem Boden der Schale. Montieren Sie den Halter auf die Mikroskopstufe innerhalb der invertierten Mikroskopkammer und stellen Sie in der Mikroskopsoftware die Vergrößerung auf 100X und die Polychromlinse auf GFP und Mcherry ein. Suchen Sie mit einem iPS in Brightfield die Fokusebene, und öffnen Sie den sinnlosen Manager.Bewegen Sie die Bühne, und verwenden Sie die Schaltfläche Markierungspunkte, um die Koordinaten von mindestens 10 Sehenswürdigkeiten zu speichern. Schalten Sie das Kameraval vom iPS auf den Monitor. Legen Sie die Fokusebene fest, und klicken Sie auf die Schaltfläche Punkt ersetzen im Punkt ohne Zu-Manager, um jeden Punkt zu kalibrieren.Öffnen Sie den Experimentdesigner, und entmarkieren Sie die Stapelbox für Krankheiten. Wählen Sie die entsprechenden Fluoreszenzkanäle und die optimalen Eliminationseinstellungen aus und legen Sie die Intervalle zwischen der Bildaufnahme und der Gesamtzeit des Experiments fest. Aktivieren Sie die Fokuspflege für die ausgewählten Positionen, und wählen Sie den Datenordner aus, in dem die Bilddateien automatisch gespeichert werden sollen.Überprüfen Sie alle Einstellungen in der Steuerung der Mikroskopsoftware und starten Sie das Zeitrafferexperiment. Überprüfen Sie nach der ersten Stunde des Experiments, ob alle Bühnenpositionen noch im Fokus stehen. Wenn das Zeitrafferexperiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Petrischale und entsorgen Sie die 35-Millimeter-Schale mit einem Agarose-Pad nach den entsprechenden Biosicherheitsprotokollen.Für die Verarbeitung der Zeitraffer-Bilddaten, übertragen Sie die experimentellen Daten auf einen Computer mit der Fidschi-Software geladen und öffnen Sie ein Bild in Fidschi. Wählen Sie in Importoptionen für Bioformate den Ansichtsstapel mit Hyperstack aus. Wählen Sie im zusammengesetzten Farbmodus die automatische Skalierung aus.Durch scrollen Sie durch die Bildstapel beurteilen, ob die Zellen und Bdelloplaste im Laufe des Experiments im Fokus blieben. Ob die grünen Fluoreszenzflecken aus der DNA und mNeongrün innerhalb der B.bacteriovorus-Zellen innerhalb der Bdelloplasten während der Wachstumsphase vorhanden sind und ob alle Stadien des Raublebenszyklus visualisiert werden können. Um eine bestimmte B.bacteriovorus Zelle Bdelloplast zu analysieren, verwenden Sie ein Auswahlwerkzeug, um die Zelle von Interesse zu markieren.Duplizieren Sie dann die ausgewählte Region. Klicken Sie im duplizierten Bild auf Prozess und glatt, und klicken Sie für jeden Fluoreszenzkanal auf Bild, Farbe, Kanäle, und wählen Sie den kanal von Interesse aus. Klicken Sie dann auf Bild, Anpassen und Helligkeitskontrast, um die Helligkeit und den Kontrast des Bildes in jedem Kanal anzupassen.Um eine Maßstabsleiste hinzuzufügen, wählen Sie Analysieren, Werkzeuge und Maßstabsleisten aus. Um den Bildern einen Zeitstempel hinzuzufügen, klicken Sie auf Bilder, Stapel und Zeitstempel. Um die geänderten Bilder zu speichern, wählen Sie TIF aus.Um die Daten als Bildsequenz zu speichern, AVI, um einen Film zu erstellen, oder PNG, um ein einzelnes Bild des aktuellen Frames zu speichern. Dieses auf Zeitraffer fluoreszenzbasierte System ermöglicht die Echtzeitverfolgung einzelner B.bacteriovorus Zellen und liefert wertvolle Informationen über jede Phase des komplexen Raublebenszyklus. Die pillenige mCherry-Fusion ermöglicht es, die gesamte Raubzelle sowohl in der Angriffsphase als auch in der frühen Phase der Wachstumsphase zu kennzeichnen.Der Übergang vom Angriff in die replikierende Phase kann nicht nur durch die Host-Bdelloplast-Formation, sondern auch durch das Auftreten des Replisomen visualisiert werden. Das Replisome wird am eindringenden Zellpol montiert und mehr als ein Replisome kann innerhalb eines wachsenden B.bacteriovorus Filaments beobachtet werden, während die Reproduktionsphase fortschreitet. Nachdem mehrere Kopien des Chromosoms synthetisiert wurden, wird die Replikation beendet.Schließlich wird das mehrkernige Filament septiert und die Vorläuferzellen aus dem Bdelloplast freigesetzt. Die B.bacteriovorus Zellen sollten material genug sein, um aktiv nach ihrer Beute zu suchen, und die gesamte Zelldichte sollte hoch genug sein, um eine räuberische Zellanhaftung zu ermöglichen. Diese Plattform kann in Experimenten mit multiresistenten Krankheitserregern nützlich sein und Verbesserungen in der Gentechnik des B.bacteriovorus als lebendes Antibiotikum in der Human- und Veterinärmedizin erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Live-Cell Imaging des Lebenszyklus des bakteriellen Raubtiers Bdellovibrio bacteriovorus mittels Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Live-Cell Imaging des Lebenszyklus des bakteriellen Raubtiers Bdellovibrio bacteriovorus mittels Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie

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